2 トランスクリプトミクス トランスクリプトームシーケンス解析 TruSeq（微量）トランスクリプトームシーケンス解析 RNA-Seq (Quantification) 解析 Small RNA 解析 FFPE RNA-Seq トランスクリプトーム解析 MicroRNA および mRNA の統合解析 Long Non-Coding RNA シーケンス解析 トランスクリプトームシーケンス解析 製品概要 トランスクリプトームは次世代ハイスループットシーケンシングで、特定の状況下において、ある生物種の特定組 織や器官のすべての転写配列情報を網羅的かつ迅速に得ることができます。既に基礎研究・臨床診断・創薬などの トランスクリプトミクス Ⅱ 分野で利用されています。 技術特長 • • • • 生物種制限なしの全トランスクリプトームの解析：特異的なプローブの事前のデザインが不要。生物種の遺伝子 やゲノム情報なしで生物種を直接かつ網羅的に解析可能 高カバー率：デジタル信号・生体内の全転写物のほぼ全てを直接解析可能 高解像度：遺伝子ファミリーの中で似ている遺伝子や、選択的スプライシングが起きる SNP を検出可能 広検出範囲：コピーしたリードを数個から数十万個まで精確に計算可能 ワークフロー 真核生物 Oligo (dT) を利用して 原核生物 トータル RNA mRNA を単離 ライブラリー作製 シーケンシング 生データ 品質管理 • Contig の長さの分布 • Unigene の長さの分布 クリーンデータ 可視化 Unigene アセンブリー Differentially expressed genes 生物学解析 (DEGs) スクリーニング Unigene 機能アノテーション • Gene Ontology (GO) アノテーション • GO/KEGG/COG アノテーション • Pathway enrichment 解析 • CDS 予測 De novo トランスクリプトームシーケンス解析 - 24 - rRNA の除去 Oligo (dT) を利用して 真核生物 トータル RNA 原核生物 rRNA の除去 mRNA を単離 ライブラリー作製 シーケンシング Ⅱ トランスクリプトミクス 生データ 品質管理 • アライメント統計 • ランダム性評価 クリーンデータ • リード分布 可視化 リファレンスによるアライメント • Alternative Splicing (AS) 同定 • SNP 解析 • 遺伝子構造の改良 アノテーション • 新たな転写物の予測 • 遺伝子発現解析 ・新規スプライス部位の検出 DEGs スクリーニング 生物学解析 • GO アノテーション • Pathway enrichment 解析 リファレンスゲノムが存在するトランスクリプトームシーケンス解析 ライブラリーの種類 標準ライブラリー・DSN 均一化ライブラリー・Strand-specific ライブラリー データ解析 （１）De novo トランスクリプトームシーケンス解析 標準データ解析 • • • • • • 生データからアダプター配列・コンタミネーション・ 低品質リードを除去 統計解析・データ評価・アセンブリー結果の解析 Unigene 機能アノテーション Clusters of Orthologous Groups of proteins (COG) 分 • • • Unigene 発現差異解析 差次的発現 unigene の GO 分類・pathway エンリッ チメント解析 SNP 解析・SSR マーカーの開発・プライマーの設計 カスタマイズ • お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイ ズします。 類・GO 分類 Unigene の代謝経路解析 タンパク質翻訳領域 (CDS) の予測 - 25 - • • • （２）リファレンスゲノム配列が存在するトランス クリプトーム 標準データ解析 • • 新たな転写産物の予測 SNP 解析 カスタマイズ • 低品質リードを除去 シーケンシングの評価 お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイ ズします。 遺伝子の発現解析・アノテーション 遺伝子発現差異解析 DEG の発現パターン解析・GO 解析・pathway エンリッ チメント解析 遺伝子構造の最適化（真核生物のみ） 技術パラメーター 1. サンプル要件 DNase 処理後の RNA（タンパク質の混入なし） サンプル 植物と真菌 サンプル量 動物 ≧ 20μg ≧ 250ng/µL サンプル濃度 サンプル純度 28S:18S ≧ 1.0、RIN ≧ 6.5 原核生物 ヒト、ラット、マウス その他 ≧ 5μg ≧ 10μg ≧ 65ng/µL ≧ 150ng/µL 28S:18S ≧ 1.0、RIN ≧ 7.0 ≧ 5μg ≧ 65ng/µL 23S:16S ≧ 1.0, RIN ≧ 6.0 OD260/280 ≧ 1.8, OD260/230 ≧ 1.8 ※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、予備のサンプルの同梱を推奨しています。 