資料１動物性集合胚の取り扱いに関する作業部会@文部科学省(150925) 胚盤胞補完法による多能性幹細胞からの臓器作出東京大学医科学研究所幹細胞治療研究センター・幹細胞治療分野スタンフォード大学幹細胞生物学・再生医療研究所 1 iPS細胞から臓器を作る移植に関わる問題点 1. 2. 3. 4. 絶対的なドナー不足免疫拒絶倫理的な問題（脳死患者からの臓器提供など）高額な医療費国民総医療費３２兆円のうち人工透析のみで１兆４千億円を使用。３３万人の患者は毎年１万人ずつ増加している。待ち時間は平均１４年。免疫抑制剤の使用が生涯必要。人工心臓の利用増加によりドナー心臓待ちの患者も増加。 2 iPS細胞から臓器を作る臓器を販売するブラックマーケットも存在 2010年だけでも1万個以上の臓器が売買されたと推定されている http://www.hks.harvard.edu/cchrp/isht/events/TranspTourism_20090325.php 3 iPS細胞から臓器を作る移植に関わる問題点 1. 2. 3. 4. 絶対的なドナー不足免疫拒絶倫理的な問題（脳死患者からの臓器提供など）高額な医療費（人工透析に１兆４千億円）自分自身の幹細胞から臓器を作ることができれば全ての問題を解決することができる！ドナー臓器の圧倒的不足を解消することは再生医療の最重要課題の一つ 4 現在の再生医療が目指しているのは細胞治療分化細胞を用いた細胞療法固形臓器 ? 受精卵受精網膜細胞神経細胞心筋細胞 in vitro で分化誘導体細胞の初期化 = 多能性の獲得 ES細胞 iPS細胞 5 現在の再生医療が目指しているのは細胞治療分化細胞を用いた細胞療法固形臓器網膜細胞神経細胞心筋細胞種々の細胞が複雑な相互作用をしながら立体構造を作り上げていく過程を試 vitro で験管の中で再現することは難しい！ in分化誘導 ? 受精卵受精体細胞の初期化 = 多能性の獲得 ES細胞 iPS細胞 6 多能性幹細胞を利用したin vivoでの臓器の再生分化細胞を用いた細胞療法固形臓器動物の体内ならば臓器を作出することは可能では？キメラ動物を利用する ? 受精卵受精 in vitro で分化誘導体細胞の初期化 = 多能性の獲得 ES細胞 iPS細胞 7 キメラ動物とは交配では精子と卵子が受精することによりそれぞれが持つ遺伝子が交ざりあう。これに対し、キメラ動物とは(ゲノムが異なる）細胞が混じりあった状態の個体を意味する。キメラは部分キメラと全身性キメラに区別できる。部分キメラ：輸血や骨髄移植、臓器移植を受けた人。二卵性双生児のペアの８％が血液キメラであるし、母親の血液中に子供の血液が長年にわたって存在する場合があることが知られている。また研究分野でもマウス、ラット等の動物に各種ヒト細胞を移植することは日常的に行われていて、ヒト神経細胞を持つマウスなども作成されている。これらは全て部分キメラである。全身性キメラ：発生の極めて早期にゲノムが異なる胚細胞が混じると体全体に両方の細胞が入り混じった個体が生まれてくる。異種間の胚を混ぜてキメラ個体作出まで至った例として羊とヤギのキメラ（Geep）が 1984 年に生まれているが、ラット･マウス間で個体作出の成功例はない。 8 キメラマウスの作製黒いマウス 8 細胞期の胚仮親の子宮へ移植凝集生まれてきたキメラマウス (毛色はまだら。灰色にはならない) 白いマウス 8 細胞期の胚早期の胚（受精卵）を混ぜてから仮親の子宮に移植すると全身でそれぞれのマウス由来の細胞が入り交じったキメラマウスが生まれるキメラマウス同士を交配しても子供は通常のマウス。 9 (キメラは遺伝しない。) ES細胞やiPS細胞を利用してのキメラ作製 ES細胞やiPS細胞を受精後間もない胚（胚盤胞）に移入してキメラマウスを作る ES/iPS 細胞10-15個を胚盤胞に注入仮親の子宮に移植 ES/iPS cells （受精後3-4 日） Blastocyst after of Injection of the ES injection cells into DsRED blastocyst -marked ES cells キメラマウスの産生 10 臓器ニッチの概念と胚盤胞補完によるiPS細胞からの臓器作出臓器ニッチを用意腎臓を欠損する遺伝子改変マウス Pdx1KOマウス個体内でドナー iPS細胞由来臓器が再生されるのではないか？ Sall1 KO マウス発生過程での補完胎仔胚受精正常多能性幹細胞を胚盤胞へ注入遺伝子改変により膵臓が発生できないマウスの胚盤胞に正常な多能性幹細胞を注入することによって欠損を補完する。 (胚盤胞補完法) 多能性幹細胞 (ESCs, iPSCs) 11 実現に向けてのステップ -1 • マウスモデルでのProof-of-Conceptの証明: “臓器ニッチ” と “発生補完”という概念臓器欠損マウス胚盤胞 Sall1-/- mouse マウス PSC 多能性幹細胞 (PSC) PSC由来の臓器を持つマウスの作出 GFP-marked iPS (GT3.2) → Sall1-/- 12 実現に向けてのステップ –２ • 異種キメラの作出多能性幹細胞 (PSC) Mouse Rat Rat Mouse マウスサイズのキメララットサイズのキメラ心臓肝臓膵臓腎臓 13 実現に向けてのステップ –３・ラットの膵臓を持つマウスの作出 Pdx1 KO mouse Rat Mouse with rat PSCderived pancreas マウスサイズのラット膵臓・マウスの膵臓を持つラットの作出 Pdx1 KO rat mouse iPSC Rat with mouse PSCderived pancreas 14 ラットサイズのマウス膵臓実現に向けてのステップ –４大型動物における胚盤胞補完法による臓器作出 • 膵臓を発生することができない遺伝子改変ブタを作製 Pdx1-Hes1 遺伝子未受精卵精子膵臓の無いブタ • ブタにおいても胚盤胞補完の原理が作動することを確認膵臓を作れないブタ Morula 蛍光遺伝子導入ブタ胚細胞 Blastomere 外来性の膵臓を持つキメラブタの作出に成功 15 膵臓欠損ブタを利用して胚細胞由来の膵臓の作出に成功。キメラブタは成体に！すい臓欠損ブタは通常生後直ぐに死亡するが、胚盤胞補完法で作出された外来性のすい臓によって成体まで生育し、交配も可能である。このブタから得られた精子を用いることによりすい臓が無いブタ胎仔（胚）を大量に得ることが容易となった。当初予想された困難な課題を乗り越えてブタ胎仔体内でヒトのすい臓を作出する準備ができた。成功すれば移植ドナーを待っている重症糖尿病患に膵島を供給する道が開かれる。 16 ヒト臓器作出の実現に向けた課題１．キメラ形成能を持つヒトiPS細胞の樹立 → ヒトiPS細胞のアッセイ系としても重要２．特定の臓器だけにiPS細胞を分化させる技術の確立 → 倫理的な懸念に対する対応（脳、生殖系への分化）３．ヒトと家畜の間での異種キメラの作出 → 進化的な距離の遠い種間での異種キメラを作る４．異種動物固体内で出来た臓器の安全性 → 感染や腫瘍発生の可能性、異種免疫応答など５．医療上のニーズと社会のコンセンサスのバランス → 研究の内容と医学的有用性に対する理解を得る 17 ヒト・マウス動物性集合胚の実験結果から • In vitroで胚を培養して着床後まで発生させられるのはマウスのみ。 • マウス胚とキメラ形成出来ない場合、移植細胞の多能性に問題があるのか、ヒトとホスト動物胚の進化的な距離が問題なのか不明。 • In vivoで試験できれば、ブタ等ヒトにより近い種で検証できるため、結論が出せるようになる。 18 特定の臓器だけにiPS細胞を分化させる技術の確立 Kobayashi et al. Stem Cells and Development 2014 ヒトの脳細胞、生殖細胞などを持つブタの作成に対する倫理的な懸念に対応 Mixl1 off Whole body chimera with PSC-derived pancreas Mixl1 inducible iPSC Mixl1 on Pdx1 KO mouse blastocyst Endodermal chimera with PSC-derived pancreas 内臓臓器の発生に必要な転写因子Mixl1を強制発現させることによりiPS細胞由来の細胞を内臓系に誘導し、脳や生殖細胞へのヒト細胞の分化を阻害 --- Targeted Organ Generation 19 特定の臓器だけにiPS細胞を分化させる技術の確立 Kobayashi et al. Stem Cells and Development 2014 ヒトの脳細胞、生殖細胞などを持つブタの作成に対する倫理的な懸念に対応 Dox (+) (Mixl1 off) Dox (-) (Mixl1 on) 内臓臓器の発生に必要な転写因子Mixl1を強制発現させることによりiPS細胞由来の細胞を内臓系に誘導し、脳や生殖細胞へのヒト細胞の分化を阻害 --- Targeted Organ Generation 20 異種動物の個体内でヒトの臓器を作る可能性が見えてきた現在の課題 1. キメラ形性能を持つヒトiPS細胞の樹立 2. 動物性集合胚のヒトまたは動物の胎内への移植は、現在のガイドラインでは不可。(米英国では承認を得ることにより動物体内への移植は可能）キメラ形成能を持つヒトiPS/ES細胞の樹立膵臓欠損ブタヒトES/iPS細胞 21 膵島移植ヒトの膵臓を持つブタ現在の日本のガイドラインではヒト多能性幹細胞を注入した動物胚（動物性集合胚）を体内に戻すことは禁じられている。