陽子線・ヘリウム線による脳壊死モデル作成技術の確立 －放射線脳壊死のメカニズム解明と治療法開発を目指して－ 研究概要 脳腫瘍の治療では、放射線治療が非常に重要な役割を果たしている。しかしながら、放射線 照射により正常組織に障害が生じる場合がある。その中で、照射の6か月以降に生じる晩期 有害事象である脳壊死については、未だ治療法が確立されておらず、発生した場合、まひな どの重篤な障害が生じてしまう。放射線治療の効果が期待される症例であっても、脳壊死に よって患者の生活の質（Quality Of Life；QOL）が著しく低下することになる。 本研究では、脳壊死のメカニズム解明と治療法開発のために、陽子線・ヘリウム線を用いた 脳壊死モデル作成技術の確立を目指して、以下の内容を実施した。 モデル作成に適した照射技術・条件の検討 小動物用ＭＲＩと病理組織による脳壊死形成の確認 研究成果 陽子線・ヘリウム線で拡大ブラッグピークを形成 陽子線 し、マウス右脳の脳表から5mmの部分に40、50、 ヘリウム線 60 Gyを照射した(右図）。 60 Gyを照射したマウスのほぼすべてにおいて、 照射後1～3か月の間に、MRI画像で右脳の白質 脳表から に照射に起因する明らかなT2 high intensityの変 5ｍｍまで 化を認めた(下図左）。 これらのマウスの脳の病理組織では、MRIでT2 high intensityを呈した白質部分に一致して著 明な浮腫、静脈の拡張、微小血管の増加を認めた（下図右）。これらは、臨床的脳壊死に付随 して見られる所見である。 50 Gy群では4～5か月後にMRIで変化が認められた。40 Gy群では6か月経過してもMRI、病理 組織ともに明らかな変化は認めず、10か月後にMRIでT2 high～low intensityの変化が現れた。 ＭＲＩ画像（Ｔ２強調） ２.２か月後 左 １.７か月後 微小血管の増加 右 左 右 静脈の拡張 右 左 浮腫 脳の病理組織（ＨＥ染色） （拡大図） まとめ 60 Gyを照射したマウスにおいて、臨床的脳壊死に付随してみられる所見である脳浮腫、静脈 の拡張、微小血管の増加が認められた。しかしながら、臨床で見られるような決定的なフィブリ ノイド壊死は今回は認められなかった。 現在、40 Gy、50 Gy群で照射後10～11か月経過したマウスにおいて、MRI画像に著明な変化 を認めてきている。今後は、これらの群でさらに脳壊死が起こってきているかどうかを、病理学 的に検討する予定である。 研究名「陽子線・ヘリウム線による脳壊死モデル作成技術の確立 近藤夏子、櫻井良憲、田中浩基 （京都大学） －放射線脳壊死のメカニズム解明と治療法開発を目指して－」 高田卓志、久米恭 （若狭湾エネルギー研究センター) 研究名 陽子線・ヘリウム線による脳壊死モデル作成技術の確立 －放射線脳壊死のメカニズム解明と治療法開発を目指して－ 研究責任者 近藤 夏子 1 共同研究者 櫻井 良憲 2，高田 卓志 3，田中 浩基 2， 楢林 正流 1，渡邉 翼 1，久米 恭 3 1 2 3 京都大学原子炉実験所 粒子線腫瘍学研究センター 京都大学原子炉実験所 放射線医学物理学研究分野 若狭湾エネルギー研究センター 粒子線医療研究グループ 目 1． 研究の背景 2． 本研究の目的 3． 実験方法 4． 実験結果 5． まとめ 次 1. 研究の背景 脳神経外科領域では、原発性脳腫瘍を初め、特に転移性脳腫瘍の治療において、放射線治療が 非常に重要な役割を果たしている。しかしながら、治療に伴い、放射線照射による急性障害（吐 き気、頭痛、脱毛、皮膚炎など)および晩期障害（脳壊死、骨壊死など)が見られることがある。 放射線照射による急性の有害事象については、出現しても対応可能な場合が多いが、放射線治 療後 6 か月以降に生じる晩期有害事象である脳壊死については、その発生が不可逆的であり、未 だ治療法が確立されていないのが現状である。 放射線治療の効果が期待される症例であっても、脳壊死が生じた場合、まひなどの重篤な障害 が生じ、患者にとって深刻な事態となり、生活の質（Quality Of Life；QOL）を著しく低下させ ることになる。 放射線治療後の脳壊死の進展には、活性酸素（Reactive Oxygen Species；ROS)（フリーラジ カル、スーパーオキシド、過酸化物など）が関連している可能性がある。 ROS は平常時にもほとんどの組織で産生されているが、放射線照射を受けると産出量が著しく 上昇する。