HABA アッセイキット

HABA アッセイキット
使用説明書
Code No.HY-1110
【目的・用途】
●96 ウェルマイクロプレートを用いる場合
本キットはビオチンラベル化したタンパク質のラベル化率を測定するキットです。
2) HABA/アビジン溶液 180uL をウェルに加えます。
20 サンプルを測定するのに必要な試薬が含まれております。
3) 500nm の吸光値を測定し、記録します。(A500HABA/アビジン)
フリーの HABA は 348nm に吸収のピークを持ちますが、アビジンと結合することにより
4) ビオチン化タンパク質溶液 20uL を HABA/アビジン溶液の入ったウェルに加え、プ
吸収のピークは 500nm に変わります。HABA とアビジンの親和性(Kd=5.8×10-6M)はビ
オチンとアビジンの親和性(Kd=1×10-15M)より弱いため、HABA/アビジン複合体はビ
オチン/アビジン複合体へと変わり、500nm の吸収が減少します(下図参照)。
レートミキサーなどにより十分混合します。
5) 500nm の吸光値を測定し、記録します。(A500HABA/アビジン/ビオチン)
※吸光値が 0.3 以下の場合、ビオチン化タンパク質溶液を希釈し、もう一度測定
を行ってください。
6) ビオチン化率の計算
500nm 吸光値
ΔA500 = (A500HABA/アビジン)－(A500HABA/アビジン/ビオチン)
タンパク質
H
H
H
B
アビジン
アビジン
H
H
H
ビオチン濃度(M) = ΔA500/34,000×0.5×10×(希釈倍率)
※εHABA/ビオチン = 34,000M-1cm-1、光路長 = 0.5cm
B
タンパク質
HABA/アビジン複合体
10：ビオチン化タンパク質の希釈倍率(反応液への混合)
ビオチン化タンパク質を希釈して反応液に加えた場合には（希釈倍率）を
HABA/アビジン/ビオチン複合体
H
B
H
タンパク質
掛けてください。
タンパク質濃度(M) = タンパク質濃度(mg/mL)/分子量(Da)
解離したHABA
ビオチン化されたタンパク質
ビオチン化率 = ビオチン濃度(M)/タンパク質濃度(M)
【特徴】
例） IgG (MW146,000)、0.69mg/mL をラベル化し、キュベットで測定した場合
1）アッセイに必要な試薬が全て含まれており簡便
A500HABA/アビジン = 0.904
2）ビオチン化率の測定に最適化
A500HABA/アビジン/ビオチン = 0.771
ΔA500
【キット内容・保存方法】
内容
PBS(K不含)※1
HABA/アビジン粉末
容量
： 0.9×0.904－0.771 = 0.0426
ビオチン濃度(M) ：0.0426/34,000×1×10 = 1.2×10-5 (M)
タンパク質濃度(M) ：0.69/146,000 = 4.7×10-6(M)
保存方法
使用期限
4℃
1年
ビオチン化率
：1.2×10-5/4.7×10-6 = 2.5
20 mL
4本
※1 0.1M リン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム
【トラブルシューティング】
トラブル
A500 が 0 以下
【方法】
1) HABA/アビジン溶液を調製します。
HABA/アビジン粉末 1 本に PBS(K 不含)5mL を加え、混合します。
※HABA/アビジン溶液は 4℃で 2 週間安定です。沈殿が生じた場合は 0.45um
フィルターろ過してご使用ください。
液中にカリウムが含まれる場合、沈殿が生じます。カリウムが混入しないよう
に注意してください。
以降の操作はキュベットを使用する場合とマイクロプレートを使用する場合で方法が
異なります。適切な方法を選択し、行ってください。
●1mL キュベットを用いる場合
2) HABA/アビジン溶液 900uL を 1mL キュベットに加えます。
3) 500nm の吸光値を測定し、記録します。(A500HABA/アビジン)
4) ビオチン化タンパク質溶液 100uL を HABA/アビジン溶液の入ったキュベットに加
え、ピペッティングにより十分混合します。
5) 500nm の吸光値を測定し、記録します。(A500HABA/アビジン/ビオチン)
※吸光値が 0.3 以下の場合、ビオチン化タンパク質溶液を希釈し、もう一度測定
を行ってください。
6) ビオチン化率の計算
ΔA500 = (0.9×A500HABA/アビジン)－(A500HABA/アビジン/ビオチン)
ビオチン濃度(M) = ΔA500/34,000×1×10×(希釈倍率)
※εHABA/ビオチン = 34,000M-1cm-1、光路長 = 1cm、
10：ビオチン化タンパク質の希釈倍率(反応液への混合)
ビオチン化タンパク質を希釈して反応液に加えた場合には（希釈倍率）を
掛けてください。
タンパク質濃度(M) = タンパク質濃度(mg/mL)/分子量(Da)
ビオチン化率 = ビオチン濃度(M)/タンパク質濃度(M)
HABA アッセイの結
果、ビオチンラベル
化率が高すぎる
原因・対策
HABA/アビジン溶液とビオチン化タンパク質溶液が
十分に混合できていない
ビオチン化タンパク質溶液は加えるだけでは混合しま
せん。ピペッティングやプレートミキサーにより十分混
合してください。
沈殿が生じている
フィルターろ過をしてください。
未反応のビオチンが残っている
アッセイを行う前に脱塩カラムを用いて未反応のビオ
チンを除いてください。

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