2. シーケンス解析：91PE 3. 推奨ライブラリーサイズ：200bp 納品物 1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイルで納品 2. 納品データ例 ● De novo トランスクリプトームシーケンス解析 100 995 278 219 197 1000 180 149 18211 10000 11230 7068 4997 3965 3130 2707 2231 1976 1716 1576 1396 1199 1012 889 809 721 653 505 485 454 378 312 100000 10 1 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900 3000 >3000 Number of All-Unigene トランスクリプトミクス Ⅱ • • • • 生データからアダプター配列・コンタミネーション・ 選択的スプライシングの同定（真核生物のみ） Sequence size(nt) 図1 - 26 - すべての Unigene の長さの分布 図2 COG 分類 ●リファレンスゲノム配列が存在するトランスクリプトームシーケンス解析 表1 アライメントの統計 Map to Genome Stat. of Map to Gene Reads number Percentage (%) Reads number Percentage (%) 100.00 Total Reads 5723472 100.00 4565112480 100.00 Total BasePairs 4565112480 100.00 Total Mapped Reads 34741646 68.49 Total Mapped Reads 28039137 55.28 Perfect match 13039750 25.71 Perfect match 11432658 22.54 ≦ 5bp mismatch 21701896 42.78 ≦ 5bp mismatch 16606479 32.74 Unique match 32662568 64.39 Unique match 23144279 45.63 Multi-position match 2079078 4.10 Multi-position match 4894858 9.65 Total Unmapped Reads 15981826 31.51 Total Unmapped Reads 22684335 44.72 Total BasePairs ~62% ~2% ~4% ~4% ~8% ~5% ~4% 図3 ~4% ~4% ~4% 90%-100% (18743) 80%-90% (2510) 70%-80% (1519) 60%-70% (1284) 50%-60% (1125) 40%-50% (1148) 30%-40% (1134) 20%-30% (1182) 10%-20% (1171) 0%-10% (523) 20000 Ⅱ トランスクリプトミクス 50723472 Number of Gene Total Reads Map to Gene 20000 10616 10000 3442 2095 2504 4864 4531 6049 0 on Ex 遺伝子カバー率の統計 g Sk in ipp on r Int 図4 on ti ten Re e Alt ve ti rna 5' 6724 ng S i plic e Alt ve ti rna 3' ng 10000 0 S i plic 選択的スプライシング 納期 ライブラリー作製・シーケンシング・標準データ解析：約 50 営業日 - 27 - Number of AS Event Stat. of Map to Genome TruSeq（微量）トランスクリプトーム解析 製品概要 次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析（RNA-Seq）は、精確な転写産物の情報を得られ、多様な研 究に応用できます。しかし、一般的なトランスクリプトーム解析では、1 つのライブラリーの作製に 5µg 以上のサン トランスクリプトミクス Ⅱ プルが必要であり、ナノグラムという少量のサンプルには応用できません。 TruSeq トランスクリプトーム解析は、Illumina® TruSeqTM RNA Sample Prep Kit を用い、ヒト・マウス・ラットでは 200ng のサンプル量でライブラリーが作製できます。また、ヒトでは SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit を利用し て、30ng のサンプルでも解析できます。