WO 2010/110471 Al;pdf

(12) 特許協力条約に基づ
て公開された国際出願
(19) 世界知的所有権機関
国際事務局
(10) 国際公開番号
(43) 国際公開日
2010 年 9 月 30 日(30.09.2010)
WO 2010/110471 Al
(74) 代理人特許業務法人特許事務所サイクス (SIKs
& Co.), 〒 104003 1 東京都中央区京橋一丁目 8 番
7 号京橋日殖ビル 8 階 Tokyo (JP)
(51) 国際
許分類
C12N 15/09 (2006 01)
A61K , 刀27 (2006 01)
A61K 31/7088 (2006 01)
A61K 47/26 (2006 01)
A61K 47/34 (2006 01)
(21)
国際出願番号
(22)
国際出願日
(25)
国際出願の言語
日木語
(26)
国際公開の言語
日本語
(30)
優先権データ
特願 2009-069438
特願 2009-069439
PCT/JP20 10/055493
2010
2009
2009
年 3 月 23 日(23
年 3 月 23 日(23
年 3 月 23 日(23
03 2010)
03 2009)
JP
03 2009)
JP
(81) 指定国 ( 表示のな 1 限り、全ての種類の国内保
護可 ) AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA,
BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, Cの,
CR, CU, CZ, DE, DK, DM, Dの, DZ, EC, EE, EG, ES, FI,
GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS,
JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR,
LS, LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW,
MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, のM, PE, PG, PH,
PL, PT, Rの, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST,
SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ,
VC, VN, ZA, ZM, ZW
(71) 出願人 ( 米国を除 < 全ての指定国につて ) 国
り
定
立大学法人北海道大学 (NATIONAL UNIVERSITY (84) 指国 ( 表示のな 1 限、全ての種類の広域保
護
可
)
ARIPO
(BW,
GH, GM, KE, LS, MW, MZ,
CORPORATION
HOKKAIDO
UNIVERSITY)
NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), -1 ーラシア
[JP/JP], 〒0600808 北海道札幌市北区北 8 条西 5
(AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ヨーロツ /
丁目 Hokkaido (JP)
(AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB,
(72) 発明者および
GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL,
(75) 発明者 / 出願人 ( 米国につてのみ) 原島秀吉
NO, PL, PT, RO, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI (BF, BJ,
CF, CG, CI, CM, GA, GN, G の, GW, ML, MR, NE, SN,
(HARASHIMA, Hi eyoshi) 秋田
英万 (AKITA,
TD, TG)
Hidetaka) ・エルサイドアイマン (EL-SAYED, Ayman) ・増田智也 (MASUDA, Tomoya) ・居城邦治
添公開書類
(IJIRO, Kuniharu) 新倉謙一(NIIKURA, Kenichi)
国際調査報告条約第 2 1 条 (3))
西尾崇 (NISHIO, Takashi)
(54) Title LIPID MEMBRANE STRUCTURE
(54) 発明の名称脂質膜構造体
(57) Abstract Provided are a lipid membrane structure that is for delivering substances into the cytoplasm of a target cell and has
INF7 surface modifications, and a lipid membrane stru。
ture that is for deliver 面g substances into the nucleus of a target cell, en
capsulates the substance to be delivered on the interior thereof, and has a surface modified with three or more oligosaccharide
compounds
(57) 要約
標的細胞の細胞質内に物質を送達するための脂質膜構造体であって、INF7 で表面修飾された
脂質膜構造体、及び標的細胞の核内に物質を送達するための脂質膜構造体であって、送達すき物質が
内部に封入されており、糖以上のオリゴ糖化合物で表面修飾された脂質膜構造体。
書
明細
発明の名称
質膜構造休
技術分里予
０００1
本発明は組織や臓器などの標的細胞の細胞質内に核酸などの物質を効率的
に放出することができる脂質膜構造休に関する。
また、本発明は核内への輸送効率に優れた脂質膜構造体に関する。より具
体的には、糖化合物で表面修飾された核輸送性に優れる脂質膜構造休に関す
るものである。
背景技術
０００2
薬剤を患部に特異的に輸送する手段として脂質膜構造体であるリポソーム
に薬剤を封入する方法が提案されている。特に、悪性腫瘍の治療分野におい
て抗腫瘍剤を封入したリポソームの有効性が数多く報告されている。また、
遺伝子発現に利用可能な脂質膜構造休として多機能性エンベロープ型ナノ構
造体
(
:
において「
p ・ 15
u
unc
ona
en v
pe
ype
nano de
」と略す場合がある。例えば rug
e
本明細書
e
v e r y Sy s e
22
2， p
122 2００などを参照のこと) が提案されている。この構造体は、遺伝
子などを特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステ
ムとして用いることができ、例えば、腫瘍の遺伝子治療などに有用であるこ
とが知られている。
０００3
脂質膜構造体を用いて薬物、核酸、ペフチド、タンパウ質
・糖などの目的
物質を標的臓器や腫瘍組織など特異的な部位に送達するための手段として、
脂質膜構造体の表面を機能性分子で修飾する方法が多数提案されている。一
般に脂質膜構造体は血中を循環する間に血清蛋白質の吸着によるオプソニン
化などを受け、肝臓や脾臓などに存在するマウロファージなどに捕捉されて
しまうという問題がある。この問題を回避するために，例えば、リポソーム
膜の表面をポリエチレングリコール (
) などのポリアルキレングリコールな
どの親水性ポリマーで修飾する方法が汎用されており、血中滞留性を向上さ
せたリポソームが多数提案されている ( 特開平 249
5 1 2 号公報、特開平 4
34 9 8 号公報、特開2 ００4
149
号公報、特開平
1
０4 8 1 号公報など)
。腫瘍組織
では一般に腫瘍血管内皮細胞の間隙が大きいことから、その間隙からリポソ
ームを漏出させて腫瘍組織に選択的にリポソームを送達させる経路を利用す
ることができるが，血中滞留性を高めることによりリポソームの腫瘍組織へ
の送達率を高めることができるので，抗腫瘍剤を含む脂質膜構造体にはポリ
アルキレンヴリコールによる修飾を施すことが一般的である。
０００4
抗腫瘍剤などの薬剤を内包した脂質膜構造体は標的細胞に到達するとエン
ドサイ
トーシスにより細胞内に取り込まれェン
ドソーム内に包含された状態
となるが、その後、リソソームの酵素による加水分解作用などを受けて内包
されていた薬剤を細胞質内に放出する。しかしながら、
などのポリアルキ
レンヴリコールで表面修飾された脂質膜構造休はェンドソームから放出され
にくく、抗腫瘍剤などの薬剤をェンドソーム内から効率的に細胞質中へと放
出させることができないという問題がある。例えば、エンドソーム内に取り
込まれたリポソームからの薬剤放出性を高めるために、リポソームの表面を
ぺプチド
(
L
r y，2 6
s
oche
ソームが提案されているが
(
oche
pp 29
s
ry
4
43
29 2
pp
19
6
で修飾したリポ
)
8
p
623 2００4 )
などのポリアルキレンヴリコールで表面修飾されたリポソームなどの脂質膜
構造休では
０００5
L
の表面修飾を施しても薬剤放出性を高めることができない。
一方、インフルエンザ
タンパク質 (
グルタミン酸リッチペプチド
2)
由来のぺプチド(
23 を改変した
「) が知られており、リポソームと混在させ
ることにより脂質構造が崩壊して内包された物質が容易に放出されることが
報告されている (
oche
s
ry
46
pp
チレンヴリコールテトラアクリレート (
34
０ 13 ０4
に
2００ )
また、ポリエ
結合ペプチド(
)
を結
7 を結合させた送達システムが提案されており、遺伝子送
「
達効率を高めることができるとの報告がある ( h e Jo u r n
ene
e
e
O
合させ、さらに
０ pp
０００6
1
114
2００8 )
また、核酸などの目的物質を内包した脂質膜構造体を標的細胞の核内に移
行させるための手段としては、例えば、リポソームの外側表面をオウタアル
ギニンで修飾したリポソーム ( 国際公開０2 ００ 32593
e
eas e
98
Jo u r n
ro
o
O
e
323 2００4 ) 、核移行性ペフチドで修飾された脂質膜
pp 31
を有する 2 枚膜リポソーム ( 国際公開０2 ００6
０)
、ガラクトースやマンノ
ースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム ( 国際公開０2 ００
248 1)
されている。単糖で修飾された上記リポソームについては、㎞
v
が提案
r o での試
験結果において遺伝子発現効率を改善できたとされている。しかしながら、
上記刊行物には、これらのリポソームについて
V v o の実験系においての効
果は示されておらず、例えば静脈内投与により特定臓器や組織の細胞の核内
に移行して遺伝子発現効率を改善できるか否かについての実験結果は示され
ていない。
先行技術文献
特許文献
０００
249
特許文献
特開平
特許文献2
特開平 2 1495
特許文献3
特開平 4 346 18号公報
特許文献4
特開2 ００4 1０4 8 1 号公報
特許文献5
国際公開０2 ００5 32593
特許文献
国際公開０2 ００6
特許文献
国際公開０2 ００
号公報
2 号公報
０1
1
248
1
ys
e
非特許文献
０００8
ョト特許文献 1
非特許文献2
非特許文献
非特許文献4
rug
oche
he
ve
e
s
Jo u rna
Jo u rna
O
ry
O
on
pp
pp 1349 ０
46
ry
22 2
e ne
ro
発明が解決しようとする課題
c
e
ed
e
5
０4
ne
０
ase
98
122 2００
2００
pp
1
pp 31
49
2００8
323 2００4
０００9
本発明の課題は，標的細胞の細胞質内に効率的に薬剤や遺伝子などの物質
を放出させるための脂質膜構造体を提供することにある。より具体的には、
脂質膜構造休を取り込んだエンドソームから脂質膜構造休に内包された物質
を効率的に細胞質内に放出させることができる脂質膜構造休を提供すること
が本発明の課題である。
また、本発明の別の課題は、核酸などの目的物質を内包した脂質膜構造休
を標的細胞の核内に効率的に移行させるための手段を提供することにある。
上記課題のうち特に好ましい課題の一つは、肝臓などの標的臓器や組織の
細胞の核内に遺伝子を含む核酸を内包した脂質膜構造体を効率的に移行させ
、高い遺伝子発現活性を達成するための手段を提供することにある。
課題を解決するための手段
０００
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、薬剤や遺伝
子などの物質を内包するリポソームなどの脂質膜構造体の表面をエンドソー
ム脱出ペフチド(endoso
esca pe pe p
e:
) である F で修飾すること
により、極めて効率的に薬剤や遺伝子などの物質を細胞質内に放出させるこ
とができることを見出した。また，上記の脂質膜構造休の表面を
などのポ
リアルキレンヴリコールで修飾した場合にも、内包された薬剤や遺伝子など
の物質を効率的に細胞質内に放出させることができることを見出した。本発
明は上記の知見を基にして完成されたものである。
００11
また、本発明者らは，マルトトリオースなどの3糖以上のオリゴ糖化合物で
表面を修飾した脂質膜構造休が細胞の核内に効率的に取り込まれること、及
び遺伝子を含む核酸を上記手法により核内に移行させることにより、極めて
高い遺伝発現活性を達成できることを見出した。本発明は上記の知見を基に
して完成されたものである。
００12
すなわち、本発明により、標的細胞の細胞質内に物質を送達するための脂
質膜構造体であって、 F で表面修飾された脂質膜構造休が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、脂質膜構造休がリポソームである上記
の脂質膜構造休
ポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリ
) で表面修飾された上記の脂質膜構造休
コール (
及びポリアルギニン、好
ましくはオクタアルギニンで表面修飾された上記の脂質膜構造体が提供され
る。
００ 3
さらに好ましい態様によれば、
脂質量に対して
～5
の範囲である上記の脂質膜構造体 ; ポリアルキ
モル
レングリコール、好ましくは
～4０モル
に対して
F による表面修飾量が脂質膜構造体の総
による表面修飾量が脂質膜構造休の総脂質量
の範囲である上記の脂質膜構造体
ポリアルギニン、好
ましくはオウタアルギニンによる表面修飾量が脂質膜構造体の総脂質量に対
して０・8
～2０モル
