46 感 染 症学 雑 誌 第50巻 第2号 腸 炎 ビ ブ リオ 感 染 患 者 血 清 中 のthermostable direct hemolysinに 対 す る抗 体 価 大阪大学微生物病研究所細菌血清学部 三 輪谷 俊夫 桜 井 純 竹田 美文 大阪市立桃山病院 杉 山 茂 彦 Key words: Anti-hemolysin 緒 立 利 幸 titer, Vibrio parahaemolyticus リ ウ ム,5g;ブ 言 食 中毒 に つ い て の厚 生 省 の年 次 統 計 に よ る と, そ の30%近 足 くが 原 因物 質 が 不 明 で あ り1)2),食 中 ドウ 糖,5g;蒸 ml;pH7.6-7.8)を 培 養 し,遠 上 清100ml当 る.わ が 国 の細 菌 性食 中 毒 に お け る腸 炎 ビ ブ リオ 遠 心 に よ つ て 沈 澱 を 集 め る.少 の 重 要 性3)4)に鑑 み,し 緩 衝 液(pH7.0)に 炎 ビ ブ リオ食 中 沈 澱 を 溶 解 し,透 こ され る事 実5)か ら,神 燐 酸 緩 衝 液 で 平 衡 化 したDEAE-セ 奈 川 現 象 の原 因物 質 で あ 対す る 患者 ム(2.2×50cm)に ウ ム を 添 加 した0.01M燐 ブ リオ感 染 症 の血 清 学 的 診 断 法 と して適 用 で き る よ く洗 う.そ リ ウ ム 添 加0.01M燐 され た 抗 溶 血 毒 因 子 の測 定 法 に 改 良 を 加 え,50% てlinear 溶 血 法 に よつ て,よ 毒 素 は,塩 り鋭 敏 な 抗溶 血 毒 因子 の定 量 的 測 定法 を 考 案 した.こ の50%溶 血 法 を用 い,疑 似 赤 痢 の疑 い で 大 阪 市 立桃 山病 院 に 入院 した腸 炎 ビ ブ リオ患 者 の うち,ペ ア ー血 清 が採 取 で きた51 ル ロー ス カ ラ 酸 緩 衝 液500mlず gradient elutionを 行 な う.大 化 ナ ト リ ウ ム0.35-0.5Mの 溶 出 して く る.溶 化 ナ トリ よ び1.0M塩 化ナ ト つ を 用 い 部 分 の溶 血 と ころ に 血 毒 活 性 画 分 を 集 め て 濃 縮 し, 塩 化 ナ ト リ ウ ム を 終 末0.9%に る.本 析 して硫 酸 緩 衝 液 約1,000mlで の 後,0.2Mお か ど うか を検 討 した.先 に 加藤 ら6)に よつ て 報 告 酸 の 粗 溶 血 毒 を0.01M 吸 着 さ せ,0…2M塩 血 清 中 の抗 体 価(抗 溶 血 毒 因 子)の 測 定 が,腸 炎 ビ 加 え, 量 の0.01M燐 酸 ア ン モ ニ ウ ム を 除 く.こ direct hemolysinに 集 め る. り硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム35.19を 毒 の ほ とん どが 神 奈 川 現 象陽 性 株 に よつ て 引 き起 るthermostable 間振 盪 心 上 清(8,000rpm,30分)を 毒 事 件 にお け る原 因 物 質 追 求 の 困 難 さが うか が え か も,腸 留 水,1,000 用 い,37℃,18時 な る よ うに調 製 す 溶 血 毒 素 の 高 純 度 精 製 法 を,わ れわ れ はす 例(昭 和44年 一49年),及 び対 照 と して阪 大 微 生 物 で に 報 告 し て い る9)10)が,予 病 研 究 会 検 査 部 に提 出 さ れた 健 康 人201検 純 度 精 製 標 品 と部 分 的 精 製 標 品 を 用 い て 行 な つ た 月101検 体,2月100検 体(6 体)に つ い て,抗 溶 血 毒 因 子 の定 量 を行 なつ た 結 果 につ い て 報 告 す る. 材 料 お よ び方 法 1.Thermostable direct hemolysin(以 た の で,本 下溶 血 研 究 では 部 分 的 精 製 標 品 を 溶 血 毒 原 液 2.希 釈液 す べ て0.9%塩 溶 血 毒 の 分離 と精製 は,す で に報 告 した方 法7)8) 炎 ビブ リオWP-1株(神 酸 第2ナ 衝 液(pH7.0)を 3.50%溶 奈 川 現 象 陽 性 株)を 溶 血 毒 産 生 培 地(塩 化 ナ トリ ウム,309;Bacto-pepton,10g;燐 明 な差 異 を 認 め な か つ と し て 用 い た. 毒 と略 称)の 部分 的 精製 に準 じて 行 な つ た.腸 抗 溶 血 毒 因 子 測 定 値 に,著 備 実 験 に お い て,高 ト (i)50%溶 化 ナ ト リ ウ ム添 加0.01M燐 酸緩 用 い た. 血 法 に よる抗 溶 血 毒 因 子 の測 定 法 血 単 位 の測 定 溶 血 毒 原 液0.5mlの 倍 々 希 釈 系 列 を 作 る.各 47 昭 和51年2月20日 希 釈 系 列 に0.1mlず %ヒ ト0型 0.5mlず つ 希 釈 液 を 加 え,さ 槽 中 で2時 間反応 水 槽 中 に て30分 間 放 置 す る. 清 の お け る吸光 度 を コ ール マ ン ジ ュ ニ ァ ー ml)0.5mlを 間 遠 心 後,上 7)再 型 光 電 比 色 計 に て 測 定 す る. 図1に 5)37℃ 6)1.2%ヒ さ せ た 後,3,000rpm血,10分 溶 血 毒 原 液 の 溶 血 活 性 を 測 定 した1例 示 す.