これにより、トランスクリプトーム解析の応用範囲が大きく広がることが 期待されています。 技術特長 • • • Illumina® TruSeqTM RNA Sample Prep Kit を用いた、高品質なシーケンス解析データ 少量のサンプルでライブラリーの作製が可能 ビーズ精製および試薬のミックスを使用し、短時間でライブラリー作製が可能 表 1 一般的な RNA-Seq 解析および TruSeq 解析の比較 サービス名 項目 ライブラリー作製：予備を含めた トータル RNA の量 精製方法 一般的な RNA-Seq 解析 TruSeq 解析 ヒト・マウス・ラット≧ 5µg 植物と真菌≧ 20µg その他≧ 10µg ヒト・マウス・ラット≧ 200ng （ヒト≧ 30ng でも解析可能） その他≧ 1µg カラム精製 ビーズ精製 ゲル抽出の有無 あり なし 適応範囲 De novo / リシーケンシング トランスクリプトーム De novo / リシーケンシング トランスクリプトーム ワークフロー 品質検査 TruSeq ライブラリー作製（Illumina® TruSeqTM RNA Sample Prep Kit） シーケンシング データ解析 - 28 - 技術パラメーター 1. サンプル要件 サンプル サンプル量 タンパク質を除去・DNase を処理したトータル RNA ヒト・マウス・ラット ヒト その他 ≧ 200ng ≧ 30ng でも解析可能 ≧ 1µg 5ng/µL サンプル濃度 RNA の純度 ≧ 20ng/µL 動物（昆虫以外） 植物・真菌 昆虫 RIN ≧ 7.0、28S/18S ≧ 1.0 RIN ≧ 6.5、28S/18S ≧ 1.0 RIN および 28S/18S の要求なし トランスクリプトミクス ※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、予備のサンプルの同梱を推奨しています。 2. シーケンス解析：91 PE 納期 ライブラリー作製・シーケンシング・標準データ解析：約 50 営業日 製品の応用 • 希少サンプルや微量組織サンプルに応用 （レーザーキャプチャー顕微解剖（LCM）サンプル、フローサイトメトリーサンプルなど） • 高度なトランスクリプトームのシーケンス解析品質を求められた場合に応用 • • • • 新規転写産物の検知・遺伝子構造の最適化 スプライスジャンクションの発見・Fusion Gene の解析 SSR・SNP の開発 遺伝子発現差異の解析 BGI の実績およびアドバンテージ • 200 例以上の TruSeq 解析プロジェクト： • ヒト・マウス・ラット・ブタ・モグラ・ショウジョウバエ・シロイヌナズナ・ジャガイモ・真菌 De novo TruSeq トランスクリプトーム解析は total length および N50 などの重要なパラメーターで Ⅱ 一般的な RNA-Seq 解析よりメリットがあります - 29 - RNA-Seq (Quantification) 解析 製品概要 次世代シーケンシング技術に基づいた RNA-Seq (Quantification) は、近年、遺伝子発現プロファイリングの新たな方 法になりました。発現レベルにおいて、数万個の転写物の測定が精確に行えます。RNA-Seq (Quantification) は高感度・ トランスクリプトミクス Ⅱ 高精度・検出範囲が広いといった特徴を持っており、疾患研究・バイオマーカーの同定・創薬・分子育種・個人医 療などの分野に応用されています。 技術特長 • • • • • バックグラウンドノイズのないデジタル信号 高精度・高再現性・高感度 広範囲の遺伝子発現 RNA の使用量が少ない（ヒトのサンプルの場合：100ng） Reads per kilobase of exon model per million mapped reads (RPKM) 方法による、遺伝子発現レベルの計算 ワークフロー Oligo (dT) を利用して 原核生物 真核生物 トータル RNA mRNA を単離 rRNA の除去 ライブラリー作製 シーケンシング • シーケンシングの飽和度解析 生データ • カバー率の解析 • リードの分布解析 品質管理 実験の再現性解析 クリーンデータ 可視化 リファレンス配列とのアライメント アノテーション 遺伝子発現量の統計 (RPKM) DEGs スクリーニング 生物学解析 • GO 解析 • Pathway enrichment 解析 • 差異発現パターンのクラスター分析 • タンパク質間相互作用の解析 - 30 - データ解析 納品物 1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイル 1. 標準データ解析 • • 低品質リードを除去 シーケンシングの評価 2. 