合物と
「とが共有結合した脂質修飾「、好ましくはステアリル化
の範囲である上記の脂質膜構造休が提供される。脂質化
に
より表面修飾された上記の脂質膜構造体も提供される。
００14
また、別の観点からは、標的細胞の細胞質内に物質を送達するための脂質
膜構造体であって、送達すべき物質が内部に封入されており、
「で表面修
飾された脂質膜構造休が提供される。好ましくは脂質膜構造体がリポソーム
及びポリアルキレングリコール、好ましくは
である上記の脂質膜構造休
で表面修飾された上記の脂質膜構造休が本発明により提供される。
００
この発明の好ましい態様によれば、送達すべき物質が核酸、例えば遺伝子
を含む核酸やs
などの機能性核酸である上記の脂質膜構造休
及びポリア
ルギニン、好ましくはオウタアルギニンにより表面修飾された上記の脂質膜
構造体が提供される。さらに、上記の脂質膜構造休が多機能性エンベロープ
型ナノ構造体
(
)
である上記の脂質膜構造休 ; 多機能性エンベロープ型ナ
ノ構造体が、内部に核酸及びカチオン性ポリマーが封入され，表面がポリア
ルギニン、好ましくほオウタアルギニンと
表面がさらにポリアルキレングリコール、好
ムである上記の脂質膜構造休
ましくは
F とにより修飾されたリポソー
により修飾されたリポソームである上記の脂質膜構造体
チオン性ポリマーがフロタ
ミ
及びカ
ンである上記の脂質膜構造休が提供される。ま
た、遺伝子発現に用いる上記の脂質膜構造休 ; 及び遺伝子治療に用いる上記
の脂質膜構造休が提供される。
この脂質膜構造体を有効成分として含む医薬組成物、好ましくは送達すべ
き物質として核酸を含む医薬組成物も本発明により提供される。
００ 6
さらに別の観点からは、ヒトを含む哺乳類動物の生体内において標的細胞
の細胞質内に物質を放出させる方法であって、 F で表面修飾され、かつ送
達すべき物質を内部に封入した脂質膜構造体を該動物に投与するエ程を含む
方法が提供される。送達すべき物質として，医薬有効成分又は核酸などが挙
げられる。好ましくは、該脂質膜構造休がポリアルキレンヴリコール、好ま
しくは
により表面修飾されている上記の方法が提供される。この脂質膜構
造休は標的細胞にエンドサイトーシスにより取り込まれてェンドソームに封
入された状態で細胞質内に移行した後、 F の作用によりエンドソームから
脱出して細胞質内に該物質を効率的に放出することができる。
００1
この発明の好ましい態様として，ヒトを含む哺乳類動物の細胞内において
遺伝子を発現させる方法であって，
「で表面修飾され，さらに
及びポリ
アルギニン、好ましくほオクタアルギニンにより表面修飾されており、かつ
遺伝子を含む核酸を内部に封入した脂質膜構造体を該動物に投与する工程を
含む方法が提供される。好ましくは、核酸とともにカチオン性ポリマー、例
えばプロタ
ミ
ンを内部に封入した上記脂質膜構造体を用いることができる。
さらに、遺伝子治療のために用いる上記の方法が提供される。
００18
また、本発明により、ヒトを含む哺乳類動物の疾患の予防及びノ又は治療
方法であって、
で表面修飾され，好ましくはさらにポリアルキレングリ
コール、より好ましくは
で表面修飾されており，かつ医薬有効成分を内部
に封入した脂質膜構造体を該動物に投与する工程を含む方法が提供される。
医薬有効成分として例えば抗腫瘍剤や核酸などを挙げることができる。
００
さらに、ヒトを含む哺乳類動物の疾患の予防及び
又は治療方法であって
F7 で表面修飾され、好ましくはさらにポリアルキレングリコール、より
好ましくは
で表面修飾されており、かつ医薬有効成分、例えば抗腫瘍剤又
は遺伝子を含む核酸などを内部に封入した脂質膜構造休を該動物に投与する
エ程を含む方法が提供される。
別の観点からは、本発明により、標的細胞の核内に物質を送達するための
００2 ０
脂質膜構造体であって，送達すべき物質が内部に封入されており、3 糖以上の
オリゴ糖化合物で表面修飾された脂質膜構造体が提供される。
この発明の好ましい態様によれば，オリゴ糖化合物が 3 糖化合物である上記
の脂質膜構造休
オリゴ糖化合物がグルコース 3 量体である上記の脂質膜構造
オリゴ糖化合物がマルトトリオースである上記の脂質膜構造体
体
及び脂
質膜構造体がリポソームである上記の脂質膜構造体が提供される。
さらに好ましい態様によれば、
002
造休
v
L
により表面修飾された上記の脂質膜構
4モ
による表面修飾量が脂質膜構造休の総脂質量に対して０・1～
の範囲である上記の脂質膜構造休
ましくはポリ
造体
L
チレングリコール (
さらにポリアルキレングリコール、好
により表面修飾された上記の脂質膜構
による表面修飾量が脂質膜構造体の総脂質量に対して
の範囲である上記の脂質膜構造体
レ
～4０モル
及び標的細胞が肝臓細胞である上記の脂
質膜構造休が提供される。
００22
また、別の観点からは、標的細胞の核内に物質を送達するための脂質膜構
造体であって、送達すべき物質が内部に封入されており、3 糖以上のオリゴ糖
化合物で表面修飾された脂質膜構造休が提供される。この発明の好ましい態
様によれば、オリゴ糖化合物が 3 糖化合物である上記の脂質膜構造休 ; オリゴ
糖化合物がグ
レコース 3 量体である上記の脂質膜構造体
ルトトリオースである上記の脂質膜構造休
オリゴ糖化合物がマ
及び標的細胞が肝臓細胞である
上記の脂質膜構造体が提供される。
さらに好ましい態様によれば、該物質が核酸、例えば遺伝子を含む核酸やs
23
などの機能性核酸である上記の脂質膜構造体が提供され、さらに脂質膜
構造休が多機能性エンベロープ型ナノ構造体
休
(
)
である上記の脂質膜構造
多機能性エンベロープ型ナノ構造休が、内部に核酸及びカチオン性ポリ
マーが封入され、表面が 3 糖以上のオリゴ糖化合物により修飾されたリポソー
ムである上記の脂質膜構造休
多機能性エンベローフ型ナノ構造体が、内部
に核酸及びカテオン性ポリマーが封入され，表面が 3 糖以上のオリゴ糖化合物
L
、及びポリェチレングリコールにより修飾されたリポソームである上
記の脂質膜構造休
及びカチオン性ポリマーがプロタ
ミ
ンである上記の脂質
膜構造休が提供される。また、肝臓における遺伝子発現に用いる上記の脂質
膜構造体 ; 遺伝子治療に用いる上記の脂質膜構造体
に用いる上記の脂質膜構造休
肝臓疾患の遺伝子治療
及び肝臓疾患が糖尿病、肝臓癌又はウイルス
性肝炎である上記の脂質膜構造体が提供される。
この脂質膜構造休を有効成分として含む医薬組成物、好ましくは該物質と
して核酸を含む医薬組成物も本発明により提供される。
００24
さらに別の観点からは、ヒトを含む哺乳類動物の生体内の標的組織又は臓
器の細胞の核内に物質を送達する方法であって、3 糖以上のオリゴ糖化合物に
より修飾され、好ましくはさらに
」及びポリアルキレングリコールで表面
修飾されており，かつ送達すべき物質を内部に封入した脂質膜構造体を該動
物に投与するエ程を含む方法が提供される。送達すべき物質として、医薬有
効成分又は核酸などが挙げられる。
００25
この発明の好ましい態様として、ヒトを含む哺乳類動物の生体内の標的組
織又は臓器の細胞核内において遺伝子を発現させる方法であって、3 糖以上の
オリゴ糖化合物により修飾され、好ましくはさらに
」及びポリアルキレン
グリコールで表面修飾されており、かつ送達すべき物質を内部に封入した脂
質膜構造体を該動物に投与する工程を含む方法が提供される。好ましくは、
核酸とともにカテオン性ポリマー、例えばプロタ
ミ
ンを内部に封入した上記
脂質膜構造体を用いることができる。さらに、肝臓細胞において遺伝子を発
現させる上記の方法 ; 遺伝子治療のために用いる上記の方法
伝子治療に用いる上記の方法
炎である上記の方法
肝臓疾患の遺
肝臓疾患が糖尿病，肝臓癌又はウイルス性肝
及び投与形態が静脈内投与である上記の方法が提供さ
れる。
００26
また、本発明により、ヒトを含む哺乳類動物の疾患の予防及びノ又は治療
方法であって、3 糖以上のオリゴ糖化合物により修飾され、好ましくはさらに
」及びポリアルキレングリコールで表面修飾されており，かつ医薬有効成
分を内部に封入した脂質膜構造体を該動物に投与するエ程を含む方法が提供
される。
００2
この発明の一態様として、ヒトを含む哺享類動物の疾患の予防及びノ又は
治療方法であって、3 糖以上のオリゴ糖化合物により修飾され、好ましくはさ
らに
」及びポリアルキレングリコールで表面修飾されており、かつ核酸を
内部に封入した脂質膜構造休を該動物に投与するエ程を含む方法が提供され
る。この方法の好ましい態様によれば、疾患が肝臓疾患である上記の方法
肝臓疾患が糖尿病、肝臓癌又はウイルス性肝炎である上記の方法
及ぴ投与
形態が静脈内投与である上記の方法が提供される。
発明の効果
００28
本発明の脂質膜構造体を用いると脂質膜構造休から内包された物質を効率
的に細胞質内に放出させることができる。特に、
などのポリアルキレング
リコールで修飾された脂質膜構造体においても細胞質内への該物質の放出効
率を高めることができることから、例えば抗腫瘍剤又は遺伝子を含む核酸な
どの医薬有効成分を内包する脂質膜構造体の血中滞留性を高め、かつ脂質膜
構造体から細胞質内への医薬有効成分の放出効率を改善することが可能にな
る。
００29
また、本発明の脂質膜構造体を用いると標的組織や臓器の細胞の核内に効
率的に所望の物質，好ましくは核酸を送達することができ、例えば遺伝子を
含む核酸を送達した場合にほ肝臓細胞などの核内で該遺伝子を高度に発現さ
せることが可能になる。例えば、本発明の脂質膜構造体としてマルトトリオ
ース及び
により表面修飾された多機能性エンベローフ型ナノ構造休を用
L
いて遺伝子を含む核酸を肝臓細胞の核内に送達して該遺伝子を発現させた場
合には、
V
の試験系において無修飾の場合に比べて約 1００倍程度の遺伝
子発現効率上昇を達成することができ、現在市販されているトランスフェク
ション試薬と比べてもより高い遺伝子発現効率を達成できるので、本発明の
脂質膜構造休を用いて、例えば糖尿病、ウイルス性肝炎や肝臓癌などに対し
て極めて効率的な遺伝子治療が可能になる。
図面の簡単な説明
7
図遺伝子封入 8修飾リポソームのトランスフェウション活性に及ぼす「
の効果を示した図である。 e La 細胞 4００００ G e
s
での
e
h
) の結果を示す。
8 (０・4 仕 9 p
図2 遺伝子封入 8修飾リポソームのトランスフェクション活性に及ぼす F
の効果を示した図である。 e La 細胞 4００００ G e
の静脈内投与によるイン・ビボで
7修飾 8
及び3 の
8
h
e ) の結果を示す。
8 (０・4 仕 9 p
図3
での
e
s
の遺伝子発現結果を示した図である。
図4 細胞内にプラスミド
の結果を示し、赤は
8
6 7修飾、黄色は共局在
7修飾
「
図5
を導入し、エンドソ
8
脱出を観察した結果を示した図である。 (a)
ームからの
F
「修飾 8
を含む
b [
(矢印を示し、バ一は０がである。
がェンドソームとの膜融合を介さずにェンドソー
8
(b) はョ
ムから脱出することを示した図である。 (a は非膜融合性 8
融合性
F
8
巨
の結果を示し，青は oechs
果を示し、赤は口一ダミン
図6
p
、緑はエンドソーム
od
及び緑は
力ルセインリリースを用いた
莫
33342 による核染色の結
を示す。
「7 修飾リポソームの膜破壊活性におけ
依存性を示した図である。
る
図7 p 修飾リポソームにおける F によるエンドソーム脱出促進活性を示
した図である。赤は
、バ一は
hod
、緑はェンドソーム ; p 6 修飾を示し
０はである。
図8 遺伝子封入 8
修飾リポソームのトランスフェウション活性に及ぼす
「の効果を示した図である。
として
０
h
8
2０００) を用い，細胞としては e La 細胞 (4 ００００ G e
０
(
０
s
e
を
用いた。
図9
L
(2 )及びマルトトリオース (5 ) を含有する
及びマウス肝臓における遺伝子発現 (ルシフェラーゼ活性
の粒子径
・4 電位
を評価した結果
を示した図である。
図０マル
トトリオースー
～
6 脂質の含量を０
の範囲で変化させて遺伝
子発現活性を評価した結果を示した図である。
図11 マルトトリオース以外の糖 ( セロトリオース、マンノース、ガラクト
ース、及び乃マルトース ) について遺伝子発現活性を評価した結果を示した
図である。
図 2 マルトトリオース以外の糖 ( ぱマルトース及びラウトース ) について
遺伝子発現活性を評価した結果を示した図である。
をマウスに静脈内投与した後の肝臓移行量を評価した結果を示し
図
た図である。
図
L
及びマルトトリオースで修飾された
をマウスに静脈内投与し
た後の肝臓移行量を評価した結果を示した図である。
図15 」 op I e 及び
e 投与時の肝臓における遺伝子発現を
と比較
した結果を示した図である。
発明を実施するための形態
００3 1
標的細胞の細胞質内に物質を送達するための本発明の脂質膜構造休を構成
する脂質としては、例えば、リン脂質，糖脂質，ステロール、又は飽和若し
くは不飽和の脂肪酸な
どが挙げられる。
標的細胞の核内に物質を送達するための本発明の脂質膜構造休を構成する
脂質としては、例えば，リン脂質、ステロール、又は飽和若しくは不飽和の
脂肪酸などが挙げられる。
リン脂質及びリン脂質誘導体としてほ、例えば、ホスファテジルエタノー
００32
ルアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン，ホスファチジル
イノシトール、ホスファチジルグリセロール、力ルジオリピン，スフィンゴ
ミ
エリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリ
セロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、1，2 ジミリスト
イルー
2 ヂオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、ホズファチジン
酸などを挙げることができ、これらは種又は2 種以上を組み合わせて用いる
ことができる。これらリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されないが、
2 ０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、
例えば、炭素数 2 ～
具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オ
レイン酸、リノール酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。
また、卵黄レシチン，大豆レシチンなどの天然物由来のリン脂質を用いるこ
ともできる。
００33
糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質 ( 例えば、スルホキシリボシル
