F o r O r d e r i n g I n f o r m a t i o n a n d Te c h n i c a l S e r v i c e , c o n t a c t y o u r l o c a l S i g m a - A l d r i c h o f f i c e 173 細胞の剥離 トリプシン トリプシンを用いた培養表面からの 接着細胞の分離 4) トリプシン処理が完了すると、細胞は浮遊状態となり、球 状になります。 培養基質からの接着細胞の分離には、トリプシンまたはトリ プシン•EDTAによる処理が特に広く用いられています。トリ プシンを溶解、または濃縮溶液から希釈する場合、Hanks' Balanced Salt Solution, Modified（製品番号H 8389）のよう な、カルシウムやマグネシウムを含有しないバッファーを用 いる事が重要です。トリプシン溶液をpH 7.4∼7.6に調節しま す。 5) トリプシンによってさらに細胞が損傷されるのを避けるた め、血清、または血清添加培地をなるべく早く細胞浮遊液 に添加するようにしてください。 2) 単 層 細 胞 が 完 全 に 浸 か る ま で 、 培 養 容 器 に ト リ プ シ ン•EDTA溶液を加え、37°Cのインキュベーターに約2分静 置します。 3) トリプシン•EDTA溶液を吸引濾過により除去し、培養容器 を閉じてインキュベーターに戻します。コーティングした 細胞が培養表面から分離してくるまで、さらにインキュベ ーターに静置します。進行状況は、倒立顕微鏡で確認する ことができます。 Trypsin Inhibitor（製品番号T 6522） 1) Trypsin Inhibitorを濃度1 mg/mlで無血清培地に溶解させま す。 2) 0.2 µm酢酸セルロース膜を用いて、Trypsin Inhibitor溶液 を滅菌濾過します。 3) トリプシン処理後、トリプシン溶液1 mlに対してTrypsin Inhibitor溶液1 mlに細胞を再浮遊させます。 4) 1,000 rpmで5分間、浮遊細胞を遠心分離します。 5) 可能な限りすべてのTrypsin Inhibitor溶液を除去し、ペレッ トを無血清培地に再浮遊させます。 6) 目的の培養を行なってください。 注：培養表面からの細胞の剥離に要する時間は、細胞型、 細胞密度、培地中の血清濃度、トリプシンの効力、最 後の継代からの経過時間などによって変化します。ト リプシンは細胞を損傷するため、処理時間は最小限に 抑えるようにしてください。 細胞の剥離 Cell Dissociation Solutions（製品番号C 1419、 3) カルシウムおよびマグネシウムを含有しない平衡塩溶液で 細胞を洗浄します。培養容器を穏やかに30秒間揺らして塩 C 1544、C 5789、C 5914） 溶液を除去します。 製品概要 シグマ・アルドリッチの細胞剥離用溶液（Cell Dissociation Solution）は、細胞培養容器の増殖表面から細胞を穏やかに剥 離するために調製されています。タンパク質成分を含有しない 独特の組成で、酵素を使用せずに細胞を容器表面から剥離しま す。細胞タンパク質は酵素修飾や外来タンパク質の吸着から保 護されます。これらの製品は、細胞表面タンパク質の認識に依 存する免疫化学研究において特に有効であると考えられます。 細胞剥離用溶液は、HBSSまたはPBSに溶解してあります。ま た、個々の製品はEDTA、グリセロール、およびクエン酸ナト リウムを含有します。 使用例： 下記のプロトコールは、細胞剥離用溶液の使用例です。 1) すべての試薬を加温しておきます。 2) 細胞培養容器から培地をすべて除去します。 4) Cell Dissociation Solution（75 cm2フラスコ中に約5 ml） を加え、容器を揺らして単層細胞が溶液に浸るようにしま す。 5) 5∼10分間インキュベートします。 6) 培養容器を手の平で軽く叩いて細胞を剥離させます。強く 接着した細胞を剥離させるには時間がかかる場合がありま す。 7) 完成した増殖培地を細胞に加え、ピペッティングを繰り返 して細胞塊を分離します。 保存： Cell Dissociation Solutionは冷蔵保存（2∼8°C）してくださ い。不溶性の沈殿を生じるおそれがありますので、凍結は避 けてください。 細胞の剥離 1) 吸引濾過により培養容器から培地を除去し、単層細胞をカ ルシウムやマグネシウムを含有しない塩溶液で洗浄して血 清成分を完全に取り除きます。その後、吸引濾過により塩 溶液を除去します。 6) 細胞浮遊液を穏やかにピペッティングして再懸濁させ、細 胞魂を分散させることができます。細胞計数や継代など、 必要に応じてさらに希釈することもできます。
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