ヒスチジン標識タンパク質の精製 チジン標識タン ク質の精製 Dynabeads® TALON 株式会社ベリタス 2007/4 １．従来法（カラム）での問題点 • サンプルのロスが多い プ が多 • 純度が悪い • 長時間のハンドリングにより複合タンパク質が解離する • 分離したタンパク質を濃縮する必要がある • 自動化できない • 結果に再現性が得られない 2 ２．Dynabeadsの特長 特長 利点 非特異結合が少ない 高純度 反応が早い 短いプロトコル 粒子径が均一で、 高い再現性 表面が滑らか カラムや遠心分離不要 ターゲットタンパク質の タ ゲットタンパク質の 単離と濃縮が同時に可能 穏やかな条件 複合タンパク質をインタクトな状態 で回収 水溶液中での分散性に優れて いる 自動化が可能 磁石によるハンドリング 操作が簡単 非常に均一で滑らかな 表面 ３. Dynabeads TALONとは • • • • • His-tagタンパク質の精製 １ミクロンのDynabeadsに高い特異性を持ったBD TALONを結合 コバルトを中心としたIMAC Technology 中心金属のコバルトによりニッケルよりも特異的に精製 磁気ビーズなので自動化が容易でスクリーニングにも最適 Dynabeads IMAC His-tagタンパク O N O n N O O N Co O O N N 4. Dynabeads TALONのメリット • 小スケールでの精製、濃縮が容易 • 遠心機、カラム不要 • カラム準備が不要なので時間も短縮 • 迅速で温和なので不安定なタンパク質に対しても有効 迅速 温和な 不安定なタ パク質に対し も有効 • 溶出フラクションの確認が不要 5. 使用方法概要 TALON 平衡化 His-tagタンパク質を含むサンプルを D Dynabeads b d TALONTMの溶液に加える 溶液に加える インキュベーション（ His-tagタンパク質が Dynabeads TALONTM と特異的に結合します） Dynabeads用磁石を用いてHis-tagタンパク質 が結合したビーズを回収し、上清を除去 タンパク質－タンパ ク質相互作用 ヒスチジン融合 タンパク質の精製 6. TALONデータ比較 Purified protein 1 2 3 4 5 他社製品に比 夾雑 他社製品に比べ夾雑 タンパク質のバンド が少なく、高純度の サンプルが得られま す 6 (kDa) 97.0 Dimer of 66.0 HAT-CAT 45.0 HAT CAT HAT-CAT 30 0 30.0 20.1 14.4 Yield: 5 – 10 μg/mg / beads 1. 2. 3. 4. 5. 6. Dynbeads® Talon Competitor 1 Competitor 2 Competitor 3 LMW standard (14-97 kDa) Cell lysate 7. 使用目的例 • 小容量でのタンパク質精製 - Dynabeads® TALON™ はタンパク質－タンパク 質相互作用やタンパク質複合体の“pull down”に最 適 • Mass Spectrometry (MS) analysis前のタンパク質サ ンプルの調整 • ハイスループットスクリーニング(HTS) - ターゲット分子に対するアフィニティーと特異性 を持った分子の大規模スクリーニング等 8 8. Dynabeads® TALON™ FAQ & Troubleshooting 試薬の適合性 9 Compatible reagents g accepted concentration Incompatible reagents ß-Mercaptoethanol 10 mM (with caution) DTT (dithiothreitol) CHAPS 1% (with caution) DTE (dithioerythridol) Ethanol 30% (only for storage) EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)) HEPES 50 mM EGTA (ethylene glycol-bis(ß-aminoethyl ether)) Glycerol 20% G Guanidinium-HCl idi i HCl 6M Imidazole 200 mM at pH 7-8 for elution KCl 500 mM MOPS 50 mM NaCl 1.0 M NP 40 NP- 1% SDS 1% (with caution) Tris 50 mM Urea 8M 9. Dynabeads® TALON™ FAQ & Troubleshooting 非特異結合が多い場合 • Imidazoleを加える binding/lysis bufferにimidazoleを加える。 Imidazoleはwashing bufferに加えることもできる. • pHを低くする • pHをわずかに低くし 、imidazole を洗浄ステップで加える. • ビーズの使用量を減らす • binding/washing bufferに添加物を使用する ßM ß-Mercaptoetanol t t l Non-ionic detergents （Tween もしくは NP-40など） Glycerol（疎水的相互作用を防ぐ） 10
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