納品データ例 表1 遺伝子発現アノテーション 遺伝子発現差異の解析 Map to Gene DEG の発現パターン解析 Total Reads DEG の GO エンリッチメント解析 Total BasePairs DEG の pathway エンリッチメント解析 GO 分類（Web Gene Ontology Annotation Plot : WEGO 解析） タンパク質間相互作用の解析 2. カスタマイズ • で納品 遺伝子アライメントの統計図 Reads number Percentage (%) 6246382 100.00 306072718 100.00 Total Mapped Reads 4957931 79.37 lperfect match 4064918 65.08 ≦ 2bp mismatch 893013 14.30 Unique match 4000400 64.04 Multi-position match 957531 15.33 Total Unmapped Reads 1288451 20.63 お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイ Coverage log2(ReadsNumber) ズします。 1. サンプル要件 サンプル DNase 処理後の RNA（タンパク質の混入無し） ヒト、ラット、マウス その他 サンプル量 サンプル 濃度 トータル RNA ≧ ２µg トータル RNA ≧ ５µg ≧ 80ng/μL ≧ 200ng/μL 動物 サンプル 純度 RIN ≧ 7.0 植物と真菌 RIN ≧ 6.5 GeneNumber 2.0 技術パラメーター 0 0.3 0 27.0 0 chr7 (317642 nt/window, 500 windows) 図1 OD260/280 ≧ 1.8、OD260/230 ≧ 1.8、28S:18S > 1.0 リファレンスゲノムにおけるリードの分布 ※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、 予備のサンプルの同梱を推奨しています。 2. シーケンス解析：50SE ~17% 3. 推奨ライブラリーサイズ：約 200bp ~23% 90%-100% (9978) 80%-90% (7507) 70%-80% (5775) 60%-70% (4820) ~13% 50%-60% (3857) ~2% 納期 ライブラリー作製・シーケンシング・標準データ解析： 約 30 営業日 ~4% ~11% ~7% 40%-50% (3205) 30%-40% (3081) 20%-30% (3241) 10%-20% (1748) 0%-10% (996) ~7% ~9% ~7% 図2 遺伝子カバレッジの統計 - 31 - Ⅱ トランスクリプトミクス • • • • • • • 生データからアダプター配列・コンタミネーション・ Small RNA 解析 製品概要 次世代シーケンシング技術に基づいた Small RNA シーケンシングは、microRNA・siRNA・piRNA などの small RNA の同定と検出において最も信頼できる方法です。特に microRNA は細胞の成長・発展・分化・死亡に決定的な トランスクリプトミクス Ⅱ 役割を果たすので、microRNA のシーケンシングにより制御因子を全般的に見られ、疾患メカニズムをよりよく理解 できます。生体分子研究分野において、Small RNA シーケンシングはバイオマーカーと薬物ターゲット研究のため によく使われる手段です。 技術特長 • • • • 単一塩基解像度で microRNA の SNP を検出 コピー数が 2 ～数十万までの small RNA を幅広く検出可能 既知と未知の microRNAs を検出 即時更新のデータベース ワークフロー トータル RNA ライブラリー作製 50SE シーケンシング 生データ • アライメント • ランダム検査 品質管理 可視化 クリーンデータ • リードの分布 アノテーション 既知 piRNA・siRNA・ 既知 microRNA rRNA など エクソンでまだアノテー ションを行わないリード 新たな microRNA の予測 生物学解析 ファマリー解析 • 差異発現解析 • クラスター分析 • 標的遺伝子の予測 • 標的遺伝子のアノテーション • Small RNA を元にした情報編集 データ解析 1. 標準データ解析 • • • • 生データからアダプター配列・コンタミネーション・ 低品質リードを除去 small RNA の長さの分布の統計 (18~30 nt) サンプル間にある共通配列と特異配列の分析 選ばれたリファレンスゲノムで small RNA 分布の探索 - 32 - • • • • Rfam と Genbank データベースをアライメントし、 rRNAs・tRNAs・snRNAs・snoRNAs などを同定 small RNAs と反復配列を同定 small RNAs とエクソン・イントロンを同定 small RNAs と miRBase で 指 定 し た 範 囲 の 既 知 miRNAs を同定 • • • • small RNAs の分類アノテーション Mireap プログラムでの新規 miRNAs の予測とその二 次構造の作成 既知 miRNAs の発現パターンの解析 発現変動 miRNA の標的遺伝子の予測 発現変動 miRNA の標的遺伝子解析・GO アノテーショ 既知 miRNAs の家系解析 3. カスタマイズ • 既知・新規 miRNA の標的遺伝子の予測 お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイ ズします。 