MicroRNA-31は大腸癌治療の有望なバイオマーカーとなりうる札幌医科大学医学部消化器・免疫・リウマチ内科講師能正勝彦 1 従来技術とその問題点 • 抗EGFR抗体薬は転移性大腸癌において用いられる分子標的治療薬であり、 EGFRに結合してそのシグナルを阻害し、抗腫瘍効果を発揮すると考えられている。 • 抗EGFR抗体薬の投与対象症例は限定されており、 EGFRシグナルの下流に位置し、それを活性化させる KRAS遺伝子変異がない大腸癌となっている。 • しかしながら、同シグナルを活性化する分子異常はKRAS 遺伝子変異以外にも存在するため、その感受性を予測する新たなバイオマーカーの開発が必要と考えられる。 2 大腸癌のEGFR下流シグナルにおける遺伝子異常抗EGFR抗体薬セツキシマブパニツムマブ EGF系増殖因子 EGFR（受容体）変異型KRAS がん細胞 BRAF 核細胞増殖抗EGFR抗体薬は変異型KRASをもつ大腸癌には無効である 3 EGFR下流シグナル伝達 • 近年，抗EGFR抗体薬がKRAS （codon12/13）野生型大腸癌の治療に用いられているが、KRASのminor mutation（codon61/146）に加え、NRAS、BRAF の遺伝子変異やPI3K/AKT経路で重要な働きをするPIK3CA遺伝子変異により耐性を生じると報告されている。 • よってEGFR下流のシグナル伝達経路に対する研究は分子標的薬剤における個別化医療や新たな治療標的を探索する上で重要である。 RAS RAF MEK ERK Cell Proliferation EGFR PIK3CA AKT mTOR Cell Growth 4 新規バイオマーカーとしてのmicroRNAの役割 • MicroRNA（miRNA）は21-25個の塩基からなるnon-coding RNAの一種であり、その異常は多くの癌で報告され新規バイオマーカーとして注目されている。 • しかし大腸癌のEGFR下流シグナルの遺伝子異常を制御する microRNAはほとんど解明されていない。 pre-miRNA Drosha Dicer Exportin 5 pri-miRNA unwind mature miRNA RISC 5’Cap AAAAA ORF RISC Translational repression 5’Cap AAAAA mRNA cleavage 5 大腸癌のアレイ解析によるBRAF 変異群と野生型群のmicroRNA発現 microRNA発現 No. microRNA (miR Base ID) BRAF 変異群 BRAF 野生型群 Fold change (変異群/ 野生型群) P 1 hsa-miR-31-5p 29925 89.3 335.0 0.009 2 hsa-miR-215 7.65 0.10 74.6 0.001 3 hsa-miR-151-3p 1312 24.4 53.8 0.003 4 hsa-miR-31-3p 77.3 2.14 36.1 0.002 5 hsa-miR-539-5p 370 7.57 48.9 0.021 6 hsa-miR-661 3125 91.8 34.1 0.011 7 hsa-miR-197-3p 4.78 0.16 29.2 0.002 8 hsa-miR-483-3p 605 21.9 27.6 0.032 9 hsa-miR-185-5p 15.4 0.56 27.3 0.024 10 hsa-miR-223-3p 10.5 0.40 25.9 0.005 Nosho K et al. Carcinogenesis. 2014 6 大腸癌におけるmiR-31のこれまでの報告 • MicroRNA-31 (miR-31) -5pは消化器癌だけでなく、様々な癌でその発現異常が報告されている。 Valastyan S et al. Cell. 2009 Creighton CJ et al. Cancer Res. 2010 • 大腸癌においてはその発現亢進が明らかとなっており、 oncogenicな働きをするmicroRNAと考えられている。 Cekaite L et al. Neoplasia. 2012 Goel AJ et al. Gastronterology. 