さらに、放射線により血管が障害を受けた組織では、組織が低酸素状態になることで、 ROS が持続的に産出されるようになる。他の組織と比べて脳のグリア細胞、神経細胞では抗酸化 酵素が低レベルであり、脳は酸化ストレスに弱いこと マイクロ グリア が知られている。ROS による慢性的な酸化ストレスが 血管 マイクログリアと免疫細胞を活性化し、炎症反応を引 き起こす。炎症によりさらに ROS が発生し、より一層 これらの細胞を活性化し、酸化ストレスが維持、増強 グリア細胞、神経細胞 放射線 されることで症状が進展すると考えられる（図１）。 ROS マイクロ グリア 脳壊死と、照射後の血液中のフリーラジカル量など 血管 活性酸素の変化に関係があるかどうかを調べること で、有害事象の発症をある程度予測できる可能性があ る。また、ROS の捕捉剤を投与することで脳壊死の治 療効果が得られる可能性がある。 活性酸素 （ROS） ・，H2O2 ，OH など） ・- （O2 マイクロ グリア この関係を見いだすためには、ラットおよびマウス の脳壊死モデルの作成が必要不可欠である。これまで に様々なグループが脳壊死モデルの作成を試みてい る。しかしながら、未だ技術的に確立されておらず、 成功した例はほとんど報告されていない。放射線医学 総合研究所の研究グループにより、陽子線および重粒 子線を利用した成功例が報告されているが、本研究で 目指す病理組織学的に臨床症例に見られるような脳 壊死モデルを作成できているかどうかは不明であり、 その点も含めた技術確立が必要不可欠である。 低酸素状態 ROS マイクロ グリア ROS 図１ 放射線 壊死 炎 症 マイクロ グリア ROS 放射線壊死 脳壊死と活性酸素との関係（仮説） 2. 本研究の目的 本研究では、放射線治療で生じる可能性のある脳壊死のメカニズム解明と治療法開発を目指し て、陽子線およびヘリウム線を用いてラット/マウスの脳の局所照射を行い、線量と脳壊死との 関係を明らかにすることにより、脳壊死モデル作成技術を確立することを目的とする。 3. 実験方法 研究責任者らは、平成 24 年度より、若狭湾エネルギー研究センターとの共同研究「加速器中 性子捕捉療法基礎研究（陽子線を利用したラット・マウスの脳壊死モデルの構築）」において、 単一エネルギーの粒子線を用いて脳壊死モデル作成のための予備実験を行ってきた。この中で得 た知見、および、放射線医学総合研究所グループによる成功例について関係者から得た情報など をもとに照射条件等を検討し、以下の方法で実験を実施した。 ① 照射野形成 若狭湾エネルギー研究センターのシンクロトロンにより加速した 70 MeV の陽子線および 220 MeV のヘリウム線を使用した。照射体系は、ビーム量モニタ、スライド式拡大ブラッグ ピーク形成装置、エネルギー調整用プラスチック板、コリメータから構成した（図２）。 予備実験では単一エネルギーの粒子線を用いたため、ブラッグピークの幅が狭く、生体内 で高線量となる体積が十分でなかったことが示唆された。そこで、粒子線のエネルギーを変 化させて拡大ブラッグピーク（Spread Out Bragg Peak;SOBP）を形成し、照射に用いること とした。 SOBP 形成には、マイラーフィルムを積層して水 0～5 mm 相当となるように数段階の厚さに したものを用意し、これらを照射中に順次スライドさせていく「スライド式 SOBP 形成法」 を用いた（図３）。マイラーフィルムが厚いほど、生体内でのブラッグピーク位置が入射面 方向にシフトする。陽子線については、500 μm ずつ厚さが増すように 6 段階、ヘリウム線 については、300 μm ずつ厚さが増すように 12 段階の SOBP 形成装置を作成した。計算によ り求めた単一エネルギーの粒子線に対する線量分布を用いて、深さ方向に平坦な分布となる ように各段のビーム量を調整した。 深さ方向の線量分布の調整代を考慮してシンクロトロンからの出射エネルギーを高めに 設定し、水に近い電子密度を有するプラスチック板（ソリッドウォータ）等、厚さが可変で ある減速体を通過させてエネルギーを微調整した。後述の照射条件を満たすように、ブラッ グピークの位置をマウスについては約 4 mm、ラットについては約 7 mm となるようにプラス チック板の厚さを調整した。 厚さ約 5 mm の真鍮板で作成した矩形コリメータを使用して照射範囲を制限した。半脳照 射の場合は 10×5 mm、全脳照射の場合は 10×10 mm のコリメータを使用した。 線量測定には平行平板型の電離箱を使用した。