miRNA の標的遺伝子の GO アノテーションと KEGG Ⅱ 経路解析 既知 miRNA の Base editing 解析 トランスクリプトミクス • miRNA の発現差異解析とクラスター分析 ンと KEGG 経路解析 2. オプションデータ解析 • • • • • 技術パラメーター 1. サンプル要件 トータル RNA ( タンパク質の混入無し ) サンプル サンプル量 mirVana ™ miRNA Isolation Kit で分離、200nt 以下 普通 ≧ 10μg ≧ 1μg サンプル濃度 ≧ 200ng/μL ≧ 20ng/μL サンプル純度 28S:18S ≧ 1.5 ( 昆虫以外 )、RIN ≧ 8.0 ※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、予備のサンプルの同梱を推奨しています。 2. シーケンス解析：50SE Scatter plot (control:x | treatment:y) 1000000 3. 推奨ライブラリーサイズ：18~30nt 100000 納期 up-expressed miRNA down-expressed miRNA equally-expressed miRNA Expression level (6A) 10000 ライブラリー作製・シーケンシング・標準データ解析： 約 30 営業日 納品物 1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイル 1000 100 10 1 0.1 で納品 2. 納品データ例 0.1 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 Expression level (7A) 図2 57.92 差異発現解析 50% 40% 100 30% 20% 16.29 10.33 10% 0 Percent(%) Frequence percent 60% 10 11 0.01 0.02 0.08 12 13 14 4.92 1.91 2.37 2.65 0.45 0.68 1.17 15 16 17 18 19 20 21 22 23 1.01 0.14 0.03 0.01 24 25 26 60 40 20 0 1 27 28 長さの分布 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 nt Position Length (nt) 図1 G C A U 80 図3 各部位における miRNA のヌクレオチドバイアス - 33 - FFPE RNA-Seq トランスクリプトーム解析 製品概要 現在、腫瘍サンプルの約 90％はホルマリンで固定し、パラフィンで包埋 (FFPE) されたサンプルであり、バイオマー カーの発見、新薬の開発、疾病の診断および治療などについて豊富な情報を持っています。 トランスクリプトミクス Ⅱ しかし、FFPE サンプルは、希に核酸の分解と塩基変化を起こすため、組織から完全な情報を取得するのは困難です。 現在のところ、FFPE サンプルの核酸情報の取得はマイクロアレイやプロテオミクス技術が利用されていますが、次 世代シーケンス解析の利用はごくわずかです。 最近、BGI の研究開発グループは FFPE サンプルの完全なトランスクリプトーム情報をシーケンス解析する新しい 方法を開発しました。この方法を評価するため、同じ腫瘍組織の FFPE サンプルと新鮮凍結 (FF) サンプルによるシー ケンス解析のデータを比較しました。その結果、新しいシーケンス解析方法は FFPE サンプルの遺伝子発現のプロファ イリング研究に適応することが明らかになりました。 