QX100 / 200 Droplet Digital PCR (ddPCR (ddPCR) ddPCR) アプリケーション例 Keyword : CNV 増幅/ 遺伝子 / モニタリング/ 増幅 EGFR-TKI / MET遺伝子 モニタリング FFPE/cfDNA がん細胞株に がん細胞株におけるQX おけるQX Droplet DigitalTM PCR (ddPCR (ddPCRTM)を用いた MET遺伝子の MET遺伝子のCNV 遺伝子のCNV増幅検出 CNV増幅検出 近年、がん細胞内で異常に活性化した細胞増殖シグナル系の研究が加速しており、特に多くのがんで発現し ているEGFR（上皮成長因子受容体）等の受容体型チロシンキナーゼ受容体に研究者の注目が集まっています。また 既にEGFR阻害剤や抗EGFR抗体の臨床的有用性が証明されており、日本国内でも認可されています。 しかし次のターゲットとして、下流の細胞内シグナル伝達分子の変異（KRAS遺伝子変異など）、またEGFRシグナル 伝達系と細胞増殖に関して重複した機能（Redundantな）を持つ他の因子の活性化（MET遺伝子増幅等）が耐性克服 に向けた新たな標的として、最新がん研究領域の研究対象として注目されています（下図1参照）。 背景 今回、近畿大学 西尾和人先生にご提供頂いたがん細胞株 がん細胞株において、 図 遺伝子の 増幅 遺伝子のCNV増幅が起こっていることを 増幅が起こっていることをQX Droplet Digital PCR を用いて高精度に検出したデータ 用いて高精度に検出したデータについてご紹介します。 変異 増幅した MET遺伝子は、がんの増殖、悪性度に関わるがん遺伝子であり、MET遺伝 子増幅を有する肺がんはEGFR-TKIに対して耐性を獲得することが知られてい ます。また、MET遺伝子増幅を有する各種がんに対する抗MET抗体を含む分 子標的薬の有効性が検討されており、MET遺伝子の増幅の検出がコンパニオ ン診断として重要になると考えられています。西尾先生の研究室、 ゲノム生物学教室では、治療後のリバイオプシーと共に、リキッドバイオプシー による検出を試みています。ddPCRを用いたMET遺伝子増幅の検出例を示し ます。 1 MET 内容 CNV MET (ddPCR) EGFR P P MET P P P TKI P ERBB3 P P PI3K Akt アポトーシスを阻害 MET 遺伝子増幅株 遺伝子 コピー数 ÷ MET MET 遺伝子増幅株 遺伝子 コピー数 ÷ P P PI(4,5)P2 正常ヒト皮膚繊維芽細胞 遺伝子のCNVが 約 倍増幅を確認 RPP30（コントロ-ル） MET 2 .5 遺伝子コピー数 x 2 正常ヒト皮膚繊維芽細胞 MET P RPP30（コントロ-ル） 遺伝子コピー数 x 2 図2 MET遺伝子の 遺伝子のCNV算出方法 CNV算出方法 上記にMET遺伝子のCNV増幅の算出方法と、比較する 正常ヒト皮膚繊維芽細胞の算出方法を記載しました。 ddPCRでは絶対定量が行える為、このような算出が可能 となります。 Sample 図3 新たなスクリーニング方法によるゲノム編集クローンの濃縮 MET遺伝子増幅株と正常ヒト皮膚繊維芽細胞でのddPCRを用いて検出を行っ た結果を示しました。絶対定量の結果より、正常ヒト皮膚繊維芽細胞と比較し てMET遺伝子増幅株ではCNV増幅が約2.5倍であった事がわかりました。 結論 上記のデータよりddPCRを用いた絶対定量はCNV増幅検出に大変有用であり、下記の利点があげられます。 遺伝子変異や遺伝子増幅の高感度検出・モニタリングに有用 細胞・組織サンプルはもちろん、FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）サンプルも使用可能 血中cfDNA（cell-free DNA）などLiquid Biopsyにも対応可能 にも対応可能 CTC（Circulating Tumor Cell）に対しても応用可能 KRAS, BRAFなどの専用変異解析試薬も取り揃えています（詳しくは裏面に） などの専用変異解析試薬も取り揃えています（詳しくは裏面に） 関連製品： PrimePCR ＆ ddPCR KRAS マルチスクリーニングキット QX100/QX200 Droplet DigitalTM PCR (ddPCR) を用いた絶対定量用 バリデーション済みddPCR KRAS マルチスクリーニング試薬キット バリデーション済み 現在、KRAS遺伝子の変異はがん研究領域をはじめ、多くの研究者が注目する遺伝子変異の一つですが、変異遺 伝子の存在比率が小さくなるに従い、変異検出は困難さを増します。Bio-Radは、このKRAS遺伝子変異を、デジタ ルPCRを用いて高感度に検出できるキットを開発いたしました。 RAS 複数の 変異の有無が1ウェルで検出 ウェルで検出可能 検出可能 までの変異検出が可能 までの変異検出が可能 、 サンプルからも検出可能 KRAS 0.2% cfDNA FFPE ※当キットは研究用試薬 当キットは研究用試薬です。 研究用試薬です。 一般的な検出法との比較 検出法 EGFR PIK3CA P 変異検出限界 ddPCR法 1-10% ダイレクトシークエンス法 10-25% P PI(4,5)P2 P P JAK2 P Ras GTP P P BRAF BRAF Akt KRAS MEK Stat AKT1 0.2% リアルタイムPCR法 のシグナル伝達模式図 ERK mTOR Transcript ion Factor DNA Ordering information マルチプレックスキット カタログ番号 対象遺伝子 186-3506 シングルプレックスキット 関連製品 PrimePCR for ddPCR 製品リスト カタログ番号 対象遺伝子 186-3110 186-3111 186-3112 186-3113 186-3114 186-3115 186-3116 186-3117 186-3108 186-3127 186-3128 186-3129 186-3130 品名 ddPCR