図1の 場 合,50%溶 定 直 前 に調 整 した 溶 血 毒 を0.5mlず つ 各 々の管 に加 え て よ く混 和 す る. 新 鮮 洗 源 血 球 液(1×108コ/ml)を つ 添 加 す る.370C水 540nmに 整 す る.測 ら に1.2 を 血 を示 す値 は厳 密 に言 2-3回 トO型 新鮮 洗源 血球 液(1×108コ/ 各 管 に加 え て混 和 す る. び37℃ 水 槽 中 に て2時 間 放 置 す る.途 中 手 で よ く振 盪 す る. 8)3,000rpm,10分 間 遠 心 し,上 清 の540nm に お け る吸 光 度 を コ ール マ ンジ ュニ ア型 光 電 比 色 Fig. 1. of the Determination crude of hemolysin the used hemolytic in the activity 計 を 用 い て測 定 す る. study. 9)判 C2(溶 定:対 照 と してC1(血 球 浮 遊 液 の み), 血 毒2単 位 と血 球 液)を 測 定 ご とに必 ず お き,C1お よびC2の 遠 心 上 清 のA540の 和 の 1/2以下 のA540を 示 す も のを ,溶 血 阻 止(+)と 判 定 し,溶 血 阻 止(+)を 示 した血 清 の最 大 希 釈 倍 数 を もつ て 溶 血 阻 止 単 位 とす る. 実 験 成績 1.健 康 人対 照群 に お け る抗溶 血 毒 因子 の測 定 健 康 人 対 照 群 と して は,梅 えば128倍-256倍 に,昭 和47年2月 の希 釈 の中 間 で あ るが,128 と同年6月 毒血清検査 の た め に提 出 され た 同一 会 倍 希 釈 を1溶 血 単 位 と決 め る.患 者 血 清 中 の抗 溶 社 勤 務 者 集 団 の 凍 結 保 存(-25℃)血 血 毒 因 子 測 定 には,反 応 液 中 に2溶 血 単 位 を 入 れ 測 定 した. る.こ の た め,図1の 希 釈 液0.5ml中 場 合 に は溶 血 毒 原 液 の64倍 に2溶 血 単 位 の 溶 血 毒 が 含 ま れ 2月 に 提 出 され た もの100例 希 釈 陽 性 者3例,20倍 に つ い て は,10倍 希 釈 陽 性者1例 月 に 提 出 され た もの101例 て い る こ とにな り,ほ ぼ 完全 溶 血 を お こす. 清 について で あ り,6 に つ い て は,10倍 希 釈 陽 性 者1例 の み で,他 は すべ て陰 性 で あつ た.こ (ii)患 者 血 清 中 の抗 溶 血 毒 因 子 測定 法 健 康 人 対 照 群 に お い て は,実 験 結 果 の項 に示 す の よ うに健 康 対 照 群 で は,い ず れ も20倍 希 釈 以 上 が の 希 釈 で 陽 性 者 が い な か つ た た め,腸 炎 ビ ブ リオ 20倍 希 釈 で 陽 性 を 示 した に す ぎな か つ た.従 つ 感 染 患 者 に つ い て は,血 清 の 最 少希 釈倍 数 を20倍 て,腸 炎 ビブ リオ患 者 血 清 に つ い て は,最 少血 清 と して測 定 した. ご と く,201例 中4例 が10倍 希 釈 で陽 性,1例 希 釈 倍 数 を10倍(終 末20倍)と して測定 した.測 集 反 応 用 小 試 験 管 を 被 検 血 清 ご とに6本 目の管 には,非 働 化 した 被 検 血 清0.2 mlと 希 釈 液1.8mlを 2)2本 用 いて 被 倍 々希 釈 す る. 項 に記 した 要 領 に て力 価 を 測 定 した溶 血 毒 原 液 を,0.5ml中 され た 患 者 の うち,ペ の うち,第5病 入 れ る. 目以 下 は,希 釈 液1.0mlを 検 血 清1.0mlを 4)前 疑 似 赤 痢 の疑 い で大 阪 市 立桃 山病 院 に 入院 し, 細 菌培 養 検 査 に よつ て腸 炎 ビ ブ リオ 感 染症 と診 断 並 べ る. 2)1本 炎 ビ ブ リオ患 者 血 清 中 の抗 溶 血 毒 因子 の 測定 定 方 法 の概 略 は次 の通 りで あ る. 1)凝 2.腸 に2溶 血 単 位 含 む よ うに 調 ア ー血 清 が 採取 で きた51例 日(入 院 後 の 日数)ま 清 中 の抗 溶 血 毒 因 子 は,1例 で の 採取 血 の例外を除いてすべ て20倍 希 釈 で 陰 性 で あ つ た.抗 溶 血 清 因 子 の値 が 上 昇 を 示 さな か つ た 症 例,お 認 め た 症 例 を1例 ず つ,図2お よび 明 らか に上 昇 を よ び 図3に 示 し 48 感 染 症学 雑 誌 第50巻 Fig. 2. Changes patient Symbols 1st show day; •¢, day;•›, sed of during by the of after Values titer the the day; •›, day. reciprocal anti-hemolysin course day 5th 22nd the the a Fig. admission:•œ 10th in in disease(1). are 14th of during the 1st expres- show day; •¢, day; •›, values. sed た. 