グリセリド、ジグリコシルジヴリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガ
ラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド)
、スフィンゴ糖脂質 (
例えば、ガラクトシルセレフロシド、ラクトシルセレフロシド、ガングリオ
、
ンドなどが挙げられる。
００34
ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール
例えば、コレステ
ロール、コレステロールコハク酸，ラノステロール、ジヒドロラノステロー
ル、テスモステロール、ジヒドロコレステロール ) 、植物由来のステロール
フィトステロール
例えば、スチヴマステロール、シトステロール、カ
ンペステロール、フラシカステロール
、微生物由来のステロール ( 例えば
、チモステロール、エルゴステロール
などが挙げられる。
飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、
ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸などの炭素数 12
～2０の飽和又は
不飽和の脂肪酸が挙げられる。
００35
脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した
形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、０型エマルション、
型エマルション、球状
ミ
セル、ひも状
ミセル、又は不定型の層状構造物など
を挙げることができる。本発明の脂質膜構造休の好ましい形態としてリポソ
ームを挙げることができる。以下、本発明の脂質膜構造体の好ましい態様と
してリポソームについて説明する場合があるが、本発明の脂質膜構造体はリ
ポソームに限定されることはない。
００3 6
標的細胞の細胞質内に物質を送達するための本発明の脂質膜構造体は、そ
F で修飾されていることを特徴としている。
の表面が
ザ
) 由来のぺプチ
タンパク質
ド(
F はインフルエン
23) を改変したヴルタミン酸リッチペ
プチドであり、リポソームと混在させることにより脂質構造が崩壊して内包
された物質が容易に放出されることが報告されており (
1349 ０ 135 ０4 2００ ) 、ポリエチレングリコールテ
に
d
ry ， 46
c he
pp
)
トラアクリレート (
「を結合させた送達システムも提案されている ( he Jo u rna O ene e
０ pp 1134
ne
49 2００8 。当業者はこれらの刊行物を参照すること
により本発明において
F7 を容易に使
F
oc he
おいて
用語に [
s
することが可能である。本明細書に
ry 46
pp
349 ０
０4
2００7 の a b e
1に記載された配列により特定されるぺプチドのほか、上記ペフチドのアミ
ノ酸配列において
又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及びノ又は付加された
アミノ酸配列からなり、実質的に
「と同様の性質を有する修飾ペプチドも
包含される。本明細書における「 F 」の用語をいかなる意味においても限
定して解釈してはならない。上記刊行物の開示及びこの刊行物において引用
された全ての文献の開示を参照により本明細書の開示として含める。
００3
「による脂質膜構造休の修飾方法は特に限定されないが、一般的には、
脂質化合物と
F とが共有結合した脂質修飾
を脂質膜構成脂質として用
いて脂質膜構造体を構築することにより・ F により表面修飾された脂質膜
構造休を容易に製造することができる。脂質修飾
リル化
F などを利用することができ、この化合物はFu a
o ngug
he
・， 2
(6)
pp 1００5 1０1
製造することができる。
は総脂質量に対して
S e
a
oc
2００に記載された方法に従って容易に
「による表面修飾量は特に限定されないが、一般
的には脂質膜構造休の総脂質量に対して
００38
「としては、例えばステア
モル
～5
モル
の範囲であり、好ましく
程度である。
標的細胞の核内に物質を送達するための本発明の脂質膜構造休の表面修飾
に用いられる 3 糖以上のオリゴ糖化合物の種類は特に限定されないが、例えぼ
、3 個ないし1０個程度の糖ユニツ
トが結合したオリゴ糖化合物を用いることが
でき、好ましくは3 個ないし個程度の糖ユニツトが結合したオリゴ糖化合物
仏
を用いることができる。
r
オリゴ糖化合物としてより具体的には、例えば、セロトリオース (
:
os
ヴルコピラノシル (
ルコース ) 、カコトリオース ( haco
び
L ラムノ
a nose
コピラノシ
ノシル
o
ノシル
リオース
コピラノシル
4)
6
d
d づ6
g
は
ンベリフェロース
d
トピラノシルい
トラオース
r s引
づ2)
3
g
ルコピラノシル
タキオース (
び
乃
グルコピラノシド、ラフィ
ガラクトピラノシル
o
e raose :
:
ラムノ
び
ガラクトース
3
づ
d
旧
d
乃
d
1
の
、ウ
ガラク
リコテ
キシロピ
ガラクトース
び
、マ
グ
グルコース ) 、ス
フルクトフラノシル二ぴ
ガラクトピラノシル
旧
グルコピラノシル (
の
グルコピラノシル
4
づ
chyose :
ose
グルコピラノシル
グルコピラノシル
j
づ
ルトテトラオース (
ガラウトピラ
の
フルウトフラノシル二巳
旧
グル
秘
ガラクトピラノシド) などの3 糖化合物
は
(」
yco e raose :
ラノシル
の一一ガラクト
グルコピラノシル
は
n eose :
グルコピラノシル
be
ヴルコピラ
ば
グルコピラノシド、
フルクトフラノシル二び
ぽ
・イソパノー
ose :
グルコピラノシド、ソラトリオース (
ピラノシル
d
グルコピラノシル
ぽ
グルコピラ
ば
6
フルクトフラノシルニの
ば
グル
は
グルコース ) 、マンニノト
4
づ
フルクトフラノシル二ぴ
旧
nose :
ノース ( a
se :
ガラクトピラノシル
ぱ
2)
グルコピラノシル
巳
o r
グルコース ) 、プランテオース (
4
づ
se :
6
づ
グルコース
6
づ
づ
臼
r
o
ヴルコース ) ，メレジトース (
anose :
パノース
づ
se :
o
1
ピラノシル
ノシル
グルコピラノシル
4
づ
( an
ラムノピラノシル
、ゲンチアノース ( e n村
I
グルコース ) 、マルトトリオース
6
ル
臼
グルコピラノシル
O
L
秘
グ
4)
づ
グルコピラノシルい
jg
グルコピラノシル
は
づ
づ
い
:
ド、イソマルトトリオース (
o pan ose
ス (
ose
グルコース
ピラノシル
フルクトフラノシル
B
グルコピラノシ
旧
ガラクトピラノシ
グルコピラノシドなど
の4 糖化合物 ; マル
～4)
は
1づ4
6
ラノシル
4
ぴ
コース
～)
の
4
グ
巳
レコ
ピラノシル
4)
グルコピラノシル
Ⅳ
6)
ガラクトピラノシル
1づ6
ガラクトピラノシル
は
ドなどの5 糖化合物
open aose :
は一
グルコース ) 、ベルバスコース ( e rbascose :
フルクトフラノシル二は
ピラノシル
づ
1
グルコピラノシ
グルコピラノシル
乃
(
トペンタオース
マルトヘキサオース (
グルコピラノシル
ヴルコピラノシル
4
び
4
び
グルコピラノシ
は
ohexaose
:
の
ヴルコピ
グルコピラノシル
ヴルコピラノシル
などの6 糖化合物を挙げることができるが
ガラクト
び
4
グル
・これらに限定されること
はない。
００4０
好ましくはグルコースの3 量体ないし量休であるオリゴ糖化合物を用いる
ことができ、さらに好ましくはヴルコースの3量体又は4量体であるオリゴ糖
化合物を用いることができる。より具体的には、イソマルトトリオース、イ
ソパノース、マルトトリオース、マルトテトラオース，マルトペンタオース
、又はマルトヘキサオースなどを好適に用いることができ、これらのうち、
グルコースがぱ
4結合したマ
ペンタオース、又はマ
レ
レ
トトリオース、マルトテトラオース，マルト
トヘキサオースがさらに好ましい。特に好ましいの
はマルトトリオース又はマルトテトラオースであり、最も好ましいのはマル
トトリオースである。
００4
オリゴ糖化合物で脂質膜構造体を表面修飾する方法は特に限定されないが
，例えば、脂質膜構造体をガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修
飾したリポソーム国際公開０2００7
248 1) が矢られているので、この刊行物
に記載された表面修飾方法を採用することができる。上記刊行物の開示の全
てを参照により本明細書の開示として含める。この手段はポリアルキレンヴ
リコール化脂質に単糖化合物を結合して脂質膜構造体の表面修飾を行なう方
法であり、この手段により脂質膜構造休の表面をポリアルキレンヴリコール
により同時に修飾することができるので好ましい。
００42
本発明の脂質膜構造体の表面をポリアルキレングリコールなどの親水性ポ
リマーで修飾することによりリポソームの血中滞留性を高めることができる
。この手段については、例えば、特開平 1 24971 7 号公報、特開平 2
公報、特開平 4 346
18
9512 号
号公報、特開2 ００4 1０4 8 1 号公報などに記載されている
。親水性ポリマーとしてはポリアルキレングリコールが好ましい。ポリアル
キレングリコールとしては、例えば，ポリエチレングリコール，ポリプロピ
レングリコール，ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリ
コールなどを用いることができる。ポリアルキ
～００００程度、好ましくは
例えば００
5
レングリコールの分子量は、
～００００、さらに好ましくは1 ，０００～
００
，０００程度である。
００ 3
ポリアルキレングリコールによる脂質膜構造体の表面修飾は、例えばポリ
アルキレングリコール修飾脂質を脂質膜構成脂質として用いて脂質膜構造休
を構築することにより容易に行なうことができる。例えば，ポリエチレング
リコールによる修飾を行う場合にはステアリル化ポリエチレングリコール
例えばステアリン酸
4
(
4 ) など) を用いることができる。その他
力ルボニルーメトキシポリエチレンヴリコールー2 ０００
イルー s n グリセロ
3
ホスフォエタノールアミン、n
リエチレングリコールー０００
エタノールア
2
ミ
ン、
2 ジパルミトイルーs
2
力ルボニルーメトキシポ
n
グリセロ 3 ホスフォ
ジステアロイルー s n グリセロ 3 ホスフォエタノールアミン、
3 ホスフォエタノールアミン、
コールー０００
2
パルミト
力ルボニルーメトキシポリエチレングリコールー
ルーメトキシポリエチレングリコールー2 ０００
ロ
(
2
5
０
カルボニ
ジステアロイルー s n グリセ
力ルボニルーメトキシポリエチレングリ
ジステアロイルーs n グリセロ 3 ホスフォエタノールアミ
ンなどのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできるが、ポリ
アルキレングリコール化脂質はこれらに限定されることはない。
００4
例えば、ステアリル化ポリエチレングリコールにオリゴ糖化合物を結合さ
せることにより、ポリアルキレングリコール及びオリゴ糖化合物による表面
修飾を同時に達成することができる。もっとも、脂質膜構造体を表面修飾す
る方法は上記の方法に限定されることはなく、例えば、ステアリル化された
オリゴ糖化合物など脂質化オリゴ糖化合物を脂質膜構造体の構成脂質として
使用することにより、表面修飾を行なうことができる場合もある。オリゴ糖
化合物による脂質膜構造休の表面修飾量は特に限定されないが、例えば、総
脂質量に対して
くは5
００45
～０モル
～3 ０モル
2 ０モル
程度、好ましくは2 ～
程度、より好まし
程度である。
本発明の脂質膜構造休の製造にあたり、血中滞留性を高めるための脂質誘
導体として、例えば、グリコフォリン、ガンヴリオシド
、ホスファチジル
イノシトール，ガングリオシド 3 、グルウロン酸誘導体、グルタ
体、ポリグリセリンリン脂質誘導体などを利
ミ
ン酸誘導
することもできる。また、血
中滞留性を高めるための親水性ポリマーとして、ポリアルキレンヴリコール
のぼかにデキストラン、フルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、ス
テレン一無水マレイン酸交互共重合体，ジビニルエーテル一無水マレイン酸
交互共重合体，アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シウロ
デキストリン，ペクチン、カラギ一ナンなどを表面修飾に用いることもでき
る。
００46
また、本発明の脂質膜構造休にほ、例えば、温度変化感受性機能、膜透過
機能、遺伝子発現機能、及び
感受性機能などのいずれか1つ又は2 つ以上の
機能を付与することができる。血申滞留性を付加するとともに，これらの機
能を適宜付加することにより、例えば抗腫瘍剤や遺伝子を含む核酸などの医
薬有効成分を内包する脂質膜構造体の血液中での滞留性を向上させ、肝臓や
脾臓などの細網内皮系組織による捕捉率を低下させるとともに、標的細胞に
おけるェンドサイトーシスの後にェンドソームからの医薬有効成分の放出効
率を高めることができる。また、標的細胞におけるェンドサイトーシスの後
にェンドソームから効率的に脂質膜構造体を脱出させて核内に移行させるこ
とができ，核内において高い遺伝子発現活性を達成することが可能になる。
００4
温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体と
しては、例えば、ジバ
できる。また，
レミ
トイルホスファチジルコリンなどを挙げることが
感受性機能を付与することができる
感受性脂質誘導体と
しては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンなどを挙げ
ることができる。
また、本発明の脂質膜構造体は、細胞表面の受容体や抗原に対して特異的
００4 8
に結合可能な抗体などの物質で修飾を施すこともでき，ェンドサイトーシス
効率を改善することができる。送達の効率性の観点から、例えば標的組織又
は臓器に特異的に発現する生体成分に対するモノクローナル抗体を脂質膜構
造休の表面に配置することが好ましい。この手法は、例えば、
233
2 4頁
pr es s
nc 発行，
a
L
及びF rank
La
a
r
n
編 ) などに記載されている。脂質膜構造休の構成成分として，モノクローナ
ル抗体やそのフラヴメント ( 例えば、Fab フラグメント、「(a b
、又はFa b
例えばポリ
フラグメントなど) 中のメルカフト基と反応し得る脂質誘導体、
エテレングリコール
ノールアミン仙
ロ
3
キシー