この電離箱の測定値とビーム量モニタ計数 を値付けし、設定線量でビーム停止するようにした。 コリメータ ＋ アクリル板 金属ワイヤー エネルギー調整用 スライド式SOBP プラスチック板 形成装置 ビーム量 モニタ マウス 陽子線 または ヘリウム線 コントローラ （遠隔操作） 図２ 図３ ② ビーム制御系 陽子線・ヘリウム線の照射体系 スライド式拡大ブラッグピーク（SOBP）形成装置 マウスへの照射 初年度は、実験動物として取扱が比較的容易であるマウスを使用した。照射中のマウス頭 部の固定には、アクリル板に先端を環状にした金属ワイヤーを固定し、この環にマウスの前 歯を引掛ける手法を採用した（図２）。 照射領域について、放射線医学総合研究所グループによる脳壊死モデル作成の知見から、 以下の条件とした（図４）。 パーキンソン症状の発症を抑えるため、粒子線の到達深度は、マウスについては脳表 から深さ 5 mm までとする。 鬱および摂食障害を防止するため、照射野内に嗅球を入れない。 マウス頭部 （頭頂から見た図） 嗅球 マウス脳断面 脳表から 5 mmまで 鼻 約10 mm 図４ 脳壊死モデル作成のための照射条件（マウス） （赤色の領域を避けて照射する） これらの条件を満たすように、プラスチック板によるエネルギー調整、および、マウスと コリメータの位置関係の調整を行った。 放射化を利用した照射範囲の確認を次の方法で試験した。右脳に照射した直後のマウスを サクリファイスし、頭側および尾側の脳切片を作成した。イメージングプレート（IP）に切 断面を接触させて、数十分露光した後、IP 読取装置で画像を取得した。照射による放射化が 強い部分では、IP 読取画像で黒く写る。IP 上の脳切片の設置位置と読取画像の濃淡から、 照射範囲を確認した。 当初計画では、投与線量を 40 Gy に固定し、脳壊死が形成されるかを確認する予定であっ た。しかしながら、次節の実験結果に記述したように、MRI による経過観察では 5 か月経過 しても明らかな変化が認められなかったことから、投与線量として 50 Gy と 60 Gy の右脳照 射群（一部は全脳照射）も作成した。 陽子線については 40、50、60 Gy の線量をそれぞれ 10 匹程度、ヘリウム線については同 線量をそれぞれ 4 匹程度照射した。 ③ 照射後の観察 照射後、1、2、3、6 か月後を目安に、京都大学放射性同位元素総合センターに設置されて いる動物用 MRI 装置を用いて経過観察を行った。MRI 撮像では T2 強調画像を取得した。T2 強調画像では、脳壊死に付随する症状である浮腫などの病変が高強度を呈する。また、経過 観察中に死亡したマウスについて、脳をホルマリン固定し、組織切片を作成し、HE 染色によ り観察した。 4. 実験結果 (1) 照射技術に関する検討 前節の実験方法に記述した方法でマウス用の照射野を形成し、照射野形状と線量分布を測 定した。図５に、フィルムを用いて測定した照射野形状を示す。コリメータにより照射範囲 が目標通りに限定されていることが確認された。図６に、SOBP 内の線量測定値を、線量分布 の計算値とともに示す。陽子線、ヘリウム線のどちらにおいても、計算値は測定値とよく一 致していることが確認された。 5 10 10 10 図５ フィルムによる照射野形状の測定結果 （10×10 mm の測定には陽子線を、10×5 mm の測定にはヘリウム線を使用した） （a） 陽子線 （b） ヘリウム線 計算値 線量 （最大値で規格化） 線量 （最大値で規格化） 計算値 1 測定値 0.8 0.6 0.4 0.2 1 測定値 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 1 2 3 4 5 入射面からの深さ (mm) 図６ 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 入射面からの深さ (mm) 電離箱による拡大ブラッグピーク（SOBP）内の線量測定結果 放射化を利用した照射範囲の確認試験について、図７に右脳を照射した場合の脳切片（頭 側、尾側）と、対応する IP 読取画像を示す。IP 読取画像では放射化の度合いが強いほど黒 く写っている。左脳の部分に比べて、右脳の部分が黒く写っており、狙い通りの照射範囲に 限定できていることを確認できた。 