第6病 Changes Symbols day;•¢, abscissa 3. patient 25th by reciprocal the anti-hemolysin course the day 6th day; •›, day. of after Values in 第2号 titer the in a disease(2). the admission:•œ, 11th day; •£, abscissa are 17th expres- values. れ なか っ た. 日以 後 まで 血 清 を 採取 で きた33例 の うち 17例 で は,明 らか に 抗溶 血 毒 因子 の 力価 上 昇 が 観 察 で きた.図4に 第2病 日か ら,す で に抗 溶 血 毒 因 子 の値 が80倍 希 釈 に ま で上 昇 して い た例 外 の1症 例(図6)で は,他 の症 例 に先 が け て第27病 日 目です でに20倍 全 症 例 の 力価 の分 布 を,図5に 力価 の上 昇 を示 した 代 表 例11例 の力 価 の変 動 を 示 希 釈 以 下 に ま で下 降 してい る点 か ら,詳 細 な検 討 した.し か し,抗 溶 血 毒 因 子 の力 価 の上 昇 と,検 は な され て い な い が,入 院 以前 か ら腸 炎 ビ ブ リオ 出 され た 腸 炎 ビブ リオ の 抗 原 型 や症 状 の 強 弱(細 に よ る腸 管 感 染 が成 立 して い た の で は な い か と推 菌 性 赤 痢 の病 状 の 強 弱 判定 法 に準 じ,ス コア ー点 察 され る. 数 に よつ て判 定)と Fig. 4. の間 には,相 関 関 係 は認 め ら Distribution of anti-hemolysin due to V. parahaemolyticus. titers 患 者 血 清 中 の抗 溶 血 毒 因 子 が 抗 体 で あ るか ど う in the sera of patients with food poisoning 49 昭 和51年2月20日 Fig. 5. Changes of anti-hemolysin titers in the serum during food poisoning par ahaemolyticus. Eleven typical cases which showed increase of anti-hemolysin shown. A total of 33 cases were examined and 16 cases showed no increase hemolysin titer. Fig. 6. Changes patient Symbols 2nd show day; day; •›, sed of during by the 6th 27th reciprocal the the day. anti-hemolysin course day of after the day; •›, 11th Values in titer the in a due to V. titer are of anti- 現 象 陽 性 株 に よつ て惹 起 され る5)11).神 奈 川 現 象 起 因物 質 と して耐 熱 性 溶 血 毒 が 報 告 され12),本 物 disease(3). admission:•œ, day; •£, abscissa are 18th expres- values. 質 が神 奈 川 現 象 陽 性 株 に は存 在 す るが,神 奈 川 現 象 陰 性 株 に は存 在 しな い こ とが 明 らか にな り13), 本 物質 が腸 炎 ビ ブ リオ に よ る胃腸 炎 と密 接 な関 連 が あ る と推論 され て い る. 腸 炎 ビ ブ リオ患 者 血 清 中 に本 溶 血 毒 に対 す る抗 体 が存 在 す るか ど うか に つ い て は,す でに 加藤 ら6)が報 告 して い るが,本 論 文 で は,さ らに鋭 敏 な 方 法 に よ り腸 炎 ビ ブ リオ患 者 血 清 中 の抗 体 価 の推 移 を調 べ る と共 に,健 康 人 対 照 群 の抗 体 価 を201 例 につ い て調 べ た.そ の結 果,健 康 人 対 照 群 の血 清 中抗 体 価 は極 め て低 い こ とがわ か っ た.腸 炎 ビ か は,量 的 な 制 約 の た め,す べ て の陽 性 血 清 につ い て 調 べ る こ とが で きな か つ た が,160倍 性 患 者 血 清 の うち2検 体,お 希釈陽 よび ウサ ギ免 疫 血 清 を 用 い て,硫 酸 ア ンモ ニ ウ ムに よ る血 清 の分 画 を ブ リオ患 者 に お い て も,必 ず し も血 清 中 抗 体 価 が 上 昇 す る とは限 らず,ま た抗 体 価 が上 昇 して い る 場 合 に も,病 日の経 過 と共 に低 下 す る傾 向が うか が え た. 溶 血 毒 は分 子 量 約4万 の単 純 蛋 白質 で あ る こ と 試 み た結 果,溶 血毒 阻 止 活 性 は,い ず れ も γ一グ ロ ブ リン 分 画 に 一 致 して 存 在 す る こ とがわ か つ が わ か っ て い る14)15).腸管 内 で産 生 され た溶 血 毒 た. が,腸 管 粘 膜 上 皮 に作 用 して,粘 血 便 と共 に速 や か 考 察 腸 炎 ビブ リオ 感染 症 は,そ のほ とん どが 神 奈 川 に排 泄 され る こ と,そ の た め体 内 へ の移 行 が 低 い こ とに よ る こ とが,抗 溶 血 毒 因 子 の上 昇例 が半 数 50 感 染 症学 雑 誌 に しか 達 し な い こ と の 一 つ の 理 由 で あ る と推 論 で き る.