のジステアロイルホスファチジルエタ
(
マレインイミド、巳
ホスフォリルエチル
ピロールー 1 イル
オキソ
フラグメント
2 エタンジル )
力ルバ
ミ
ル
2
吋
ジステアロイルーs n グリセ
2
エタンカルボキサミド
2 5
ヒドロー2
ポ
プロピル
ジ
オ
などのマレインイミド構造を有する脂質誘導体を含有
させることにより、モノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜の表面に結合さ
せることができる。
本発明の脂質膜構造体の表面はポリアルギニンで修飾されていてもよい。
００4 9
ポリアルギニンとしてはオクタアルギニンなどを用いることができる。リポ
ソームなどの脂質膜構造体の表面をオクタアルギニンなどのポリアルギニン
で修飾することにより，リポソームに封入された目的物質の細胞内送達効率
を向上させることができる㏄ u r n
23
2００
O
on ro
ed
e ease
98
pp
3
国際公開０2 ００5 32 93) 。ポリアルギニンによる脂質膜構造休表
面の修飾は、上記の刊行物に記載された方法に従って、例えば脂質修飾ポリ
アルギニン、例えばステアリル化オクタアルギニンなどを脂質膜構造体の構
成脂質として使用することにより容易に行なうことができる。上記刊行物の
開示及びこの刊行物において引用された全ての文献の開示を参照により本明
細書の開示として含める。
ポリマー及びノ又は
さらに、本発明の脂質膜構造休は
００5 ０1
いてもよい。
ポリマーは2 メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリ
のを重合して得られる
ン
」で修飾されて
ポリマーである。このポリマーは生体膜と
類似の分子構造を有していることからタンパウ質や血球などの生体成分との
相互作用が極めて小さく、優れた生体適合性を有することが示されている。
本明細書において、「
ポリマー」の用語には
のホモポリマー、及び
と他の重合成分とのコポリマーのいずれも包含される。
ポリマーは市販のポリマーを容易に入手することができる。例えば、日
００ 1
油株式会社から登録商標「リピジュア
: 6
12 5 2
88
25 4
ポリマー
9 6)
のホモポリマ
とブチルメタクリレートとのコポリマ
、メタクリル酸ナ
:
トリウム、メタクリル酸ブチルの3 元コ
(メタ ) アクリロイルオキシプロピルトリメ
と2 ヒドロキシー3
;
」として
(L
チルアンモニウムクロリドとの2 元コポリマー
;
リン脂質ポリマー ( 」
などが提供されており，いずれも本発明に用いることができる。
００ 2
本発明において用いられる
ば、
ポリマーの種類は特に限定されないが、例え
とブチルメタクリレートなどのメタクリル酸エステルとのコポリマー
、特にブロックコポリマーなどを好ましく用いることができる。このコポリ
マーについては特許第 289 ０3 1 6 号公報に製造方法が詳細に記載されており、当
業者はこの特許公報を参照することにより所望のコポリマーを容易に製造す
ることができる。この特許公報の開示の全てを参照により本明細書の開示と
して含める。本発明においては、水溶性を有し，かつ疎水性基を有する
ポ
リマーを用いることが好ましいが，このような観点から炭素数ないし 8 程度
のアクリル酸ェステル又はメタクリル酸エステルを用いて製造された
コポ
リマーを好適に使用することができる。
)
のコポリマーとしては、例えば、
０) や
えば、
のモルとヒが 3 : のコポリマー
と
y
と
er
Jo u r n
22
pp 35
とブチルメタクリレート (
のモルとヒが5 : 5 のコポリマ
3０
(
と
5
などが知られており、例
36０ 19 9 ０などに記載の方法に従って容
2
易に調製することが可能である
(
０
例えば特開2 ００ 31 526号公報に具体的な製
造方法の説明がある ) 。本発明には
5
０を特に好ましく用いることができる
ポリマーの重合度や分子量は特に限定されないが、例えば、水溶性を維
持する観点から平均分子量
(
3 ０
重量平均分子量 ) が 5 ，０００～
００００程度、好ま
しくは1 ００００～０００００程度のポリマーを用いることができる。
００ 3
ポリマーで脂質膜構造体を修飾する方法は特に限定されないが、例えば
、リポソームなどの脂質膜構造体の水性分散物に
ポリマーを添加し、室温
で数分から数時間程度放置すればよい。上記水性分散物への
加量は特に限定されないが、修飾すべき
ポリマーの量に応
脂質膜構造体の総脂質量に対して０・０1 ～質量
。この操作により
れ，表面が
じて、例えば、
の範囲、好ましくは０・1 ～1 ０
、さらに好ましくは０・～3 質量程度の
質量
ポリマーの添
ポリマーを添加すればよい
ポリマーは速やかに脂質膜構造体の脂質成分に取り込ま
ポリマーで修飾された脂質膜構造休を調製することができる。
ポリマーによる表面修飾量は特に限定されないが，例えば脂質膜構造休の
総脂質量に対して０・1 ～質量
程度の範囲である。
エンドソーム内から脂質膜構造体を細胞質中に効率的に脱出させるために
００ 4
本発明の脂質膜構造体の表面を
y
pp
，2 6
964
29 2
開2 ００6 28０3 ０号公報には
L
で修飾してもよい。
L
L
L
r
で表面修飾を施したリポソームが開示されてい
L
造体を容易に製造することができる。一般的には
h
che
において報告されたぺフチドであり、例えば、特
8
るので、上記公報に記載された方法に従って、
体
」
で表面修飾した脂質膜構
L
のコレステロール誘導
を脂質成分として用いて脂質膜構造体を調製することにより
で表面修飾した脂質膜構造体を製造することができる。
L
による表
面修飾量は特に限定されないが、例えば、総脂質量に対して０・０～０モル
程度、好ましくは０・～モル
００ 5
程度、より好ましくは
～モル
程度である
木明細書において「」」の用語には特開2 ００6 28０3 ０号公報の配列表の配
列番号 1 により特定されるぺプチドのほか、上記ペフチドのアミノ酸配列にお
いて
は数個のアミノ酸が欠失、置換、及びノ又は付加されたアミノ酸配列
からなり、実質的に」と同様の性質
例えば酸性条件下において脂質膜同
士を融合できる性質 ) を有する修飾ペフチドも包含される。木明細書におけ
る「 L 」の用語をいかなる意味においても限定して解釈してはならない。
」及び」による脂質膜構造体の表面修飾方法に関して、特開2 ００6 28０3 号
公報の開示の全てを参照により木明細書の開示として含める。
本発明の脂質膜構造体には、ステロール、又はヴリセリン若しくはその脂
００
肪酸エステルなどの膜安定化剤、トコフェロール、没食子酸フロピル，パル
ミ
チン酸アスコルビル、又はブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、
荷電物質、及び膜タンパク質などからなる群から選ばれる 1種又は2 種以上の
物質を含んでいてもよい。正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ス
テアリルア
ミ
ン，オレイルアミンなどの飽和又は不飽和脂肪族アミン ; ジオ
レオイルトリメチルアンモニウムプロパンなどの飽和又は不飽和カチオン性
合成脂質 ; あるいはカチオン性ポリマーなどを挙げることができ、負電荷を
付与する荷電物質としては、例えば，ジセチルホスフェート、コレステリル
ヘ
ミスクシネー
ト、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジン酸などを挙げることができる。膜タンパク質としては、例え
ば，膜表在性タンパク質、又は膜内在性タンパク質などが挙げられる。これ
らの物質の配合量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ
る。
００5
多機能性を付加したエンベロープ型ナノ構造体 (
)
が知られており，
本発明の脂質膜構造体として好適に使用することができる。
、フラスミド
は、例えば
などの核酸とプロタミンなどのカチオン性ポリマーとの複合
体をコアとし、このコアがリポソーム形態の脂質エンベロープ膜の内部に封
入された構造を有している。
の脂質エンベロープ膜には、必要に応
じてp
応答性や膜透過性を調節するためのぺフチドを配置することができ、脂質ェ
ンベロープ膜の外側表面はポリエチレングリコールなどのアルキレングリコ
ールで修飾することができる。
の脂質エンベロープの内部には、凝縮化
及びカチオン性ポリマーが封入されており、効率的に遺伝子発現を
された
達成できるように設計されている。本発明に好適に使用可能な
、所望の遺伝子を組み込んだプラス
ミ
ド
とプロタ
封入され、脂質ェンベロープの外側表面が
で修飾された
オリゴ糖結合
ミ
ンとの複合体が内部に
で修飾された
及び
が好ましい。
としては
又は
による修飾は構成脂質成
分としてステアリル化ポリエチレングリコールを用いることが好ましい。
については、例えば rug
e
ve ry
ys e
22 2 pp
122 2 ０などの
総説を参照することができる。上記刊行物の開示及びこの総説において引用
された全ての文献の開示を参照によリ本明細書の開示として含める。
００ 8
脂質膜構造休の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒
例えば水
、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など) に分散された形態やこの水性分
散物を凍結乾燥した形態などが挙げられる。
００5 9
脂質膜構造休の製造方法も特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方
法を採用することができる。一例を挙げれば、全ての脂質成分をクロロホル
ムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機によ
る噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、水系溶媒を乾燥した上
記の混合物に添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、
又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。また
、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発
法などによっても製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御した
い場合には、孔径のそろったメンブランフイルターなどを用いて、高圧下で
イウストルージョン
を行えばよい。分散した状態の脂質膜
押し出し濾過
構造休の大きさは特に限定されないが、例えば、リポソームの場合には粒子
径が 5 ０ n から5
程度であり、5 ０ n から4 ００ n 程度が好ましく、5 ０ n から
ぱ
００ n 程度が好ましく、 5 ０ n から2 ０ n 程度がより好ましい。粒子径は、
例えば
００6 ０
L
(d y n a
水系溶媒
c
gh
Sc a
e
ng)
法により測定することができる。
分散媒 ) の組成は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液
、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液，生理食塩水、細胞
培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒 ( 分散媒
は脂質
膜構造休を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラク
トース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボ一ス、キシロース
糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース，トレハロース，マルトースなど
の二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリン
などの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトー
ル、マ
レチ
トールなどの糖アルコールなどの糖
水溶液 ) や、グリセリン、
ジグリセリン、ポリグリセリン、フロピレンヴリコール、ポリフロピレング
リコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリ
コール、ポリエチレンヴリコール、エチ
レンヴリコールモノアルキルエーテ
ル、ジエチレンヴリコールモノアルキルエーテル、1，3 ブチレングリコール
などの多価アルコール ( 水溶液 ) などを加えてもよい。この水系溶媒に分散
した脂質膜構造休を安定に長期間保存するには、疑集抑制などの物理的安定
性の面から水系溶媒中の電解質を極力排除することが望ましい。また、脂質
の化学的安定性の面からは水系溶媒の
０程度
を弱酸性から中性付近 (
3 ・０から8
に設定し、及びノ又は窒素バブリングなどにより溶存酸素を除去する
ことが望ましい。
得られた脂質膜構造休の水性分散物を凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合には
，例えば、グルコース、ガラク
トース、マンノース、フルウトース、イノシ
トール、リボ一ス、キシロース糖の単糖類，乳糖、ショ糖，セロビオース，
トレハロース、マルトースなどのこ糖類，ラフィノース，メレジノースなど
の三糖類、シクロ子キストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトー
ル，ソ
糖
レビ
トール，マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの
溶液 ) を用いると安定性を改善できる場合がある。また，上記水性分
散物を凍結する場合には、例えば、前記の糖類やヴリセリン、ジグリセリン
，ポリグリセリン、フロピレングリコール、ポリフロピレングリコール、エ
チレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリ
エチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレ
ングリコールモノアルキルエーテル、，3 ブチレングリコールなどの多価ア
ルコール ( Z 溶液 ) を用いると安定性を改善できる場合がある。
００62
本発明の脂質膜構造体、例えばリポソームの内部には、標的組織又は臓器
，あるいは標的組織又は臓器の細胞の核内に送達すべき物質を封入すること
ができる。封入すべき物質の種類は特に限定されないが，抗腫瘍剤、抗炎症
