●B-4：LC-MS/MS法を用いた生体試料中抗体医薬品の定量法開発［特集］第11回医薬ポスターセッション B-4：LC-MS/MS法を用いた生体試料中抗体医薬品の定量法開発薬物動態研究部　櫻井　周合阻害を低減するためにPBS（リン酸緩衝生理食塩水）で血清を希釈することによって抗体医薬品の回収量が向上することを確認した。 ② トリプシンによる酵素消化条件の最適化再現性の高い定量結果を得るためには酵素消化条件の最適化が重要である。酵素消化の手順は 1．タンパクの変性 1.背景 2．S-S結合の還元・アルキル化 3．トリプシン消化アンメットメディカルニーズ（有効な治療方法がないに大別できる。還元・アルキル化試薬の添加量やトリプ医療ニーズ）に対して抗体医薬品が期待されており、現シン添加時の試料溶液のpHは重要な検討項目であり、在、モノクローナル抗体医薬品は30を超える品目数が反応条件の適否は酵素消化物をLC-UV（検出波長：214 日米欧で上市されている。また、開発中のものを含める nm）で測定したクロマトグラムから判定した。最適な条と300種以上にも及び、大部分の抗体医薬候補品につい件によって再現性良くペプチド断片ピークを検出した結ては臨床試験が実施されている。今後の新薬開発におけ果を図1に示す。る抗体医薬品の割合はさらに増加することが予想され、抗体医薬品の定量分析に対する重要性や必要性は一層高まることが考えられる。生体試料中抗体医薬品の定量分析には従来、酵素免疫測定法（ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay）などのリガンド結合法が用いられてきた。リガンド結合法は高い親和性や特異性を有する1次抗体を用いることで高感度な分析を可能としている。しかし、内因性抗原や中和抗体などの妨害物質が分析精度に影響を及ぼすことが知られているため，ブレークスルーが望まれている。そこで、1次抗体を必要とせず、高選択性かつ高汎用性の特長を有し、バイオアナリシスの分野で広く利用されているLC-MS/MSを用いて図１　LC-UVによって測定した抗体医薬品の酵素消化物のクロマトグラムマウス血清中抗Her2ヒト化モノクローナル抗体（以下抗 ③ 抗体医薬品に特異的なペプチドの選定体医薬品と称する）の定量法を開発し、ELISAで得られ ①で得られた粗精製物に対する酵素消化物は抗体医薬た定量値との相関性から本法の適用性を評価した。品だけでなくIgGのペプチド断片も含まれる。抗体医薬品を定量するためには抗体医薬品に特異的なペプチド断片を選定し、MS/MSで選択的に検出する必要がある。 2.前処理法の検討そこで各々のアミノ酸配列を比較して抗体医薬品に特異的な配列を選定した。分析対象とした抗体医薬品は遺伝子組み換え技術を用抗体医薬品の酵素消化物を四重極飛行時間型質量分析いて作製された分子量約15万の免疫グロブリンG（IgG）計（maXis impact, Bruker Daltonics, Inc.）で測定し、であり、配列の95%がヒト由来、5%がマウス由来である。ペプチドの実測質量をタンパク質データベースと照合すこの抗体医薬品の血清中濃度を分析するために、IgGとることで同定した結果、N末端から軽鎖では1～108、重の親和性が高いプロテインGとの結合を利用し、抗体医鎖では1～120までがIgGと異なる配列であることを推定薬品を含む内因性IgGを単離した。次にLC-MS/MS法でした。その中から定量プロテオミクス用ソフトウェア分析するために適した分子量に切断するため、トリプシ「Skyline（米国ワシントン大学が開発）」を用い、トリンで酵素消化を行った。その中から抗体医薬品に特異的プシンによってアルギニン及びリシンのC末端側で切断なペプチドを選定した後、安定同位体置換した内標準物されたアミノ酸配列をシミュレートし、アミノ酸9残基質を合成して定量法を検討した。（分子量：969）をターゲットペプチドの候補として選定した。 ① 抗体医薬品の粗精製高感度分析を実現するためにはプロテインGによって ④ 特異配列の検証多くのIgGを回収する必要がある。