し か し こ の 事 実 は,生 体 の 防 禦 反 応 の 一つ と し て 宿 主 側 に は 好 都 合 で あ る と考 え ら れ よ う. 最 近,わ れ わ れ は,本 溶 血 毒 が マ ウ ス,ラ な ど に 対 し て 強 力 な 致 死 活 性 を 有 し,微 ス1匹 当 り1∼1.5μg)の ッ ト 量(マ ウ 静 脈 内 注 射 に よ りマ ウ ス を 短 時 間(1∼ 数 分 以 内)で 弊 死 せ しめ る こ と を 見 出 した15).さ らにそ の致 死 活 性 が 特 異 的 な 心 臓 毒 性 に よ る も の で あ る こ と も 明 ら か に した 鋤. 腸 炎 ビ ブ リオ 患 者 が,し れ る よ う な 感)じ"を ば しぼ)"谷 底 に 吸 い 込 ま 訴 え る 事 実 は,溶 血毒が心臓 毒 性 を有 して い る こ とに よつ て説 明で き る と考 え られ る.腸 炎 ビ ブ リオ 感 染 症 の 致 死 率 が 比 較 的 低 い の は,溶 血 毒 が 速 や か に体 外 へ 排 出 され る こ と も 一 因 で あ る と い え よ う. 文 献 1) 厚 生 省 環 境 衛生 局 食 品 衛 生 課: 毒 発 生 状 況. 食 品衛 生 研 究, 昭 和47年 食 中 23: 昭48(1973). 2) 厚 生 省 環 境 衛 生 局 食 品 衛 生 課: 毒 発 生 状 況, 昭49(1974). 食 品衛 生 研 究, 906-919, 昭 和48年 食 中 24: 708-721, 3) Okabe, S.: Statistical review of food poisoning in Japan-especially that by Vibrio parahaemolyticus. T. Fujino, G. Sakaguchi, R. Sakazaki and Y. Takeda(ed.), International Symposium on Vibrio parahaemolyticus, Saikon Publishing Co., Tokyo, 1974, p.5-8. 4) 竹 田 美 文, 三 輪 谷 俊 夫: 世 界各 国 に お け る腸 炎 ビ ブ リ オ 食 中 毒 発 生 の 現 況, 91: 594-598, 医 学 の あ ゆ み, 昭49(1974). 5) Sakazaki, R., Tamura, K., Kato, T., Obara, Y., Yamai, S. & Hobo, K.: Studies on the enteropathogenic, facultatively halophilic bacteria, Vibrio parahaemolyticus. III. Enteropathogenicity. Jap. J. Med. Sci. Biol., 21: 325-331, 1968. 6) 加 藤 貞 治, 研 究 会 編, 小 原 寧: 溶 血 毒 抗 体, 感 染 モ デ ル の 組 み 方, 腸管感染 近 代 出 版, 昭 48(1973), p.257-266. 7) Fujino, T., Miwatani, T., Takeda, Y. & Tomaru, T.: A thermolabile direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus. Biken J., 12: 145-148, 1969. 8) Miwatani, T., Sakurai, J., Yoshihara, A. & 第50巻 第2号 Takeda, Y.: Isolation and partial purification of thermolablie direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus. Biken J., 15: 61-66, 1972. 9) Sakurai, J., Matsuzaki, A. & Miwatani, T.: Purification and characterization of thermostable direct hemolysin of Vibrioparahaemolyticus. Infect. Immunity., 8: 775-780, 1973. 10) Miwatani, T., Takeda, Y., Sakurai, J., Honda, T. & Takeda, T.: Biochemical and biological properties of thermostable direct hemolysin produced by Vibrioparahaemolyticus.Proc. 10th Joint Conference of the US-Japan Cooperative Medical Scinece Program, Cholera Panel, 1974, p.238-247. 11) Miyamoto, T., Kato, T., Obara, Y., Akiyama, S., Takizawa, K. & Yamai, S.: In vitro hemolytic characteristic of Vibrioparahaemolyticus: its close correlation with human pathogenicity. J. Bacteriol., 100: 1147-1149, 1969. 