剤、抗菌剤、抗ウイルス剤などの任意の医薬有効成分のほか、糖類、ペプチ
ド類、核酸類、低分子化合物、金属化合物など任意の物質を封入することが
できる。核酸としては、例えば遺伝子を含む核酸を挙げることができ、より
具体的には、例えば、プラス
ミ
ドに組み込まれた遺伝子などを挙げることが
できるが、この特定の態様に限定されることはない。また、遺伝子としては
任意の遺伝子を用いることができることは言うまでもない。
００63
例えば、標的細胞の細胞質内に物質を送達するための木発明の脂質膜構造
休を用いて、ヒトを含む哺乳類動物の生体内において標的細胞の細胞質内に
物質を放出させることができる。本発明の脂質膜構造休は標的細胞にェンド
サイ
トーシスにより取り込まれてエンドソームに封入された状態で細胞質内
に移行した後、 F の作用によりェンドソームから脱出して細胞質内に該物
質を効率的に放出することができる。例えば、この方法に従って、ヒトを含
む哺乳類動物の疾患の予防及び
F で表面修飾され
，好まし
く
又は治療を行なうことができる。例えば、
はさらにポリアルキレングリコールで表面修飾
されており，かつ医薬有効成分を内部に封入した脂質膜構造体を動物に投与
することができ，標的細胞の細胞質内に医薬有効成分を効率的に送達するこ
とができる。医薬有効成分として例えば抗腫瘍剤や核酸などを挙げることが
できるが、これらに限定されることはない。また、ヒトを含む哺乳類動物の
細胞内において遺伝子を発現させるには、 F で表面修飾され、さらに好ま
しくは
及びオクタアルギニンなどにより表面修飾されており，かつ遺伝子
を含む核酸を内部に封入した脂質膜構造体を動物に投与することができる。
好ましくは、核酸とともにカチオン性ポリマー、例えばフロタ
ミ
ンを内部に
封入した上記脂質膜構造体を用いることができ、この方法により例えぱ遺伝
子治療を行なうことができる。
００ 4
標的細胞の核内に物質を送達するための本発明の脂質膜構造休には、好ま
しくは核酸を封入することができる。以下、本発明の一例として、以下、核
酸を封入する場合について具体的に説明するが、本発明の範囲はこの特定の
態様に限定されることはない。核酸には
又は誘導体 ( 例えば，ペプチド核酸 (
)
又は
のほか，これらの類似体
やホスホロチオエー
ト
など) が
包含される。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、線状又は環
状のいずれであってもよい。核酸には遺伝子が含まれていてもよい。遺伝子
としてほ、オリゴヌクレオチド、
のいずれでもよく、特に形質
、又は
転換などのイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン
，ビ
ボで発現するこ
とにより作用する遺伝子、例えば、相同組換え用の正常遺伝子などの遺伝子
治療用遺伝子などを挙げることができる。治療用の核酸としては、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド、アンチセンス
，アンチセンス
，酵素、サイ
トカインなどの生理活性物質をコードする遺伝子のほか、遺伝子の発現を調
節する機能を有する核酸、例えば
などの
などを含む機能性核酸を用
いることもでき、これらも木明細書における核酸の用語に含める。木明細書
において「核酸」の用語は最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味に
おいても限定的に解釈してはならない。
００6
また、本発明の脂質膜構造休に核酸を封入する場合には、核酸導入機能を
有する化合物を加えることもできる。このような化合物としては，例えば、０
０
ジドデカノイルー
の
アミンクロリド、０，
トリメチルアンモニオアセチル) ジエタノール
ジテトラデカノイルー
アセチル ) ジエタノールアミンクロリド、0 ，
(び
トリメチルアンモニオ
ジヘキサデカノイルー
一トリメチルアンモニオアセチル ) ジエタノールアミンクロリド、0 ，
オクタデセノイルー
ンクロリド、0 ，０，０
(ぴ
ジ
トリメチルアンモニオアセチル) ジエタノールアミ
トリデカノイルー
イル ) アミノメタンブロミド及び
チシル
ば
ぴ
幻
トリメチルアンモニオデカノ
トリメチルアンモニオアセチル
ジド
グルタメート、ジメチルジオクタヂシルアンモニウムブロミド、2 ，
2
3 ジオレイルオキシー
ルー
スペルミンカルボキサミドエチル
フロパンアンモニウム
シフロピルー 3
Vメテル
ジメチルア
ミノ
ヒ
トリフルオロアセテート，1，
2
ミ
ジメチ
リスチルオキ
ドロキシエチルアンモニウムブロミド、3
乃
エタン) 力ルバモイルコレステロールなどを挙げるこ
とができる。これらの核酸導入機能を有する化合物は，脂質膜構造体の膜の
任意の位置に配置されていてもよく、及びノ又は脂質膜構造体の内部に充填
されていてもよい。
００ 6
核酸を封入した標的細胞の細胞質内に物質を送達するための脂質膜構造体
は、標的組織又は臓器に該核酸を送達するためのキヤリアーとして用いるこ
とができる。遺伝子発現を目的とする場合には、核酸として所望の遺伝子を
含む核酸を用い、上記の
を用いることが特に好ましい。例えば、遺伝子
を含む核酸を封入した脂質膜構造休、好ましくは
をヒトを含む哺乳類動
物に投与することにより、標的組織又は臓器の細胞に対して所望の遺伝子を
送達して効率よく発現させることができる。本発明の脂質膜構造休は、標的
組織又は臓器の細胞にエンドサイトーシスにより取り込まれた後、ェンドソ
ームから効率的に脱出して該遺伝子を細胞質内に放出することができる。投
与方法は特に限定されないが、非経口投与が好ましく、静脈内投与がさらに
好ましい。肝臓を標的とする場合には、送達効率を高めるために門脈内投与
を行うこともできる。
００6
核酸を封入した標的細胞の核内に物質を送達するための脂質膜構造体は，
標的組織又は臓器の細胞の核内に該核酸を送達するためのキヤリアーとして
用いることができる。遺伝子発現を目的とする場合には、核酸として所望の
遺伝子を含む核酸を用い、上記の
を用いることが特に好ましい。例えば
、遺伝子を含む核酸を封入した脂質膜構造休、好ましくは
をヒトを含む
哺乳類動物に投与することにより、標的組織又は臓器の細胞の核内に所望の
遺伝子を送達して効率よく発現させることができる。本発明の脂質膜構造休
は、標的組織又は臓器の細胞にェンドサイトーシスにより取り込まれた後、
ェンドソームから効率的に脱出して核内に移行し、該遺伝子を核内で効率的
に発現させることができる。標的組織や臓器は特に限定されず、表面修飾す
べき物質の種類に応じて適宜の組織や臓器への遺伝子送達を達成できるが・
特に肝臓が好ましい標的臓器である。投与方法は特に限定されないが、ョ経
口投与が好ましく、静脈内投与がさらに好ましい。場合によっては肝臓への
送達効率を高めるために門脈内投与を行うこともできる。
また、脂質膜構造休脂質には1種又は2 種以上の医薬の有効成分を封入する
００6 8
こともできる。例えば、抗ウイルス剤や抗腫瘍剤などを封入することができ
る。例えば、ウイルス性肝炎に対して有効性を示す抗肝炎ウイルス剤や肝臓
癌に対して有効性を示す抗腫瘍剤を本発明の脂質膜構造体の内部に封入して
、ウイルス性肝炎や肝臓癌の治療を行うこともできる。
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は
００6 9
下記の実施例に限定されることはない。
例1
・実験方法
1) 遺伝子封入 8
プラス
ミ
ド
F 修飾リポソームの調製
、ボルテックス中の０・0
ラス
ミ
7 4
およびフロタミンを０
プロタ
U
ミ
溶液としたのち
ン溶液に対して等量の０・
溶液を徐々に滴下することで時間をかけて混合させた
ド
。さらに、室温で０分間静置することで、プロタ
ミ
ン
プ
g
ヒ
複合体を調製し
た。
卵黄由来ホスファチジルコリン (
０００
コレステロール ( ho
h
n
ステアリル
ジオレイルホスファチジルコリン (
) ステアリルオクタアルギニン (
F
F )
ミ
あるいは巨
(3 :4: 2 : ) の脂質組成を有する 13
の脂質をクロロホルムに溶かし、ガラスチューブ内でエバポレーション
させることで脂質フィルムを作成した。上記で調製したフラス
ミ
8
ミ
ド、プロタ
ン溶液をバスタイプソニケーター内でソニケーションを行うことでフラス
ドD
をリポソーム内に封入した。
００ 1
F7
を後から修飾する場合には、上記の
脂質分) を加えた ( o s
液 ( 1 又は3
sur
「は
ace
od
を脂質フィルムの段階で修飾する場合 ( r e
，脂質クロロホルム溶液中に又は3
レーションすることで、
００ 2
2) 遺伝子封入
8
o
n ) 。また、
ca
n
u
Ⅲ分の
F
he
o
p d
「
引㎞
を加えてからエバポ
修飾リポソームの調整
F
ミ
ンからなる凝集化コアを調製した。
ホスファチジルエタノールアミン
8 あるいは
2 ０００)
2 ００ (
)
2 ０００
h
質組成を有する 13
のエタノール溶
を脂質フィルムに組み込んだ。
F
上記と同じ要領で遺伝子とフロタ
h
F
(2 : 4 : 2 : : )
F
の脂
の脂質をウロロホルムに溶かし、ガラスチューブ内
5n
でエバポレーションさせることで脂質フィレムを作成した。上記で調製した
ド、プロタ
ミ
を行うことでプラス
ミ
プラス
ミ
ロホルム溶液中に
ることで、
００ 3
ン溶液をバスタイプソニケーター内でソニケーション
A をリポソーム内に封入した。また、脂質クロ
ドD
又は3
o
Ⅲ分の
「を加えてからエバポレーションす
7 を脂質フルムに組み込んだ。
「
ィ
( ェン
3) 共焦点レーザー顕微鏡による細胞内動態解析
プラス
ミ
、
ソト (
は、
ド
us
o
us
口一ダミン核酸うベルキ
(登録商標 )
Labe
r p ・， a d s o n
)
を用いて口一ダミン修飾を行った。
e La 細胞をガラスボトムディッシュで2 4 時間培養
刊 u o rescent
Ge
nke r
(
。口一ダミン修飾プラスミド
した。細胞膜を
Lo u
ch
a
ドソーム脱出評価 )
green
にて染色した
)
s
6
の脂質濃度で細胞
封入リポソームを０・０2
。
培養物に添加して、3 7 C で 3 ０分間インキュベーションを行った。細胞をメデ
ィウムで一回洗浄後、1０「添加メディウム中でさらに2 ・5 時間インキュベ
ーションを行った。細胞を共焦点レーザー顕微鏡 (L
d
Je n a
e
r any) にて油浸対物レン X (
n
5 ０
pochr o
a
r
s
63
=
a
o
・
4)
を
用いて観察した。
００ 4
4) 共焦点レーザー顕微鏡による細胞内動態解析
F
修飾
リポソームを
o
(膜融合性評価 )
巨
(
」
7 ニトロベンゾ 2 オ
キサ
ジアゾールー4 イル ) ジオレイルホスファチジルエタノールア
3
・
励起波長4 6 ０ n
ミ
蛍光波長 534 n
と０・5
ンジオレイルホスファチジルエタノールアミン，励起波長
波長
5 9０ n )
ン，
(口一ダ
ダミン
o
ミ
55０n ;
蛍光
で 2 重染色をおこなった。ラベル化リポソームをガラスボトム子
ィツシュ上に培養した
e La 細胞に対
脂質濃度となるように接触さ
して０，０
せ、s e ru 非存在下で時間インキュベーションした。細胞を洗浄した後、新
たな s e r u 添加メディウムに交換してさらに時間インキュベーションした。
観察 1０分前に、
oe chs
33342 を
ぱ
9
の濃度でインキュベーションし、核
を染色した。細胞を共焦点レーザー顕微鏡にて観察し、画像取得を行った。
細胞内における膜融合を観察するために、
を488 n のレーザー光で励起し
～6 3 ０
488 のダイクロイックミラーを透過した蛍光を
機能により5 1０
まで分光した。子一タは、586 n の蛍光強度を1 としたときの相対値で示し
n
た
００7
5) カルセインのリリースを指標とした膜破壊効果の測定
ジオレイルホスファチジルセリン (
なる脂質フィルムを作成し、力ルセイン溶液 ( 4 ０
4) を加えた。この際、脂質濃度は０
，p
テツクス
ミ
ロマトヴラフィー
a or
5
:4
5
:０5 )
の力ルセイン
から
の
になるように調製した。ボル
キサーで混合した後、分間ソニケーションしてリポソーム内に力
ルセインを封入した。リポソームを
bo
(4
ho
)
o
e
(p
7 4 ) で平衡化した分子ふるいク
登録商標
ge
e
山
ro
o
ad La
) にかげ、力ルセイン封入リポソームを非封入力ルセイ
es
ンと分離した。
００
8及び 8
クエン酸
F ラベル化
したリポソームを上記力ルセイン封入リポソームと
ン酸バッファー (P
5 5) 又は
(
4
中で
ュベーションした。力ルセインリリースを測定するため，
。
C 、3 ０分インキ
００はのサンプル
を回収し、4 9 ０ n の励起光で5 ０ n の蛍光を測定した。０ぱの０・5
r 叶o n
０を加える前後の蛍光をそれぞれ「
及び「r 。
。として漏出した力ルセインの
割合 (
) を下記の式によって求めた。
3０
=
e ease
００7
6
F r
００
X
1０)
X
００
イン，ビボ遺伝子導入
ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードしたプラス
を使用し、
した
験を行った
on
pp 23 4
ro
０3 b p を封入
V
遺伝子導入実
323 2００4
pp 3
98 (2)
e ease
J
2００8 に記載された方法に従って調製した
０ 2346
。ジエチルエーテル麻酔下で
5
ド
マウス ( 週齢、雄性 ) を用いて
はJ
h e ・， 2 8 3
o
ミ
35０仕， 1０
(4 ０
(p
ヴルコース ) をマウス尾静脈より投与した。投与 6 時間後に肝臓、肺、脾臓
を摘出し、重量を測定した。組織を細断
y
脾臓は全量 ) を測りとり，」
㎝，p
「
。
，4 C ，
「( ０・
を添加し、Ly s
8)
s
bu
０００ rp で 1０分間遠心した。上清 2
および蛋白質量を測定し、
L
性
3
bu
・混合したのち、肝臓０・2
L
什
on
9 肺及び
０ 2
，０・
e r 中で組織をホモジナイズし
U
についてルシフェラーゼ活
加g p o e ㎞として算出した。
結果
００7 8
F の効果
1)
遺伝子封入
8 修飾リポソームのトランス
フェクション活性に及ぼす
の
F
効果について解析した。本実験で使用した2 種の脂質組成は膜融合能の低いも
のであったが、共に
F 修飾により劇的に遺伝子発現が上昇した。また、ス
テアリル基のない
(「
ree
F
、脂質膜に挿入されない) では4 倍程度の上
昇であったが、膜への挿入が可能な
5 ０倍 )
遺伝子発現の促進が認められた。さらに、
成時から導入したもの ( r e
c山
14 ０倍もの促進が認められた ( 図 )
００7 9