技術特長 • • • • • DSN 均一化ライブラリー サンプルの量が少ない場合（最低 200ng）でも解析可能 ハイスループット FFPE サンプルの専門的なバイオインフォマティクス解析 マルチオミクス技術を利用した全面的・系統的な解析 ワークフロー 精製したトータル RNA RNA 断片化 cDNA 合成 アダプターのライゲーション &PCR DSN 均一化 技術パラメーター • RNA 抽出キット ® Ambion RecoverAllTM Total Nucleic Acid Isolation Kit • サンプルの要件 トータル RNA ≧ 200ng - 34 - • シーケンス解析 Illumina HiSeq 2000・91 PE • データ量 約 2Gb clean data BGI の実績 ・サンプル情報 表 1 同じ腫瘍組織からの FFPE 腫瘍サンプルと新鮮凍結 (FF) サンプルの情報 FF Donor ID FFPE T2 T3 N T1 T2 T30 N0 3.0 1.5 1.0 0.2 3.0 1.5 1.0 0.2 RIN 7.5 4.8 6.4 2.6 2.4 2.4 2.4 2.4 28S:18S 1.0 1.0 0.8 1.4 0.5 0 0 0 (Years) 0 T：腫瘍サンプル、N：コントロール、1-3：癌のサブタイプ 図 1 T30 サンプルの RNA 分析結果（Agilent 2100） RNA は顕著に分解されていました。 ・納品データ例 表 2 FF サンプルおよび FFPE サンプルのアライメントデータ Items FF Average FFPE Average Donor ID11 T1 T2 T3 N T10 T20 T30 N0 Total Reads(G) 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2 Detected Gene Number 17150 17095 17517 16637 17382 17420 17766 16637 %Mapped to hg19 92.20 91.34 93.13 88.81 91.37 87.24 81.39 86.64 84.73 85.00 %Uniquely mapped to hg19 72.49 58.60 66.26 66.57 65.98 72.80 55.61 74.45 67.85 67.68 %Mapped to RefSeq 27.08 18.67 25.49 12.51 20.94 23.40 20.36 22.84 19.11 21.43 %Uniquely mapped to RefSeq 17.34 12.76 16.17 8.32 13.65 14.98 13.36 14.48 11.83 13.66 11.85 15.66 14.27 26.10 16.97 5.65 5.77 4.48 9.21 6.28 Map to Genome hg19 Mapped to RefSeq %Ribosome リボソーム比率では、FFPE サンプルは FF サンプルより低かったですが、ヒト参照ゲノム hg19 と RefSeq では、 FF サンプルと FFPE サンプルのマッピング比率に有意差はありませんでした。 - 35 - Ⅱ トランスクリプトミクス T1 Block Age 0 表 3 FFPE サンプルと FF サンプルの遺伝子発現の相関解析 Correlations T1 T10 spearman R = 0.9453 Pearson R = 0.9302 T20 T30 T2 T3 spearman R = 0.9046 Pearson R = 0.8948 spearman R = 0.9035 Pearson R = 0.8905 spearman R = 0.8374 Pearson R = 0.8449 N0 トランスクリプトミクス Ⅱ N RPKM 計算の結果、FFPE サンプルと FF サンプルの遺伝子発現量に高い相関性が確認されました。 （Pearson R>0.84） 図 2 FFPE サンプルと FF サンプルの相関解析 - 36 - MicroRNA および mRNA の統合解析 製品概要 現在、機能ゲノミクス分野において、マイクロ RNA（miRNA）とメッセンジャー RNA（mRNA）の研究が注目され ています。Small RNA シーケンシング、RNA-Seq（トランスクリプトーム）と RNA-Seq（定量）の登場後、BGI は 先駆者として、microRNA および mRNA の統合解析の発展に注力しています。 BGI は異なる RNA シーケンス解析法を効果的に融合し、より多くのハイスループットデータを簡単に処理・探索で きるようになりました。 技術特長 • • 次世代シーケンシング（NGS）データとマイクロアレイデータを含むハイスルプットデータの統合解析を実施 データの利用率の向上、標的遺伝子予測の改善 ワークフロー miRNA の発現情報 miRNA 差異解析 遺伝子の発現情報 miRNA 標的遺伝子の予測 miRNA と遺伝子の共発現解析 遺伝子差異解析 標的遺伝子のスクリーニング 制御ネットワークの作成 相関解析 遺伝子の機能アノテーション Pathway ネットワークの作成 MicroRNA と mRNA 統合解析内容 • • • • • • • miRNA と遺伝子の発現差異解析 miRNA 標的遺伝子の予測 miRNA と遺伝子の共発現解析 miRNA と遺伝子の相関解析 発現相違の miRNA および遺伝子の調製ネットワーク KEGG と GO 解析 Gene-miRNA-GO と Gene-miRNA-KEGG の結果分類 納期 約 15 営業日（サンプル数が 20 以下の場合） - 37 - Ⅱ トランスクリプトミクス MicroRNA および mRNA の統合解析は発生生物学、機能ゲノミクスと疾患進行などの領域で応用することができます。 