12) Nikkawa, T., Obara, Y., Yamai, S. & Miyamoto, Y.: Pufification of a hemolysin from Vibrio parahaemolyticus. Jap. J. Med. Sci. Biol., 25: 197-200, 1972. 13) Sakurai, J., Matsuzaki, A., Takeda, Y. & Miwatani, T.: Existence of two distinct hemolysins in Vibrio parahaemolyticus. Infect. Immunity, 9: 777-780, 1974. 14) Zen-Yoji, H., Kudoh, Y., Igarashi, H., Ohta, K. & Fukai, K.: Purification and identification on enteropathogenic toxins"a" and "a" produced by Vibrio parahaemolyticus and their biological and pathological activities. T. Fujino, G. Sakaguchi, R. Sakazaki and Y. Takeda(ed.), International Symposium on Vibrio parahaemolyticus, Saikon Publishing Co., Tokyo, 1974, p.237-244. 15) Honda, T., Taga, S., Takeda, T., Hasibuan, M. A., Takeda, Y. & Miwatani, T.: Identification of lethal toxin with thermostable direct hemolysin produced by Vibrio parehaemolyticus and some physicochemical properties of the purified toxin. Infect. Immunity, 13: in the press 1976. 16) Honda, T., Goshima, K., Takeda, Y., Sugino, Y. & Miwatani, T.: Demonstration of the cardiotoxicity of thermostable direct hemolysin(lethal toxin) produced by Vibrio parahemolyticus.Infect. Immunity, 13: in the press. 1976. 51 昭 和51年2月20日 Antibody titers against the thermostable direct hemolysin in sera of patients suffering from gastroenteritis due to Vibrioparahaemolyticus Toshio MIWATANI, Jun SAKURAI and Yoshifumi TAKEDA Department of Bacteriologyand Serology,Research Institute for Microbial Diseases,Osaka University Shigehiko SUGIYAMA and Toshiyuki ADACHI Osaka Munincipal Momoyama Hospital Antibody titers against the thermostable direct hemolysin produced by Kanagawa-phenomenon postitive strains of Vibrioparahaemolyticus(anti-hemolysin titers) in sera of patients suffering from gastroenteritis due to V. parahaemolyticuswere determined. A sensitive method to determine anti-hemolysin titer in serum was developed and this method was applied to 201 control samples and to sera of 51 patients admitted to Osaka Munincipal Momoyama Hospital. It was found that the anti-hemolysin titers in sera of patients increased about 5-10 days after the admission. lysin titer was observed in 11 cases out of 33 cases examined. Apparent increase of anti-hemo- No relation between the increase of anti- hemolysin titer and the severity of gastroenteritis was observed.
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