「を用いた場合にはより高い
On
～
1０
「を脂質フィルム作
では遺伝子発現がさらに促進し，０～
o
2 イン，ビボにおける遺伝子発現
及び3 の
8
いて
F
「修飾
8
の静脈内投与後に肝臓及び脾臓にお
の修飾により1００倍以上の高い遺伝子発現活性が認められた ( 図3 )
００8 ０ 3) 細胞内動態の解析
「を修飾した
8
のェンドソーム脱出能の評価を行った。
8修飾
のみでは、プラス
ミ
緑 ) に共局在して黄色として表示されるが (矢
修飾
より、細胞膜及びエンドソームに共局在する
立に存在する
6
赤 ) のシグナルが細胞膜やエンドソーム (
ド
「の修飾に
黄色以外にも細胞質内で独
赤 ) が認められる割合が多くなった ( 図4 ) 。このことか
7 修飾によってェンドソーム脱出が促進していることが明らかとなっ
「
ら、
た０
また、スペウトラルイメージングによって、細胞内でリポソームが膜融合
００8 1
と口一ダ
をしているか否かについて解析を行った。本解析では脂質膜上で
ミ
ンとの間で蛍光エネルギー移動が起きている。すなわち、
を励起した際
) は口一ダミンに吸収され59 ０ n を極大値にもつ
に得られる蛍光 ( 約 53 ０
蛍光として観察される。細胞内でリポソーム膜が膜融合を起こした場合には
脂質膜のミキシングが生じ、その結果として2 つの蛍光間距離が離れるために
が解消し、
F
由来の蛍光である53 ０ n の光が観測される。図5 には59 ０ n
の蛍光強度をとしたときの相対的な蛍光スペウトルを示す。F
が解消さ
れれば53 ０ n の蛍光は０・2 以上に回復するが、本実験では「修飾の有無に関
わらず53 ０ n の蛍光は低い値に維持されていた。この結果から、ホリポソー
ムは膜融合を介さずにェンドソームから脱出していることが示唆された。
００8
4) カルセインリリースを用いた
「7 修飾リポソームの膜破壊活性における
依存性の評価
カルセイン封入リポソームと 8 リポソーム及び 8
F リポソームをイン
キュベーションした際の膜破壊活性を測定した。 8 リポソームではp
p
5 において力ルセインの漏出は観察されなかった。一方、 F 7 修飾型で
ともに強いカルセインリリースが観察され，
活性を示すことが明らかとなった ( 図6)
5)
は
・
は両
００8
4
三
修飾リポソームに沿ける
「を修飾した
6 修飾
緑
o
「によるェンドソーム脱出促進活性
のエンドソーム脱出能の評価を行った。 8
8
修飾のみではフラス
によらず「は膜破壊
ミ
ド
のシグナルが細胞膜やエンドソーム (
(赤
に共局在して黄色
矢
) で観察されているのに対し，
「を修飾することにより、共局在するもの ( 黄色 )
られるフラス
ミ
によって表面に
ド
の割合が多くなった
以外に赤色単独で認め
図 ) 。このことから、 F 修飾
が修飾されている状態でもェンドソーム脱出が促進してい
ることが明らかとなった。
また、遺伝子封入 8
００84
ぼす
修飾リポソームのトランスフェクション活性に及
「の影響について解析した。
非存在下において
は遺伝子発現を
促進していた。また、この促進効果には修飾密度依存性が認められ、棚から3
に修飾密度を増やすことにより段階的な遺伝子促進効果が認められた
。また、
p
００85
例
非存在下におげる
修飾密度依存的な遺伝子発現促進効果は
修飾リポソームにおいても同様に認められた。
マルトトリオース P
6
図8
の合成
化
NaH
THF
3
4
(2 (2 (2 (2 (2 (ウンデカー 1０ェンイルオキシ) ェトキシェトキシ
2
，
ン
トキシ
ェトキシ
エタノール ( )
ヘキサエチレングリコール (15 ０ 9
5
)
に加えて，
a
トキ
０
n O
53
o
， 1・ 9 9
発生がおさまったところで、1 1 ブロモ
)
をテトラヒドロフラン (
3
ウンデセン
o
6 7
F
を加えた。水素の
，d二
・０
63
g
を入れ、窒素雰囲気下に室温で一晩反応させた。クロロホルム
， 3０ 5
7k 、クロロホルムノ飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥し
て溶媒を留去した。シリカゲルクロマトグラフィー (酢酸エチル : クロロホル
づ酢酸エチル : メタノール二
2
ム二
5
率 49
化合物 ( 1)
００
: 3) で精製を行い化合物 ( 1 を得た (6
9
００
，
9 ０， 4 ・3
とパーアセチルマルトトリオース 2 9０ 9
o
ロントリフルオリ
) に溶解し、2 ０分間撹絆後、ボ
０
を無水ジクロロメタン
・
ド，エチルエーテルコンプレックス 5 ００
) で希釈し、
1０
下、1 時間撹絆した。得られた反応液をジクロロメタン
、蒸留 7k
5０
氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (
) を加え、室温
5０
を用いて洗浄した後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶液を濃縮して
残漬をシリカゲルクロマトグラフィー
クロロホルム
て精製しアモルファス状の化合物 (2 を得た (2
００88
化合物 (2)
，d
０・4
二
・０
加
c ，紫外線照射下で
53
o
7
o ) を加えて撹絆した。これに再結晶精製
，5
76
を施したアゾビスイソブチロこトリル (
。
9， 1・6 1
) に溶解した後、チオ酢酸 (
) を「( 16
2 4 9，０・92
6
:酢酸エチル 3 : 7 に
g ・０・46
o
を加え、6 ０
。
時間、その後、6 ０c で一晩撹絆した。クロロホルム 7k
、クロロホルムノ飽和食塩水で洗浄した後、エバポレーターで溶媒を留去して
残瘡をクロロホルムに再溶解した。精製はリカゲルクロマトグラフィー (n
ヘキサンづクロロホルム : 酢酸エチル二 3 : 7) にて行い、透明アモルファス状
の化合物 (3 を得た ( ０ 94
００89
化合物 (3
００，０ 22
ウムメトキシド(2 8
した後、
，０ 68
o
) をメタノール (1０
メタノール溶液， 4
０ 8
2
が
2００イオン交換樹脂 )
) に溶解し，ナトリ
を加えた。 3 時間室温で撹押
を加えて溶液を中和し、樹脂を
濾去した後に溶媒を留去して白色固体の化合物 (4) を得た (０ 2０ 9
5
００9 ０例 3
・方法
)
０・2
o
の調製
1)
(2 3
カチオン性脂質
ジオレイルオキシ
ル
，，
，，
トリメチ
2 3 ジオレイルオキシ) フロピ
) 又は
ルアンモニウムクロライド
フロピル
トリメチルアンモニウムクロライ
) ) 及びコレステロール
ド
の2 種の脂質を含有した脂質ェンベロープに遺伝子をプロタミンで凝縮化した
コア粒子を封入
，
を調製した。べ一スの脂質組成としてカチオン佳脂
して
質とコレステロールを3 ０: ０ (モル比となるようにした。ガラス試験管に脂
カチオン性脂質及びコレステロールのエタノール溶液を総量 4 12 5
質溶液
n
2 ０
U となるように添加したのち，デシケーターで減圧乾燥すること
で溶媒を留去した。試験管にクロロホルム 25 ０
を添加して再び脂質を溶解
させたのち、子シケーターで減圧乾燥して溶媒を再留去することで脂質フィ
ルムを調製した。
コア粒子は，プラスミ
００9
した。プラス
ミ
ド
ド
とプロタ
及びプロタ
ミ
、ボルテックス中のプラスミド
ミ
ン溶液
０ 2０
g
)
比「で混合することで作製
ンをv
ンを０
溶液 (０ 3
u
12
ミ
g
p
4) 溶液としたのち
125
仕
に対してフロタ
を徐々に滴下することで時間をかけて混合
させた。さらに、室温で 1０分間静置することで、コア粒子を調製した。脂質
フィルムを調製した試験管に遺伝子コア溶液 25 ０
を添加した後、室温で 15
jU
分間静置することで水和させ、約分間超音波処理を行うことで
の粒子径はdyna
００92
h
er
Sc a
を得た。
」) によって測定した。
g
質膜への機能性素子の修飾
2
L
はマルトトリオースを
の脂質エンベロープ表面に提示する際は
」のコレステロール誘導体
( h
の2 相当量を用い、マル
又はマルトトリオースの脂質誘
) を用いた。 h
導体 ( マルトトリオースー
ル量
L
トトリオースー
6
u
」は総脂質量 ( モ
は総脂質量
モル量
の5 相当量を用いて、いずれもエタノール溶液として脂質フィルム調製時
に添抽した。マ
レ
トトリオースー
を用いた場合には、脂質膜を構成
する脂質組成をカテオン性脂質、コレステロール、マル
トトリオースー
6
を3 ０:
００ 3
5
:
モル比
となるようにした。
マルトトリオースの修飾率検討及び有用性評価のための
助
の脂質膜は、
の組成とヒとな
とコレステロールを3 ０: ０モル比
るように調製し，総脂質量 ( モル量
ここではマルトトリオースー
6
質誘導体であるラクトースー
4
の相当量の
相当量含有させることで
L を含有させた。
h
の他に比較対照としてラクトースの脂
コレステロール、及び構造中に糖を有して
を用いた。これらの脂質を総脂質量
いない
調製
の2 ・5
モル量
～
への糖の修飾率を調整した。この際、コレス
テロール含有量を調節することで総脂質量を統一した。 ( 例えば、マルトトリ
オースー
００9 4
三
合物
脂質を3 ０: 6 ０: ０モルとヒ
4 L po p
e
L
po p
e
、コレステロール、糖化
を０含有させる場合は、
6
となるようにした。
の調製
は文
載の方法 ( u
he r
ene
8
pp 1 8 4 1594 19 9
から構成されるリポソーム溶液とプラス
方法に従って
混合することで調製した。また、プラスミド
ミ
ド
D
溶液とを
に対するリポソーム量を調整
することでモル比を 2 とした。
００
ガラス試験管に脂質溶液 (
ル
のエタノール溶液
を総量 7 5 ０ n
０
2
」となるように添加したのち、デシケーターで減圧乾燥することで溶媒を留
去した。試験管にクロロホルム 2 ０
が
」を添加して再び脂質を溶解させたのち
、子シケーターで減圧乾燥し溶媒を再留去することで脂質フイ
た。調製した脂質フィルムに
(
) (P
4)
を2 5 ０
ぱ
レムを調製
」
添加し，室温で 1
し
分
放置して水和させたのち、約分間超音波処理することでリポソームを調製し
た。ボルテックス中のプラス
ミ
ド
の
(
) 溶液に対して調製したリポソー
ム溶液を滴下することで混合した後、室温で 1 分間静置することで口pop
を調製した。
pop
e
の粒子径はd y n a
G
h
Sc a
e r ng
(L
e
によって
測定した。
００9 6
5
p
p e
市販の n
の調製
V V o 遺伝子導入試薬である
V vo
e
日， 9
a c os e Co
ug a
e (o y
を用いて、添付の推奨フロトコ
s社
。フラス
ド
ミ
と
o
V
」
レに従
い
ex を調製した
引， 9 a c ose G o n U ga e の混合比である
e
ra o は、推奨値である 1０とした。
a a c ose
の5
ド
ミ
プラス
ヴルコース溶液に対して、調製した n
粒子径はdyna
c
er ng ( L
S ca
gh
6) 動物実験 (遺伝子発現評
ex を調製した。
)
(4０
を行った。ジエチルエーテル麻酔下、
ド
ぱ
bp) を封入
０3
遺伝子導入実験
V
3
g
０
は
L ０
ヴルコースをマウス尾静脈より投与した。投与 6 時間後に肝臓
4
P
ミ
マウス ( 週齢、雄性 ) を用いて
を使用し、
e の
によって測定した。
ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードしたプラス
した
，9
e
uga e の5 グルコース溶液を添加し、ボルテックスすることで
C on
混合した後、室温で 15 分間静置することで
００9
vo
V
・混合したのち、肝
，肺、及び脾臓を摘出し、重量を測定した。組織を細断
臓は０・2 9分 (肺
・脾臓は全量 ) を測りとり、Ly
r
０
2
「 on
織をホモジナイズし、 C、 3０００ r p で 1０分間遠心した。上清 2０
てルシフェラーゼ活性
」)
００
Lを添加し Lys s bu e r 中で組
p 7 8)
s
。
r (０・
bu
及び蛋白質量を測定し，
L
g pro
」
につい
n とし
て算出した。
００98
7
動物実験 (肝臓移行量評日)
脂質膜を
で標識した
を5
v
となるようにグルコースを添加す
ることで投与サンプルとした。エーテル麻酔下、4０
が
g p
44
ぱ
o
d 35０仕けマウスの条件で、マウス尾静脈より投与した。投与 6 時間後にエ
ーテル麻酔によりマウスを処置した後、開腹し、肝臓を摘出した。生理食塩
水でよく洗浄し、重量を測定した後，細断してよく混合した。細断した肝臓
０・2
～０・3
9をフラスチックバイアルに計り取り、2
Lの
ene 35０を添加し
5０。
C で一晩インキュベーションすることで組織を溶解させた。この溶液に
対して、
O
n
。
引uo r ０ Lを添加しよく混合させた後，4 C で一晩静置し、
液体シンチレーションカウンターにて
のカウントを測定した。また，
o
サンプル０ぱ Lに対してⅢ
。
０ Lを添加し、よく混合させた後、4 C で一晩静置視、同様に
のカウン
の投与量を評価するため、投与した
r
トを測定した。
００99
結果
)
脂質膜への
2
L
」及び
o
a
r s e 修飾による遺伝子発現の元進
) 及びマルトトリオース (
を含有する
・4 電位及ぴマウス肝臓における遺伝子発現
子径
評価した結果を図に示す。
: 約 28 倍、
L
の粒
(ルシフェラーゼ活性 ) を
修飾により遺伝子発現が大きく上昇した
: 約 6 倍 ) が、マル
で遺伝子発現がさらに上昇し、未修飾
8倍、
を作製し、
(
トトリオース修飾すること
に比べて
においては約 8
においては約 6 4 倍遺伝子発現活性が上昇した。
０1００ 2) マルトトリオースの修飾率検討及び有用性評価
マルトトリオース修飾率の遺伝子発現活性に及はす影響及びマルトトリオ
ースの効果を評価するために、マルトトリオースー
の範囲で変化させて
ためラウ
の遺伝子発現活性を評価した。比較の
トースの脂質誘導体であるラクトースー
していない
脂質及び構造中に糖を有
6 脂質を用いた。結果を図０に示す。マルトトリオース修飾
においては、マル
し、5
」 (2 附含有
～5
脂質の含量を０
トトリオースの修飾率に依存して遺伝子発現活性が変動
修飾時に最も高い遺伝子発現活性を示した。ラクトース修飾
では
遺伝子発現活性の上昇は認められなかった。また、マルトトリオースを持た
ない
脂質を用いた場合にほ遺伝子発現活性はほとんど変わらなかったこ
とから、マルトトリオースー
レ
質を用いた際の遺伝子発現活性の上昇はマ
トトリオースによる核移行過程の促進によることが示唆された。他の糖に
ついても同様に検討したところ、セロトリオース、マンノース、ガラクトー