BGI の実績 患者の microRNA-mRNA の統合解析は、疾患診断および予後のバイオマーカーのスクリーニングに多大な影響を与 えました。 研究目的 サンプル選択 実験手順 ・疾病の診断 ・疾病の予測 ・血清 ・組織 ・ライブラリー作製 ・シーケンシング データ解析 フォローアップ検証 ・有病率 ・生物機能解析 ・発現差異 ・標的予測 Normal adjacent tissues ccRCC miRNAs up-regulated miRNAs down-regulated mRNAs up-regulated mRNAs down-regulated 8000 150 6000 100 4000 50 2000 0 K1 K2 K3 K6 K7 K27 K39 K38 K44 K55 0 mRNAs differentially espressed 200 miRNAs differentially expressed トランスクリプトミクス Ⅱ A. 健常者と比較し、淡明型腎細胞癌（ccRCC）患者の特異的 に発現する miRNA および mRNA の数（P<0.01,FDR ≦ 0.001） ※ K1 ～ K55 は患者の No. 4 48 （7.14%） 4 （7.14%） B. 異なる組織で観察された新規 miRNA 候補 Normal adjacent tissues ccRCC 18 （3.07%） 562 6 （1.02%） C. 異なる組織で観察された新規 mRNA 候補 図 1 淡明型腎細胞癌（ccRCC）患者の miRNA および mRNA の発現情報 Zhou L, Chen J, Li Z, Li X, Hu X, et al. Integrated profiling of microRNAs and mRNAs: microRNAs located on Xq27.3 associate with clear cell renal cell carcinoma. PLoS ONE . 2010, 5(12): e15224. - 38 - Long Non-Coding RNA シーケンス解析 製品概要 長鎖非コード RNAs（Long non-coding RNAs, Lnc RNAs）はタンパク質へ翻訳されていない 200nt 以上の長さの RNAs (rRNA を含まない ) を言い、ポリ A の有無を問わず、非コード RNAs（non-coding RNAs, ncRNAs）内で大き な割合を占め、エピジェネティック制御、転写調節と転写後調節などで遺伝子発現を調節し、生命活動に重要な役 Lnc RNAs シーケンス解析（LncRNA-seq）は特定方法（例えば、Ribo-ZeroTM キット）を利用してサンプル中の rRNA の存在量を減らし、濃縮された RNA を Illumina HiSeq2000 プラットフォームでシーケンシングし、LncRNA の鑑定、予測と差異分析を行います。迅速で精確な、特定生物学過程或いは疾患関連の LncRNA 情報の研究方法です。 技術特長 • • • シーケンスカバー率が高く、データ量を変更でき、ほぼすべての転写物をカバー 高精度、大量の配列情報を獲得 既知 LncRNA の鑑定と未知 LncRNA の予測のほか、mRNA データと組み合わせての共発現の注釈 ワークフロー 技術応用 トータル RNA 参考ゲノムがある場合 参考ゲノムがない場合 rRNA の除去 rRNA および poly-A RNA の除去 RNA 断片 • • • • • 既知 LncRNA の鑑定 未知 LncRNA の発見 LncRNA ファミリーの予測分類 LncRNA 定量と差異分析 疾患マーカーの探索 ランダムプライマー (6 量体 ) を用い cDNA を合成 サイズの選択および PCR 増幅 Illumina シーケンス解析 技術パラメーター 1. サンプル要件 サンプル サンプル量 タンパク質を除去・DNase を処理したトータル RNA rRNA のみを除去したトータル RNA rRNA および polyA RNA を除去したトータル RNA ≧ 5µg ≧ 20µg サンプル濃度 ≧ 80ng/µL サンプル純度 RIN ≧ 7.0 ※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、予備のサンプルの同梱を推奨しています。 2. シーケンス解析：Illumina HiSeq 2000・91 PE/101 PE - 39 - Ⅱ トランスクリプトミクス 割を果たしています。
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