2012 • しかしながら大腸癌のEGFR下流シグナルにおけるその働きや大腸癌の生命予後や分子診断のバイオマーカーとしての報告はこれまでになされていなかった。 has-microRNA-31-5p 7 大腸癌の遺伝子変異によるmiR-31発現の比較 miR-31-5p発現 (mean±SD) *P < 0.0001 148±327 63±246 37±59 BRAF 遺伝子変異群 (N=39) KRAS 遺伝子変異群 (N=202) KRAS& PIK3CA 遺伝子変異群 (N=33) 22±99 PIK3CA すべての遺伝子が遺伝子変異群野生型の群 (N=407) (N=40) 8 大腸癌のmiR-31発現による予後解析 Kaplan-Meier生存曲線 Survival probability 1.0 0.8 Log-rank P = 0.0013 0.6 0.4 低発現 Q1 Q2 Q3 Q4 miR-31-5p 発現 0.2 高発現 0 1 2 3 4 5 years Nosho K et al. Carcinogenesis. 2014 9 細胞増殖 1.8 * P = 0.0001 1.6 1.4 negative control miR-31阻害薬 1.2 * 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0h 24h 48h 72h 96h Nosho K et al. Carcinogenesis. 2014 10 抗EGFR抗体薬を投与した転移性大腸癌におけるKRAS、BRAF、NRAS 遺伝子変異の有無とmiR-31発現、無増悪生存期間との関係無増悪生存期間 Survival probability 1.0 KRAS、BRAF、NRAS いずれか一つの遺伝子変異を認める群 N = 17 (20%) miR-31 低発現群（すべて変異なし） miR-31 高発現群（すべて変異なし） 0.8 0.6 Log-rank P = 0.049 miR-31 高発現群（3遺伝子すべて変異なし） N = 6 (7%) 0.4 0.2 0 10 20 30 40 months 高発現群 N = 11 (13%) 低発現群 miR-31 低発現群（3遺伝子すべて変異なし） N = 60 (72%) N = 72 (87%) 11 新技術の特徴・従来技術との比較 • microRNA-31（miR-31）-5pは大腸癌のBRAF 遺伝子変異や不良な予後と相関し、EGFR下流シグナルを制御する可能性も示唆された。 • またmiR-31阻害薬は大腸癌細胞株を用いたアッセイにおいて有意な抗腫瘍効果を示した。 • 本来であれば抗EGFR抗体薬の効果が期待されるKRAS 、BRAF、 NRAS 遺伝子がいずれも野生型の群においてもmiR-31高発現症例はその無増悪生存期間が有意に短縮されることが明らかとなった。 12 想定される用途 • 従来の遺伝子変異解析にmiR-31-5pを加えることで、抗EGFR抗体投与例におけるより正確なコンパニオン診断の実現が期待される。 • またmiR-31は一部の大腸前癌病変でも高発現していることから糞便等を利用した超早期分子診断への応用も可能と考えられる。 13 実用化に向けた課題 • 現在、大腸癌のパラフィン包埋ブロックからのmicroRNA抽出、 miR-31の測定は可能。しかし、miR-31高発現群のカットオフの設定が未解決である。 • よって今後、更に症例数を増やし、適切なカットオフの設定を行う必要がある。 14 企業への期待 • 現在、我々が使用しているmiR-31阻害剤は実験レベルの薬剤であるため、ヒトの人体への投与可能なものに改変する必要性があり、その技術をもつ企業との提携を希望する。 • またmiR-31阻害薬の病変部位への局所的な投与を可能にするドラッグデリバリー等の技術を持つ、企業との共同研究も希望する。 15 本技術に関する知的財産権 • 発明の名称：大腸癌を治療および／または診断するための組成物ならびにその利用 • 出願番号：ＪＰ２０１４／０６５６１５ • 出願人：北海道公立大学法人札幌医科大学 • 発明者：能正勝彦、鈴木拓、山本博幸、篠村恭久 16 お問い合わせ先札幌医科大学附属産学・地域連携センター和田一葉ＴＥＬ 011 － 611 － 2111 ＦＡＸ 011 － 611 － 2282 e-mail [email protected] 17