ス、旧マルトース、ばマルトースのいずれについても遺伝子発現活性の上昇
は認められなかった ( 図
００1
3
日
及び 12)
の肝臓移行量評価
をマウスに静脈内投与した後の肝臓移行量を評価した。脂質膜を
で
標識した未修飾
又
ま
とマ J レトトリオースで修飾した
L
を
5 週齢、雄性 ) の尾静脈より投与し、6 時間後の肝臓における
マウス
カウントを
液体シンチレーションカウンターにて測定して肝臓移行量を評価した ( ( 図13
」
の投与量に対する臓器当たりの移行量として肝臓移行量 (
) 。
e
けを算出した。 ) において高い遺伝子発現活性を示した脂質組成である
3: ) を
ho e s ero
においても投与量の6 ０～０が肝臓に集積する結果となり、
いずれの
2
を
の基本脂質組成とした。
L とマルトトリオースで修飾することにより肝臓移行量が減少する傾
向が見られたが、有意な差は認められなかった。前項で評価した遺伝子発現
の肝臓移行量で除することで移行量当たりの遺伝子発現活性を算
活性を
出したところ、
への
修飾によって約 8 倍 (
た ( 図14
L
修飾により約倍、
臓移行量当たり
。したがって、
」及びマル
」及びマ
レト
トリオースの
の遺伝子発現活性上昇が認められ
の細胞内動態を
トトリオースが
改善することで，肝臓における高い遺伝子発現につながったことが示された
０1０3
4) 」 o p
e 投与時の肝臓における遺伝子発現
及び
遺伝子デリバリー研究において汎用されている遺伝子キヤリアとし
V
て、1
e
p
とカチオン性リポソームの複合体である口pop
とカテオン性ポリマーの複合体である
較評価を行った。使用した
ま，市販の
にした。
g
a c os e C on
uga e (
V
r ra
p
は文献を参考
遺伝子導入試薬である n
s 社 ) を用い
ra
V
vo
e
[ｱ０とした。また
としては、 ) において最も遺伝子発現活佳の高かった
L
マルトトリオー
を用いた。結果を図 5 に示す。
スー
００4
、及び2
e を用いて遺伝子導入効率の比
e x の脂質組成及び
pop
ex
三
を静脈内投与後の肝臓における遺伝子発現活性は、
ととヒ較して約 2 倍高い結果となった。特に
・L p op
投与量が０
ぱ
gと
三
e
pop
ex及び o
においては、p
の1・5 倍であったのにもかかわらず、 1０4 」
yp
の
g pro
n程度の遺伝子発現活性であった。以上の結果より，本発明の脂質膜構造休は
4０
肝臓に効率的に遺伝子を送達可能な遺伝子キヤリアであることが示された。
請求の範囲
請求項
標的細胞の細胞質内に物質を送達するための脂質膜構造体であって，
F で表面修飾された脂質膜構造休。
請求項2
脂質膜構造休がリポソームである請求項「に記載の脂質膜構造体。
請求項3
ポリアルキレンヴリコールで表面修飾された請求項 1 又は 2 に記載の
脂質膜構造体。
請求項4
ポリアルギニンで表面修飾された請求項
ないし 3 のいずれか
項に
記載の脂質膜構造体。
請求項5
送達される物質が内部に封入されている請求項「ないし
のいずれか
項に記載の脂質膜構造休
請求項6
送達される物質が核酸である請求項 5 に記載の脂質膜構造体。
請求項
標的細胞の核内に物質を送達するための脂質膜構造休であって、送達
すべき物質が内部に封入されており、3 糖以上のオリゴ糖化合物で表
面修飾された脂質膜構造体。
請求項8
オリゴ糖化合物が 3 糖化合物である請求項 7 に記載の脂質膜構造休。
請求項9
オリゴ糖化合物がグルコース 3 量体である請求項 7 に記載の脂質膜構
造体。
請求項 1０
オリゴ糖化合物がマルトトリオースである請求項 7 に記載の脂質膜構
造休。
請求項 11
脂質膜構造休がリポソームである請求項 7 ないし
０のいずれか「項
に記載の脂質膜構造休。
請求項 12
L
により表面修飾された請求項フないし
のいずれか 1 項に記載
の脂質膜構造休。
請求項 13
送達される物質が内部に封入されている請求項
7 ないし 1 2 のいずれ
か項に記載の脂質膜構造休
請求項 14
送達される物質が核酸である請求項 1
に記載の脂質膜構造休。
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
International application No.
PCT/JP2010/055493
A.
CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER
C1 2N1 5/09 (2006 . 01 ) ± A61K9/1 2 7 ( 2 0 0 6
A 61 K4 7/2 6 (2006 . 01 ) i , A 61K4 7/3 4 ( 2 0 0 6
A 61K31 / 70 88 ( 2 0 0 6
. 01 ) i ,
. 01 ) i ,
. 01 ) i
According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC
FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)
B.
C12N15/09,
A61K9/127,
A61K31/7088,
A61K47/26,
A61K47/34
Documentation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in the fields searched
Jitsuyo Shinan Koho
Kokai Jitsuyo Shinan Koho
1922-1996
1971-2010
Jitsuyo Shinan Toroku Koho
Toroku Jitsuyo Shinan Koho
1996-2010
1994-2010
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CA/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS
(STN) ,
JSTPlus/
JMEDPlus/
JST7580
(JDreamll
)
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
C.
Category*
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
KOGURE, K . et a l ., Development o f a non-viral
multifunctional envelope-type nano device by a
novel lipid film hydration method, J . Control.
Release, 2004, Vol. 98, p .317-323, particularly,
Abstract, fig. 1 , page 321, right column,
line 3 0 to page 322, right column, line 1 8
1-6
ESBJORNER, E . K . et a l ., Membrane binding of
pH-sensitive influenza fusion peptides,
positioning, configuration, and induced leakage
in a lipid vesicle model, Biochemistry, 2007,
Vol. 46, No. 47, p .13490-13504 , particularly,
Abstract, table 1 , page 13494, right column,
the last paragraph to page 13495, left column,
1st paragraph
1-6
See patent
Further documents are listed in the continuation of Box C .
*
"A"
"E"
"L"
"O"
"P"
Relevant to claim No.
Special categories of cited documents:
document defining the general state of the art which is not considered
to be of particular relevance
earlier application or patent but published on or after the international
filing date
document which may throw doubts on priority claim(s) or which is
cited to establish the publication date of another citation or other
special reason (as specified)
document referring to an oral disclosure, use, exhibition or other means
document published prior to the international filing date but later than
the priority date claimed
伍
ily annex.
" "
later document published after the international filing date or priority
date and not in conflict with the application but cited to understand
the principle or theory underlying the invention
"X"
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered novel or cannot be considered to involve an inventive
step when the document is taken alone
γ
"
"&"
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered to involve an inventive step when the document is
combined with one or more other such documents, such combination
being obvious to a person skilled in the art
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1 8 June , 2 0 1 0 ( 1 8 . 0 6 . 1 0 )
Date of mailing of the international search report
2 9 June , 2 0 1 0 ( 2 9 . 0 6 . 1 0 )
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Japanese
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Telephone No.
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C (Continuation).
Category*
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant to claim No.
JP 2004-010481 A (Mebiopharm Co., Ltd.),
15 January 2004 (15.01.2004),
particularly, paragraph [0013]
& U S 2003/0224037 A l
& EP 1369132 A l
& CA 2409795 A
1-6
JP 02-149512 A (Terumo Corp.),
0 8 June 1990 (08.06.1990),
particularly, claim 4 ; page 3 , upper right
column
& U S 5593622 A
& EP 354855 A 2
1-6
EL-SAYED, A . et a l ., Enhanced gene expression
b y a novel stearylated INF7 peptide derivative
through fusion independent endosomal escape,
J . Control. Release, 2009.09.01, Vol. 138, No .2 ,
p .160-167, [Epub 2009 May 21], entire text
1-6
A
VAN ROSSENBERG, S . M . et a l ., Targeted lysosome
disruptive elements for improvement of
parenchymal liver cell-specific gene delivery,
J . Biol. Chem., 2002.11.29, Vol. 277, No. 48,
p .45803-45810, particularly,
Abstract
1-6
A
WO 2005/032593 A l (Japan Science and
Technology Agency) ,
1 4 April 2005 (14.04 2005) ,
& U S 2007/0059353 A l
& EP 1676588 A l
& CA 2540917 A
& KR 10-2006-0080926
& CN 1863558 A
1-6
Y
P ,X
A
A
WO 2007/102481 A l (National University
Corporation Hokkaido University) ,
13 September 2007 (13.09.2007),
(Family: none)
1-6
A
WO 2006/101201 A l (National University
Corporation Hokkaido University) ,
2 8 September 2006 (28.09.2006),
& U S 2009/0305409 A
& EP 1867726 A l
1-6
Form PCT/ISA/2 10 (continuation of second sheet) (July 2009)
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
International application No.