IP＋実像 実像 （重ね合わせ） L R L R R L R L ＊ 切断面＝紙面側 図７ （２） 放射化を利用した照射範囲確認試験の結果 脳壊死形成の確認 ＭＲＩによる経過観察 40 Gy 照射群では、陽子線でもヘリウム線でも 5 か月を経過しても明らかな変化が認めら れず、10 か月以上経過してようやく T2 強調画像において high から low の著明な変化が認め られてきた。 50 Gy 照射群では、4～5 か月後に T2 mix intensity の領域が認められた。 60 Gy 照射群では、1～3 か月の間にほぼすべてのマウスで明らかな T2 high intensity の 変化が認められた。これらのマウスは 3 か月程度の観察期間内に死亡した。 また、半脳照射と全脳照射の結果を比較すると、現時点では大きな違いはない。 脳のＨＥ染色による観察 60 Gy 照射群では、MRI で T2 high intensity を呈した白質部分に一致して著明な浮腫、 静脈の拡張、微小血管の増加が認められた。脳浮腫と静脈の拡張は他の研究者らが行った動 物実験の結果にも見られる変化である。これらの変化と微小血管の増加は臨床的脳壊死に付 随して見られる所見である。しかしながら、臨床でみられるような決定的なフィブリノイド 壊死は認められなかった。 一方で、40 Gy 照射群で偶然に 6 か月後に死亡したマウスでは、60 Gy 照射群で見られた ような浮腫や静脈の拡張、微小血管の増加などは認められなかった。このマウスは、MRI で も著明な変化は認められなかった。 図８に、60 Gy 照射群の一部と、上記の 40 Gy 照射後 6 か月後に死亡したマウスについて、 MRI 画像と HE 染色の結果をまとめて示す。 50 Gy 照射群については、現時点で一部のマウスが死亡しており、病理学的な検討を行っ ているところである 例１ 例２ 60 Gy 照射 2か月後に死亡 T2強調画像 （死亡直前） 右 60 Gy 照射 約3か月後に死亡 左 T2強調画像 （2か月後） 右 左 左 右 右 左 静脈の拡張 静脈の拡張 浮腫 微小血管の増加 微小血管の増加 浮腫 明らかな浮腫（染色されない領域の増加）、 静脈の拡張、微小血管の増加 が認められる 明らかな浮腫（染色されない領域の増加）、 静脈の拡張、微小血管の増加 が認められる 例４ 例３ 40 Gy 照射 約6か月後に死亡 60 Gy 照射 約3か月後に死亡 T2強調画像 T2強調画像 （死亡直前） 1.7か月後 右 右 左 右 左 左 2.2か月後 右 左 右 微小血管の増加 静脈の拡張 浮腫 明らかな浮腫（染色されない領域の増加）、 静脈の拡張、微小血管の増加 は認められない 明らかな浮腫（染色されない領域の増加）、 静脈の拡張、微小血管の増加 が認められる 図８ 40 または 60 Gy を照射したマウスの MRI 画像および HE 染色の結果（例） 左 6. まとめ 脳壊死モデル作成技術の確立に向けて、マウス/ラット脳への局所照射のための照射野形成に 関する検討を行い、実際にマウス脳への照射を実施した。当初に計画していた 40 Gy 照射群に加 えて、50 Gy 照射群と 60 Gy 照射群を作成し、MRI による経過観察と HE 染色による病理組織の観 察を実施した。 照射野形成については、計算により設計した SOBP の線量分布と電離箱による測定値がよく一 致することが確認できた。また、フィルムを用いた測定により照射範囲を目標通りに限定できて いることが確認できた。これらの結果から、マウス/ラット脳の局所照射のための照射野形成技 術をほぼ確立できたと考える。 MRI による経過観察では、50 Gy 照射群と 60 Gy 照射群において、照射後 6 か月以内に照射に 起因する著明な変化が認められた。病理組織の観察では、60 Gy 照射群において、著明な脳浮腫、 静脈の拡張、および微小血管の増加が認められた。これらは、臨床的脳壊死に付随して見られる 所見である。しかしながら、臨床で見られるような決定的なフィブリノイド壊死はこれまでのと ころ認められていない。 平成 26 年 2 月現在、継続して経過を観察している 40 Gy 照射群と 50 Gy 照射群において、照 射後 10 か月から 11 か月の MRI 画像で T2 high から low の著明な変化が認められてきている。今 後は、これらの群で脳壊死が起こっているかどうかを病理学的に観察し、今回の結果と合わせて 検討を重ね、脳壊死モデル作成のための条件を追及していく予定である。
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