成 膜 大 学 理 工 学研 究 報 告
J.Fac.Sci.Tech,SeikeiUniv.
Uo1.48No.2(20--)pp.59-62
(新 任 者 の 論 文)
ホ ス ホ リパ ー ゼ を用 い た機 能 性 化 合 物 の リン脂 質誘 導 化 法 に 関す る研 究
山本
幸 弘*1,細
川
雅 史=z,宮
下
和 夫娼
Studyonphosphatidylationoffunctionalcompoundsusingphospholipases
YUkihkoYAMAMOTげlMasashiHOSOKAWパ2KazuoMIYASHITA.3
,,,
ABSTRACT:HereIdescribeaboutthephosphatidylationoffunctionalcompoundsusingphospholipases
whichiscoveredwithmydoctoralthesis.Physiologicallyactivecompoundsuchasconjugatedfattyacid,
terpenesandphenoliccompoundssometimeexerttheiractivitynotfullybecauseoftheirpoorsolubilityin
acertainenvironment.Ontheotherhand,phospholipidshavecharacteristicamphiphilicpropertyand
biocompatibility.Inthisstudy,severalphysiologicallyactivecompoundswerephosphatidylatedusing
phospholipasessuchasphospholipaseA2andphospholipaseD.Theenzymaticreactionwasmodifiedand
optimizedfortheyield.Inaddition,thephosphatidylatedcompoundsweretestedfortheirphysiological
activityinvitro.Conjugatedlinoleicacidswhichhaveanti-obesityeffectswerephosphatidylatedrnediated
byphospholipaseA2.Inthisreaction,itisfundthatwatermimicssuchasformamidewaskeyfactorfor
thesyntheticreaction.Severalterpenesandphenoliccompoundswhichhaveanti-cancereffectsor
anti-oxidativeeffectswerephosphatidylatedmediatedbyphospholipaseD.Somephosphatidylated
compoundswereexertedhigheranti-cancereffectscomparetoparentcompounds.
Keywords:phospholipid,phospholipase,conjugatedlinoleicacid,terpenes
(ReceivedSeptember21,2009)
1.は
じめ に
質 誘 導 化 す る た め の 新 規 反 応 プ ロ セ ス の 開 発 と,得
られ
た リ ン脂 質 誘 導 体 の 機 能 性 評 価 に 関 して 研 究 を行 っ た 。
抗 酸 化 作 用 や 抗 癌 作 用 な どの機 能 性 を有 す る化 合 物 を
そ の 際,生
体 触 媒 で あ るphospholipaseAZ(PLAZ)や
食 品 成 分 や 化 粧 品 素 材,医 薬 品 と して 用 い る場 合,乳 化
phospholipaseD(PLD)と
剤 等 を併 用 す る こ とで 分 散 性 や 安 定 性,吸 収 性 を高 め る
用 し,温 湘 な 環 境 で 特 異 的 な 反 応 を簡 便 に 進 め る 方 法 に
必 要 が あ る。 しか し,そ れ に よ って利 用 用 途 が 制 限 され
っ い て 検 討 した 。
い っ た リ ン脂 質 関 連 酵 素 を利
る こ とも少 な くな い 。 そ の た め機 能 性 化 合 物 に 両 親 媒 性
を付 与 す る こ とが 出 来 れ ば 幅 広 い利 用 が 可 能 とな る。 こ
の 様 な機 能 性 改 善 の 手 段 の 一 っ と して,ア
1.共
役 リノ ー ル 酸 含 有 ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リン の 合 成
シル 化 や リン
酸 化 等 の 誘 導 化 が 挙 げ られ,そ れ に よ って 分 散 性 や 吸 収
抗 癌 作 用 や 抗 肥 満 作 用 を有 す る こ と か ら機 能 性 脂 肪 酸
性 を大 き く改 善 出 来 る。
と して 近 年 注 目 され て い る 共 役 リ ノ ー ル 酸(CLA)に
着 目
本研 究 で は,優 れ た 生 体 適 合 性 と両 親 媒 性 か ら医 療 品 や
し1.司,PLAZを