そこで血清試料の粘 ③で選定したペプチドは2価プロトン化分子のイオン性を抑え、血清由来成分によるIgGとプロテインGの結強度が強かったためm/z 485をプリカーサイオンとし・41 東レリサーチセンター The TRC News No.120（Feb. 2015） ●B-4：LC-MS/MS法を用いた生体試料中抗体医薬品の定量法開発た。プロダクトイオンには選択性向上のためにプリカー投与群毎に各採血時点の血清中濃度の平均値及び標準偏サイオンよりも大きいm/z 721を選択してMRMトランジ差を算出し、血清中抗体医薬品濃度の経時推移をプロッションを設定し、LC-MS/MS法でモニターした。特異トした結果を図3に示す。本結果はELISAと類似したプ性を検証するために、マウス血清サンプルを用いてブラロファイルが得られた。ンクサンプル（抗体医薬品未添加）と抗体医薬品添加試料（血清中抗体医薬品濃度として1.00 µg/mL）を調製し、LC-MS/MS法で測定した結果を図2に示す。抗体医対し、ブランクサンプルでは測定に影響するピークを全く検出しなかった。従って、選定したペプチドは抗体医薬品に対して特異性が高く、また良好な感度を有することから、ターゲットペプチドとして適切であることを確認した。 10 mg/kg投与群 1 mg/kg投与群血清中抗体医薬品濃度 (μg/mL) 薬品が含まれる場合、6.93分にピークが検出されるのに 1000 100 10 1 0 5 10 15 20 25 投与後時間 (day) 図3　マウス血清中抗Her2ヒト化モノクローナル抗体濃度の経時推移 5.まとめ LC-MS/MSを用いた抗体医薬品の定量法構築の手順図2　LC-MS/MS分析による血清試料のクロマトグラム［左図：ブランクサンプル、右図：抗体医薬品添加試料］及びマウス血清中抗体濃度の定量の実例を紹介した。本手法は、抗体医薬品に特異的なペプチド断片を選定することで内因性IgGと区別して定量することを可能とした。LC-MS/MS法では1次抗体が不要であることから、 3.直線性及び再現性の確認従来の免疫測定法と比較して安価でかつ短期間で分析法を構築できることが利点である。マウスに単回静脈内マウス血清に標準溶液を添加して1.00～400 µg/mLの投与した血清中濃度をLC-MS/MS法により分析した結検量線用標準試料を分析し、絶対検量線法によって直線果、ELISAと類似したプロファイルを確認したことか性を確認した結果、濃度とピーク面積の間に良好な直線ら、LC-MS/MSを用いて、血清中抗Her2ヒト化モノク関係が認められた（相関係数：0.99）。3濃度水準のQCサローナル抗体の定量が可能であることが示された。ンプル（LQC: 2.00 µg/mL、MQC：50.0 µg/mL、HQC： 300 µg/mL）を調製し、各濃度n＝3で分析した結果、真度（%Nominal）は88.9% ～102.5%、精度（%CV）は3.9% 6.参考文献～10.4%であり、良好な再現性を確認した。 1）［APPLICATION NOTE］UPLC/MS/MS Method for the Quantification of Trastuzumab in Human 4.マウス血清中抗Her2ヒト化モノクローナル抗体の定量 Serum at the 5-nM Level Using Xevo TQD MS and Acquity UPLC H-Class System, Waters Corp. 投与群は1 mg/kg及び10 mg/kgで構成し、各群3匹の 2）新生化学実験講座1タンパク質、東京化学同人雄性マウスに抗Her2ヒト化モノクローナル抗体を単回静脈内投与した。以下に示す採血時点において血液を採取し、調製された血清（20 µL）を定量分析に供した。前処理ではターゲットペプチドの一部を安定同位体（13C 及び15N）で置換した内標準物質を添加し、内標準法による定量を行った。採血時点：投与後0.5、1、4、8、24、48、96、168、336 及び504時間（計10時点） 42・東レリサーチセンター The TRC News No.120（Feb. 2015） ■櫻井　周（さくらい　あまね）薬物動態研究部　薬物動態研究室　研究員趣味：料理