PCT/JP2010/055493
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2.
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because they relate to parts of the international application that do not comply with the prescribed requirements to such an
extent that no meaningful international search can be carried out, specifically:
3.
Claims N 。
s ・:
because they are dependent claims and are not dra 廿ed in accordance with the second and third sentences of Rule 6.4(a).
Box No. Ill
Observations where unity of invention is lacking (Continuation of item 3 of first sheet)
This International Searching Authority found multiple inventions in this international application, as follows:
Se e
I
ext
ra
sheet
I As all required additional search fees were timely paid by the applicant, this international search report covers all searchable
claims.
2.
As all searchable claims could be searched without effort justifying additional fees, this Authority did not invite payment of
additional fees.
3.
As only some of the required additional search fees were timely paid by the applicant, this international search report covers
only those claims for which fees were paid, specifically claims Nos.:
I
I No required additional search fees were timely paid by the applicant.
Consequently, this international search report is
restricted to the invention first mentioned in the claims; it is covered by claims Nos.: 1 - 6
Remark on Protest
The additional search fees were accompanied by the applicant's protest and, where applicable, the
payment of a protest fee.
The additional search fees were accompanied by the applicant's protest but the applicable protest
fee was not paid within the time limit specified in the invitation.
No protest accompanied the payment of additional search fees.
Form PCT/ISA/210 (continuation of first sheet (2)) (July 2009)
International application No.
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
PCT/JP2010/055493
Continuation
o f Box No. Ill of continuation
of first sheet
(2)
The technical feature common to the invention o f claim 1 and the
invention o f claim 7 i s "a surface-modified lipid membrane structure".
A surface-modified lipid membrane structure such a s a liposome i s
disclosed in documents A-C.
Consequently, the common technical feature does not make a contribution
over the prior art in view o f the disclosures of documents A-C, and thus
the technical feature cannot be considered a s a special technical feature .
In addition, these inventions have no other same or corresponding special
technical feature.
The claims o f this international
following two inventions .
application therefore contain the
(Invention 1 ) the invention of claims 1-6
A lipid membrane structure which i s surface-modified
with "INF7"
(Invention 2 ) the invention of claims 7-14
A lipid membrane
structure which i s surface-modified
oligosaccharide compound comprising three or more sugars"
with
"an
Document A : WO 2005/032593 A l (Japan Science and Technology Agency) ,
1 4 April 2005 (14.04.2005) ; U S 2007/0059353 Al; EP 1676588 Al; CA 2540917
A ; KR 10-2006-0080926 A ; CN 1863558 A
Document B : WO 2007/102481 A l (National University Corporation Hokkaido
University), 13 September 2007 (13.09.2007), (Family: none)
Document C : WO 2006/101201 A l (National University Corporation Hokkaido
University) , 2 8 September 2006 (28.09.2006) ; U S 2009/0305409 A ; EP1867726
Al
Form PCT/ISA/2 10 (extra sh ㏄ t) (July 2009)
A ・
ノ
国際出願番号-
国
I 際
r 調l 査
- 報告
/
ノ
発明の属する分野の分類 ( 国際特許分類 ( I P C ) )
Int Cl
C12N15/09 (2006. 01) i , A61K9/127 (2006. 01) i , A61K31/7088 (2006. 01) i , A61K47/26 (2006. 01)
A61K47/34 (2006. 01) i
B ・調査を行 0 た分野
調査を行た最小限資料
Int Cl
C12N15/09,
(
1,
国際特許分類 ( I P C ) )
A61K31/7088, A61K47/26
A61K9/127,
A61K47/34
最小限資料以外の資料て調査を行 0 た分野に含まれるもの
日本国実用新案公報
日本国公開実用新案公報
日本国実用新案登録公報
日本国登録実用新案公報
1
1
1
1
国際調査て使用した電子テ
タ
9
9
9
9
(テ
ス
2
7
9
9
2
1 9
1- 2 0
6 - 2 0
4 - 2 0
タ
ス
9
1
1
1
6
0
0
0
午
午
午
午
の名称、調査に使用した用譜 )
CA/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS (STN) , JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII)
C ・関連する
引用文献の
カテ
ホ
Y
認められる文献
及ひ— 部の箇所か関連する
引用文献名
KOGURE,
e t a l . , Development
K.
envelope-type
J . Control.
nano device
Release,
Abstract
洋
C 欄の続きにも文献か
IJ
2004,
Fig.
挙されて
321
of a non-viral
by a novel
hydration
1 -
6
method,
-322
30
1 18
テ
ト
ア
に関する別紙を参
。
の日の役に公表された文献
ΓT 国際出願日又は優先日後に公表された文献てあ 0 て
出願矛盾するものてはな < 、発明の原理又は理論
の理解のために引用するもの
ΓX 特に関連のある文献てあて、当該文献のみて発明
の新規性又は進歩性かな
考えられるもの
ΓY 特に関連のある文献てあて、当該文献他の 1 以
上の文献 t の、当業者に
て自明てある組合に
よて進歩性かな
考えられるもの
テ
y
ト
文献
Γ& J 同
ア
国際調査報告の発送日
1 8. 0 6
2 0 1 0
2 9. 0 6 . 2 0 L0
国際調査機関の名称及ひあて先
日本国特許庁 (
ノJ P )
郵便番号 1 0 0
8 9 1 5
東京都千代田区霞か関三 T
4番3号
ノ2
film
ヴ
国際調査を完了した日
S A
lipid
multifunctional
関連する
請求項の番号
Vol. 9 , p . 317-323,
引用文献の力テ y
ΓA 特に関連のある文献てはな < 、般的技術水準を示す
もの
ΓE 国際出願日前の出願または特許てあるか、国際出願日
以後に公表されたもの
ΓL 優先権主張に疑義を提起する文献又は他の文献の発行
日若し < は他の特別な理由を確立するために引用す
る文献 (理由を付す)
ΓO 口頭による開示、使用、展示等に言及する文献
国際出願日前て、か優先権の主張の基礎 t なる出願
rp
ノI
きは、その関連する箇所の表示
る。
ホ
様式 P C T
t
1 0
(第 2
)
4 B
特許庁審査官 (権限のある職員 )
吉田
電話番号
( 2 0 0 9 午 7 月)
3 3 3 5
知美
0 3 -- 3 5 8 1 - 1 1 0 1
内線
3 4 4 8
国際出悼番号
国際洞査報告
関連すると沼められる文献
C (続き )
引用文献の
テ
Y
ESBJORNER,
fusion peptides,
positioning,
a lipid vesicle
model,
2007,
特に、 ABSTRACT
JP 2004-010481
PX
Vol. 46,
Table
1
(メヒオ
A
US 2003/0224037
Y
al. , Membrane
et
E. K.
Biochemistry,
Y
部の箇所か関連するときは、その関連する箇所の表示
及ひ
引用文献名
ホ
Al
No. 47,
13494
A.
J.
et al. , Enhanced
influenza
1-6
and induced leakage in
13490-13504,
頁右欄最終段落 -13495 頁左欄 1 段落
ム株式会社 ) 2004.
ア
01. 15,
CA 2409795
特に、 [0013]
1-6
A
1990.06.08,
gene expression
1-6
by a novel stearylated
through fusion independent
Control. Release, 2009.09.01,
1-6
endosomal escape,
Vol. 138, No. 2 , p . 160-167,
[Epub 2009
全文
May 21]
VAN R0SSENBERG,
S.
for improvement
J.
p.
EP 1369132 A l
INF7 peptide derivative
A
configuration,
JP 02-149512 A (テ
株式会社 )
特に、請求項 4 、 3 頁右上欄
US 5593622 A
EP 354855 A2
EL-SAYED,
binding of pH-sensitive
関連する
請大項の番号
Biol.
M.
et al. , Targeted
of parenchymal
Chem. , 2002.11.29,
lysosome
disruptive
liver cell-specific
Vol. 277,
No. 48,
elements
1-6
gene delivery,
p . 45803-45810,
特に Abstract
A
WO 2005/032593
A l (独立行政怯人科学技術振興機構 ) 2005. 04. 14,
US 2007/0059353
Al
KR 10-2006-0080926
A
A
CN 1863558 A
WO 2006/101201
ノ ISA ノ 2
1-6
なし)
ア
A l (国立大学怯人北侮道大学 ) 2006. 09. 28,
US 2009/0305409
様式 PCT
A
CA 2540917
WO 2007 れ 02481 A l (国立大学怯人北侮道大学 ) 2007.09. 13,
(
A
EP 1676588 A l
1-6
1 0
(第 2 -
A
EP 1867726 A l
の続き )
(2009
午 7 月)
1-6
第
請求の範囲の
欄
部の調査かてきな
・
r
ときの意見
の規定によ
怯第条第 3項 ( P C T 17条 (2) (a)
成しな
た。
ノ
国際出願番号
国際調査報告
り、
第
の
の続き
この国際調査報告は次の理由により請求の範囲の
は、この国際調査機関か調査をすることを要しな
請求項
部に
て作
対象に係るものてある。
まり、
・
ビ請求項
は、有意義な国際調査をすることかてきる程度まて所定の要件を価たして
な国際出願の部分に係るものてある。まり、
3・ r
第
請求項
従て記載されて
m欄
るよ
て P C T 規則 6・4 (a) の第
文及ひ第文の規定に
。
な
性か欠如して
発明の単
次に述
は、従属請求の範囲てあ
るときの意見
第
の
の続き
にこの国際出願に二以上の発明かあるとこの国際調査機関は詔、めた。
ジ参照
特ル
1・ r
出願人か必要な追加調査手数科をす
項に
て作成した。
て期間内に納付したのて、この国際調査報告は、す
2・ r
追加調査手数科を要求するまてもな
査手数科の納付を求めな
た。
、す
3 ・デ
出願人か必要な追加調査手数科を部のみし期間内に納付しな
付のあた次の請求項のみに
て作成した。
ての調査可能な請求項に
出願人か必要な追加調査手数科を期間内に納付しな
されて
る発明に係る次の請求項に
て作成した。
・汀
請求項 1
ての調査可能な請求
て調査することかてきたのて、追加調
たのて、この国際調査報告は、手数科の納
たのて、この国際調査報告は、請求の範囲の最初に記載
6
追加調査手数科の異議の中立てに関する住意
デ
追加調査手数科及ひ、該当する場合には、異議申立手数科の納付
追加調査手数科の納付と共に出願人
内に支払われな
ノI
S A
ノ2
1 0
(第 1
たか、異議申立てはな
の続葉 ( 2 ) )
ら異議申立てかあ
た。
たか、異議申立手数科か納付命令書に示した期間
た。
追加調査手数科の納付はあ
様式P C T
ら異議申立てかあ
共に、出願人
た。
( 2 0 0 9 午 7 月)
第 III 欄に
ノ
国際出願番号
国際調査報告
て
請求項に係る発明、請求項に係る発明は、表面修飾された脂質膜構造体 J
共通
の技術的特徴を有してる。
ししながら、表面修飾されたポソムなどの脂質膜構造体は、文献 A C に開示されて
る。
したがて、当該技術的特徴は、文献 A C の開示内容に照らして、先行技術に対する貢献
ら、当該技術的特徴は、特別な技術的特徴であるはえな。ま
をもたらすものではな
た、これらの発明の間には、ほに同一の又は対応する特別な技術的特徴は存在しな。
そして、請求の範囲には以下に示す
の発明群が含まれる。
(発明 1 ) 請求項 1 - 6 に係る発明
r I N F 7 j で表面修飾された脂質膜構造体。
(発明 2 ) 請求項 7 - 1 4 に係る発明
r 3 糖以上のオ v 糖化合物 j で表面修飾された脂質膜構造体。
文献 A : WO 2005/032593 A l (独立行政法人科学技術振興機構 )
& US 2007/0059353
2005. 04. 14,
A l & EP 1676588 A l & CA 2540917 A
& KR 10-2006-0080926
A & CN 1863558 A
文献 B : WO 2007 れ 02481 A l (国立大学法人北海道大学 ) 2007.09.13,
文献 C : WO 2006 れ 01201 A l (国立大学法人北海道大学 ) 2006. 09. 28,
& US 2009/0305409
式 PCT
ノ ISA
ノ 210
(特別
A & EP 1867726 A l
)
(2 0 0 9 午 7 月 )
(7 ァ
なし)

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