有 ホ
機 能 性 食Poo,化 粧 品 素 材 と して 広 範 に利 用 され て い る リ
ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン(CLA-PC)の
ン脂 質 の 分 子 構 造 に 着 目 し,種 々 の機 能 性 物 質 を リン脂
PLAZを
用 い た エ ス テ ル 化 反 応 に よ るCLA含
合 成 を 試 み た 。 特 に,
用 い た エ ス テ ル 化 反 応 で は,副
反 応 で あ る加 水
分 解 反 応 を制 御 す る反 応 系 中 の 至 適 水 分 量 の 調 節 が 非 常
*1:理
工 学 部 助 教(yyamamoto@st
.seikei.ac.jp)
に 難 しか っ た た め,必
:z・ 北 海 道 大 学 大 学 院 水 産 科 学 研 究 院 准 教 授
*3・ 北 海 道 大 学 大 学 院 水 産 科 学 研 究 院 教 授
一59一
須 水 代 替 物 と してformamideを
用 し たCLA-PCの
合 成 を 試 み た 。 ま ず,ブ
PLAZ(ppPLAZ)を
用 い て,glycerolを
利
タ膵 臓 由来
分 散 媒 と して用 い
た 反 応 系 に てCLAと
(と
卵 黄 由 来lysophosphatidylcholin
CLA18g,glycerolmg,ppPLA3.3x104,CaC12
formamide,mmol
0.ｵmol,370C,48の
反 応 条 件 に お い て,酵
化 す る 目 的 で 水50ｵ1或
い はformamide雌
合 成 を 試 み た と こ ろ,水
率 が 僅 か に201%で
素 を活性
添 力口し
2.機
脂 肪 酸組 成
質 と し て 用 い たCLAの
の 脂 肪 酸 組 成 比 で あ っ た こ と よ り,LPCのsn-2位
合 成 率 に 及 ぼ すformamide添
加 量 やglycerol添
加 量 の 影 響 を 検 討 して,至
約 半分
ス フ ァ チ ジル 基 転 移 反 応 を様 々 な機 能 性 化 合 物 に応 用す
に特異
る 為 に は,様
々 な アル コール 化 合 物 を基 質 と して用 い て
反 応 特 性 を 明 らか にす る 必要 が あ る。 そ の よ うな観 点 か
ら,本
加 量,
研 究 で は これ ま で 報 告 例 の な い テ ル ペ ン ア ル コ ー
ル 化 合 物 や フ ェ ニ ル ア ル コー ル 化 合 物 に 着 目 し,そ
適 反 応 条件 を
れ ら
の ホ ス フ ァ チ ジル 基 転 移 反 応 につ い て検 討 した。
11g,CLAmg,glycerolg,ppPLAz3x104
U,formamideOｵ1,CaCl2ｵmol,370C,6と
PLDを
し
た 。そ の 至 適 反 応 条 件 に お い て は6501%の
記,反
用 い た ホ ス フ ァチ ジ ル 基 転 移 反 応 に よ る機 能
性 ア ル コー ル の リ ン 脂 質 誘 導 化 法 に つ い て 検 討 し た 。 ホ
導 入 さ れ て い る こ と が 示 さ れ た 。 更 に,
た 。 し か し,上
能 性 ア ル コ ー ル の リ ン脂 質 誘 導 化
PLDを
な り,大 幅 に 合 成 率 が 高 ま る
析 し た と こ ろ,基
ppPLA2添
at°C
を 用 い た 系 で は 合成
こ と が 明 ら か と な っ た 。 得 られ たCLA-PCの
的 に 基 質CLAが
z,deaction
あ っ た 。 そ れ に 対 し,formamide
を 用 い た 系 で は4601%と
をGC分
cerol,3x104LAz,ｵ
CLA-mixture,50
の エ ス テ ル 合 成 反 応 を 行 っ た 。LPClg,
CLA-PCの
e:1LPC,
ofeaction
合成率を得
応 条 件 で は 反 応 時 間6以
用 い た ホ ス フ ァ チ ジ ル 基 転 移 反 応 は 一 般 に,水
と ク ロ ロ ホ ル ム な ど の 有 機 溶 媒 と の2相
降では
系 に よ り行 わ れ
る が7冒ll),そ の よ う な 有 機 溶 媒 の 使 用 は 工 業 的 応 用 を は
合 成 率 の低 下 が 見 られ た 。 そ の 要 因 と して 大 気 中 か ら吸
か る 際,安 全 面 で 問 題 点 と な る 。そ こ で 大 豆PCoypc)
湿 さ れ る 水 分 や,エ
と テ ル ペ ン ア ル コー ル と の ホ ス フ ァ チ ジ ル 基 転 移 反 応 で
ス テ ル 合 成 反 応 の 進 行 に よ り生 成 し
た 水 が 加 水 分 解 反 応 を 充 進 し た と 推 察 し,albuminや
は,酢 酸 エ チ ル と0.2M酢
caseinな
び,0.2M酢
ど の タ ン パ ク 質 を 添 加 す る こ と に よ りPLA2近
酸 緩 衝 液(pH6)と
酸 緩 衝 液(pH6)に
の2相
基 質 を 分 散 させ て 反 応 を
傍 に 存 在 す る 過 剰 な 水 分 の コ ン トロ ー ル を 試 み た 。 そ の
