140124 成果発表会.pptx

純度校正サービスのための非水滴定法による
アミノ酸純度測定における不確かさ評価
○加藤尚志，井原俊英
（産業技術総合研究所　計測標準研究部門）
はじめに
酢酸溶媒中で過塩素酸を用いる非水滴定法によるアミノ酸の純度測定は薬局方でも採用され，広く用いられている。しかし，塩酸塩などの化学種として提供される標準品や，酢酸への溶解度が
低い場合などに，そのまま用いることが困難な場合がある。そのため，煮沸による塩酸除去を併用した逆滴定法を適宜用いてアミノ酸標準品の純度測定を行った。また，それぞれの場合について
不確かさ評価を行ったので報告する。
測定方法
測定対象アミノ酸
装置：titrand 809 (メトローム)
電極：LLソルボトロード（9160-22910 メトローム）
終点解析：tiamo （メトローム）
素反応式（過塩素酸／酢酸溶媒系）
O-ホスホエタノールアミン（O-PEA）
ヒドロキシプロリン（HyPro）サルコシン（Sar）
2-アミノアジピン酸（2-AAA）
シトルリン（Cit） 2-アミノ酪酸（2-ABA）
β-アラニン（β-Ala）
3-アミノイソ酪酸（3-AiBA）
5-ヒドロキシリシン塩酸塩（HyLys）
フタル酸水素カリウムとの反応
アミノ酸との反応
4-アミノ酪酸（4-ABA）
オルニチン塩酸塩（Orn） 2-アミノエタノール塩酸塩（2-AE HCl）
1-メチルヒスチジン（1-MeHis）
カルノシン（Car）トリプトファン（Trp）
グルタミン（Gln）
アスパラギン（Asn）サルコシン
2-アミノ酪酸
測定結果（非水滴定　例：β-アラニン (β-Ala)）
不確かさ評価（フタル酸水素カリウムによる力価決定）
フタル酸水素カリウム（PHP)で
力価を決定した過塩素酸を滴下
H2N
OH
β-アラニン（β-Ala）
β-Alanine
u(xi)
Source of uncertainty
RepHClO4
Repeatability of the
determination
0.01997 mol/L
Titration volume for
PHP solution
12.1636 mL
Titration volume for
the blank solution
0.03396 mL
Gross weight
482.434 mg
Tare weight
432.928 mg
Chemical Formula: C3H7NO2
VPHP
Exact Mass: 89.05
Molecular Weight: 89.09
m/z: 89.05 (100.0%), 90.05 (3.4%)
Vb
Elemental Analysis: C, 40.44; H, 7.92; N, 15.72; O,
35.92
WPHP
Boiling Point: 474.06 [K]
Melting Point: 366.93 [K]
Log P: -1.09
O
ギ酸によりアミノ酸を溶解
xi
Component
W0
MPHP
Chemical Formula: C4H9NO2
PPHP
Exact Mass: 103.06
Molecular Weight: 103.12
m/z: 103.06 (100.0%), 104.07 (4.5%)
H2N
µmol/g
Pβ-AlaOH= 11206.99
Elemental
Analysis: C, 46.59; H, 8.80; N, 13.58; O,
µmol/g
u = 32.5831.03
Boiling Point: 481.88 [K]
(Pβ-Ala = 0.9985
Melting kg/kg)
Point: 363.2 [K]
DL-3-Aminoisobutyric acid
Log P: -0.53
Component
Source of
uncertainty
xi
u(xi)
∂f/∂xi
|∂f/∂xi|u(xi)
(kg/kg)
Degree of
freedom
Repeatability of the
determination
11206.99 mol/g
0.000285 kg/kg
1
1.4495
4
0.00000542
2
RepAA
0.0005 mL
CHClO4/(VPHP-Vb)
0.00000082
large
CHClO4
Concentration of
HClO4
0.01997 mol/L
0.0000176 mol/L
PAA/CHClO4
9.8789
222
0.00897 mL
CHClO4/(VPHP-Vb)
0.00001477
large
Vs
Titration volume for
the sample solution
12.1549 mL
0.0005 mL
PAA/(Vs-Vb)
0.4610
large
large
W0
Tare weight
432.594 mg
0.0135 mg
-PAA/(Ws-W0)
逆滴定によるアミノ酸純度の算出
1
逆滴定において添加された過塩素酸／酢酸溶液中の過塩素酸のモル数
Titration volume for
V
0.03396 mL
0.00897 mL
-P /(V -V )
0.0135 mg
C
/(W -W )
0.00000545
large
the blank solution
TP CA
(mol)
は、以下の様な式で表せる。
W
Gross weight
454.325 mg
0.0135 mg
P /(W -W )
0.0135 mg
-C
/(W -W )
0.00000545
large
HClO4
PHP
0
HClO4
PHP
0
b
AA
s
Molar mass of PHP
204.222 g/mol
0.006 g/mol
CHClO4/MPHP
0.00000059
Purity of PHP
0.99991 kg/kg
0.00007 kg/kg
CHClO4/PPHP
0.00000140
O
アミノ酸と反応した過塩素酸のモル数から
アミノ酸のモル数を算出
Degree of
freedom
1
0.00000542 mol/L
不確かさ評価（過塩素酸によるアミノ酸純度決定）
|∂f/∂xi|u(xi)
(mol/L)
∂f/∂xi
AA
TP CA = (WwP CA − Wb1 ) × CP CA