KRAS スクリーニングマルチプレックスキット KRAS (G12A, G12C, G12D, G12V, G12R, G12S, G13D) 品名 PrimePCR for ddPCR KRAS G12A PrimePCR for ddPCR KRAS G12C PrimePCR for ddPCR KRAS G12D PrimePCR for ddPCR KRAS G12R PrimePCR for ddPCR KRAS G12S PrimePCR for ddPCR KRAS G12V PrimePCR for ddPCR KRAS G13D PrimePCR for ddPCR KRAS A146T PrimePCR for ddPCR HRAS G12V PrimePCR for ddPCR NRAS Q61H PrimePCR for ddPCR NRAS Q61L PrimePCR for ddPCR NRAS Q61K PrimePCR for ddPCR NRAS Q61R KRAS KRAS HRAS NRAS カタログ番号 対象遺伝子 186-3100 186-3101 186-3102 186-3103 186-3104 186-3105 186-3106 186-3107 186-3118 186-3119 186-3131 186-3132 186-3133 BRAF EGFR AKT1 FGFR2 PIK3CA 価格 ¥193,000 ※各キットの定価はすべて\129,000 品名 PrimePCR for ddPCR BRAF V600E PrimePCR for ddPCR BRAF V600K PrimePCR for ddPCR BRAF V600R PrimePCR for ddPCR EGFR T790M PrimePCR for ddPCR EGFR L858R PrimePCR for ddPCR EGFR E746A750del PrimePCR for ddPCR EGFR L861Q PrimePCR for ddPCR EGFR G719S PrimePCR for ddPCR AKT1 E17K PrimePCR for ddPCR FGFR2 S252W PrimePCR for ddPCR PIK3CA E542K PrimePCR for ddPCR PIK3CA E545K PrimePCR for ddPCR PIK3CA H1047R (注) 各試薬の構成はWild typeのPrimer/Probe(HEX), MutantのPrimer/Probe(FAM), およびddPCR用supermixであり、容量は200反応分です。 当キットは研究用試薬であり、QX100/QX200 Droplet Digital PCRシステムにおける専用試薬です。対象生物種はヒトです。 FAM is a trademark of Applera Corporation. The QX100 or QX200 Droplet Digital PCR System and/or its use is covered by claims of U.S. patents, and/or pending U.S. and non-U.S. patent applications owned by or under license to Bio-Rad Laboratories, Inc. Purchase of the product includes a limited, non-transferable right under such intellectual property for use of the product for internal research purposes only. No rights are granted for diagnostic uses. No rights are granted for use of the product for commercial applications of any kind, including but not limited to manufacturing, quality control, or commercial services, such as contract services or fee for services. Information concerning a license for such uses can be obtained from Bio-Rad Laboratories. It is the responsibility of the purchaser/end user to acquire any additional intellectual property rights that may be required. バイオ・ラッド ラボラトリーズ 株式会社 ライフサイエンス 取扱店 Visit us at http://www.bio-rad.com 本 社 〒140-0002 東京都品川区東品川 2-2-24 天王洲ｾﾝﾄﾗﾙﾀﾜｰ TEL:03-6361-7000 FAX:03-5463-8480 大阪営業所 〒532-0025 大阪市淀川区新北野1-14-11 第一生命ビル TEL:06-6308-6568 FAX:06-6308-3064 福岡営業所 〒812-0013 福岡市博多区博多駅東2-5-28 TEL:092-475-4856 FAX:092-475-4858 TEL:03-6404-0331 FAX:03-6404-0334 学術的お問い合わせは * ※価格(税抜き）、仕様などは予告無く変更することがありますので、ご了承ください。 ※価格は2015年5月現在のもので、メーカー希望小売価格（税別）です。 ※本カタログに記載されている会社名、商品名は各社の商標または登録商標です。 Z10720 1505A
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