行 う水 系 に て 試 み た 。 反 応 系 に 及 ぼ すgeraniol1の
結 果,前
加 量 の 影 響 と酵 素 添 加 量 の 影 響 を 検 討 し,合
述 の 反 応 系 にalbumingを
添 加 す る こ と で,
合 成 率 の 低 下 を 抑 え る こ と が 可 能 と な っ た(Fig.。
酵素
的 測 定 を 行 い 最 終 的 に 至 適 反 応 条 件 を2相
以 外 の タ ンパ ク質 を 添加 す るだ け で 合 成 率 を維 持 で き る
ｵmol,基
結 果 は,水
Streptomyces.由
分 の 調 節 が 困 難 で あ っ たPLA2を
用 いたエス
質 ア ル コ ー ル5ｵmol,酢
酸緩
の 調整 や減 圧 下 で の 反応 で は 最 終 的 な 収 率 を 高 め る こ と
基 質 ア ル コ ー ル2000ｵmol,ssPLDI.6,0.2M酢
は 可 能 で あ る が,反
衝 液(p5.6).81,370C,24と
便 で あ るの み な ら
系;Soypc
酸 エ チ ル1.61,
衝 液(p5.6).81,370C,24,水
タ ン パ ク 質 の 添 加 に よ る 反 応 法 は,簡
添
成 率 の経 時
来PLDPLD)6,0.2M酢
テ ル 化 反 応 に お い て 極 め て 有 用 な 知 見 で あ る。 水 分 活 性
応 初 速 度 が 低 下 す る。 そ れ に 対 し て
系及
系;SoyPCｵmol,
酸緩
定 め た。 この反 応 条
件 に お け るphosphatidyl-geraniolの
合 成 率 は2相
あ っ た の に 対 し 水 系 で は9001%と
系では
ず そ の 吸 水性 が 反応 速 度 に影 響 を 及 ぼ さな い 点 が利 点 で
5201%で
あ る こ とが 示 され た 。
ル ペ ン ア ル コー ル の リ ン 脂 質 誘 導 化 で は 水 系 が 適 し て い
る こ と が 明 ら か と な っ た 。 一 方,フ
70
リ ン 脂 質 誘 導 化 は,Soypcを
GU
ル と0.2M酢
50
ェ ニル アル コール の
基 質 リン脂 質 と し酢酸 エ チ
酸 緩 衝 液(pHと
の2相
ァ チ ジ ル 基 転 移 反 応 を 行 っ た 。Tyrosol8)の
0
°
一
_ao
響 を 検 討 す る と と も に,合
7sn
結 果,至
い
な り,テ
系 に よ りホ ス フ
添加 量 の影
成 率 の経 時 的変 化 を測 定 した
適 反 応 条 件 をSoyPCｵmol,酢
酸 エ チ ル1.
2U
ml,基
質 ア ル コ ー ルｵmol,U,0.2M酢
10
酸 緩 衝 液(pH.8ml,370C,24の
U
O
RO
204060
よ うに 定 め,こ
の 反 応 条 件 に お い てphosphatidyl-Tyrosolの
合 成 率 は87
「1馳i曹11e(1馳)
±mol%に
TimeurseynthesisdiatedyZ
次 い で,至
ine(closedymbol)absenceenedymbol)
達 した。
適 反 応 条件 にお い て各 種 基 質 アル コール を
用 い 合 成 率 を 比 較 し た と こ ろ,基
・1
質 テル ペ ンアル コール
3.リ
の 鎖 長 が 長 く な る 程 合 成 率 が 低 下 す る こ と,
alcohol5やmyrtenol6の
ン脂 質誘 導 隊 の機 能性 評 価
よ うな 分 子 内 に 環 状 構 造
を 有 す る テ ル ペ ンア ル コー ル もホ ス フ ァチ ジ ル 基 転 移 反
応 の 基 質 に な り得 る こ と を 明 ら か に し た 。 ま た,フ
合 成 され た 各 種 リ ン 脂 質 誘 導 体 に つ い て 機 能 性 評 価 を
ェニ
行 っ た 。 特 に ヒ ト癌 細 胞 株 を 用 い た 増 殖 抑 制 試 験 や
ル ア ル コー ル の ベ ンゼ ン環 か らホ ス フ ァチ ジ ル 基 に 置 換
DPPHラ
され る一
〇H基 ま で の 距 離 が 合 成 率 に 大 き く影 響 を 与 え る
な らび に抗 酸 化 作用 を評 価 した。
の に 対 し,P一 位 の 置 換 基 は そ の 種 類 に よ らず ほ と ん ど反
ジ カ ル 捕 捉 能,酸
化 安 定 性 を 指 標 に,抗
ヒ ト白 血 病 細 胞(HL-60)の
細胞 増殖 に対す るテルペ ン
アル コール 及 び そ の リン脂 質 誘 導 体 の影 響 を調 べ た と こ
応 に 影 響 を 及 ぼ さ な い こ と が 明 ら か に な っ た(Fig.。
ろ,母
(A)(B)
化 合 物 で あ るgeraniol,perilly(5),
myrtenol,nerolは400μMで40%程
T}'rosol(1)
BA(胃)
hTy璽'osol(5)
1'±3.'11101°0
(luohヒahve
64±Ssnrol°o
果 で あ っ た の に 対 し,そ
度 の増 殖 抑 制効
の リ ン 脂 質 誘 導 体 で は100μM
で 生 細 胞 数 が コ ン ト ロー ル の20-30%ま
HO
VO`^^'OH/v
◎ 〈OH
℃r>ox
4APE(a)
3PIA(3)
2.2rlPE(11)
90{'_3nml°o
(luahヒatlve
qualitative
◎
が 明 ら か と な っ た(Fig.。
ク ラPCを
aPB.a(9)
qualitative
PE.a(G)
S5±1.Onml°o
σ
伊
へ>OH
な く と も 部 分 的 に は ア ポ トー シ ス を
誘 導 す る こ と で これ ら の 増 殖 抑 制 が 起 こ され て い る こ と
lV
へ/pox
キ ス ト染 色 に よ り ア ポ トー シ ス 細 胞 が 観 察
され た こ と か ら,少
/ox
.〔γ>ox
で 減 少 し,リ ン脂
質 誘 導 化 す る こ と で 抗 癌 作 用 が 増 強 され る こ と が 示 され
HO
た 。 ま た,ヘ
H;N
癌 作用
23nlPE(12)
qualitative
さ らに 不飽 和脂 肪 酸 に 富 む イ
基 質 リ ン 脂 質 と し て 得 られ たTyrosol8)の
脂 質 誘 導 体 は,基
質 リ ン 脂 質 に は 無 いDPPHラ
リン
ジカ ル 捕
捉 活 性 な ら び に 酸 化 安 定 性 を 有 す る 新 規 リ ン脂 質 で あ る
ox
ox
こ と が 明 ら か と な り,誘
導 体 が優 れ た供 給 形 態 で あ る こ
と が 示 され た 。
qualitative
◎<< ㎝
層(且3)
げ
.、
B
)
ー
2PIP亘
qualitative
(
5PIPe(10}
一〇H
(D)
(c)
4HBA(2}
2nIlP2Pr(1{)
quah吐ahve
qualitative
HO.◎
〈ox
酬
OH
堅
HQ(;)
13±1.3tool°o
HOox
1P2Pl'(14}
quahta童i、'e
Fig.escenceyeng
treatedosphatidylated
c∩/OH
Specificity
phosphatidylation.yield,A);
yield,yield,"Qualitative"
(PBS),SoyPC,
enylalcohols
phosphatidyl-perilly(E)
ayield,
phosphatidyl-nerol.ere
mediatamingindi
eanshatyield
wastativelyatedyTL
一61一
alcoho
yl-geranio
yl-myrtenol,
culture
4.む
す び
LR.
Kinetic
T.
ion
aluation
ylethanolamine
t
e
Different
es.imi
ysicacta
機 能性 成 分 を リン脂 質 へ誘 導 化 した研 究 例 は い くつ か あ
るが,得
られ た誘 導 体 に 対 し,実 際 に機 能 性評 価 を した
研 究 は 少 な か った 。 本 研 究 に よ りPLA2及
びPLDを
LR.eT.Kazuoka,oT.amane,
Shimizu:Phosphatidylcho
用い
た機 能性 化 合物 の リン脂 質誘 導化 法 を確 立 し,そ れ に よ
Phosphatidylserineyarious
ore.ys
り得 られ た リ ン脂 質 誘 導 体 の 新 規機 能 性 を 見 出 した 。
Acta
,
Y.T.amane:senzy
参考文献
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In"Lipidy"y
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oyl-CoA
desaturaselexpressionzyme
andiophysical
Nagano,ata,
ang
Yanagita:
events
essentialypertension
hypertensivets.emicald
eously
ysicalesearch
Communications
Y.,
right,.Liu,M
and
fect
body
acid
n
Wang,e,
Y.T.
Noda,
T.anagita:
lOtrans,
promotes
aNutrition
gyetabolism
19,
KM.
grave,
Y
conjugated
coconut
body
loss
deficiency.
miindependent
induced
ialattacid
chimicaysica
LR.
agT.a
Shimizu:
Y
phosphatidylcholine
atidylglycerol
D
Enzyme
and
ycabbage
sy
Technology
一62一
ylcholin
y
to
以 上,著 者 の 学位 論 文 に 関 して,概 略 を ご紹 介 させ て
い た だ い た。 す ぐれ た 両 親 媒 性 と生 体 親 和 性 に 着 目 し,
amane,
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