NH2
8.2722
large
0
6.9623
large
6.9623
large
(1)
large
u = 0. 00004 mol/L
• 風袋重量 W mol/L
g
C
= 0.02010b1
PAA =
HClO4
Ethanolamine
b
s
フェニルアラニン（P
(NMIJ CRM 601
• 過塩素酸溶液重量 WwP CA g
• 過塩素酸濃度 CP CA mol/g
Chemical Formula: C2H7NO
Exact Mass: 61.05
Molecular Weight: 61.08
m/z: 61.05 (100.0%), 62.06 (2.3%)
Elemental Analysis: C, 39.33; H, 11.55; N, 22.93; O,
26.19
Boiling Point: 402.2 [K]
Melting Point: 255.88 [K]
Log P: -1.17
HO
sP
β-アラニン
(Vs Vb ) ⇥ CHClO4
n ⇥ (Ws W0 )
ブランクの過塩素酸／酢酸溶液を滴定に用いた酢酸ナトリウム／酢酸溶
液のモル濃度を CSA (mol/L) とすると、以下の様な関係になる。
CSA × VB = (WwP CA − Wb1 ) × CP CA
測定結果（煮沸による塩酸除去を併用した逆滴定法　例：5-ヒドロキシ-DL-リシン(Hylys)）
バリン（Val）
(NMIJ CRM 601
(2)
• ブランクに対する酢酸ナトリウム滴定量 VB L
不確かさ評価（添加した過塩素酸の力価決定）
OH
PHPで力価を決定した
酢酸ナトリウムを滴下
アミノ酸を過剰量の
過塩素酸/酢酸溶液で溶解
H2N
OH
NH2
5-ヒドロキシ-DL-リシン
5-Hydroxy-DL-Lysine
（HyLys）
90分加熱し塩酸を除去
OH
過塩素酸とアミノ酸が反応
NH2
L-Phenylalanine(Phe)
過剰量の過塩素酸のモル数から
アミノ酸のモル数を算出
O
xi
u(xi)
∂f/∂xi
|∂f/∂xi|u(xi)
(mol/L)
Degree of freedom
CSA
Repeatability of the
determination
0.1002 mol/L
1.3156E-5 mol/L
1
1.3156E-5
3
VPHP
Titration volume for
PHP solution
7.94435 mL
0.0005 mL
-CSA/
((W’wPCA-W’b1)
MPCA/SA-VPHP)
4.170E-6
large
MPCA/SA
Ratio of PCA/SA
0.0009445 L/g
6.150 L/g
-CSA(W’wPCA-W’b1) /
((W’wPCA-W’wPCA)
MPCA/SA-VPHP)
0.000108
31
WwPHP
Gross weight
0.6859 g
0.0000135 g
- CSA/(WwPHP-Wb2)
5.503E-6
large
0.4402 g
0.0000135 g
CSA/(WwPHP-Wb2)
5.503E-6
large
0.006 g/mol
-CSA/MWPHP
2.943E-6
large
0.000025 g
-CSAMPCA/SA/
((W’wPCA-W’b1)
MPCA/SA-VPHP)
128.75 g
1.969E-7
1.969E-7
CSA/PPHP
7.013E-6
(WwP HP − Wb2 ) × PP HP
M WP HP
(WwP HP − Wb2 ) × PP HP
(8)
′
′
M WP HP × ((WwP
CA − Wb1 ) × MP CA/SA − VP HP )
同様にアミノ酸について逆滴定を行った場合，アミノ酸のモル数を A(mol)
とすると，以下のような関係が成り立つ。
′′
′′
CSA × VAA = (WwP
CA − Wb1 ) × MP CA/SA × CSA − nA
(9)
• アミノ酸の価数 n
まとめ
(9) 式を整理すると
A=
l 
l 
l 
l 
′′
′′
CSA × ((WwP
CA − Wb1 ) × MP CA/SA − VAA )
n
(10)
3.085E-7
2
3.142E-8
large
(3)
MPCA/SA/VB
Elemental Analysis: C, 65.44; H, 6.71; N, 8.48; O, 19.37
Boiling Point: 586.21 [K]
Melting Point: 445.97 [K]
Log P: 0.78
PCA/SA
wPCA
b1
large
b1
PCA/SA
wPCA
b1
large
MP CA/SA =
VB
(WwP CA − Wb1 )
u = 6.150 (4)
× 10-7 L/g
MPCA/SA = 0.0009445 L/g
すると，(2) 式は以下のように書ける。
= MP CA/SA × CSA
(5)
(WwP HP − Wb2 ) × PP HP
M WP HP |∂f/∂xi|u(xi) Degree of freedom
∂f/∂x
i
(mol/g)
(7)
− Wb2 ) ×
1.568E-6 (WwP HP
4
′
′1
CSA ×VP HP = (WwP CA −Wb1
)×CP CA −
(WwP HPP −/CWb2 ) × P5.455E-6
M WP HP
P HP
′
CSA ′
Concentration
of SA
0.1002 mol/L
1.316E-5
mol/L
33
AA
SA
CSA × ((W
−
W
)
×
M
−
V
)
=
P HP
P CA/SA
wP CA
b1
M WP HP
SA(W’’wPCA
(W
− W ) × PC-W’’
P HP
MPCA/SA
of•PCA/SA
0.0009445 L/g wP HP6.150 L/g b2
1.089E-5
31
フタル酸水素カリウム重量 WwP
wPCA)
HP(8)g
CRatio
SA =
/n(W -W ) − V
MW
× ((W ′
− W′ ) × M
)
′
′
CSA ×VP HP = (WwP
CA −W
b1 )×MP CA/SA ×CSA −
Source
of
Component
xi
u(xi)
uncertainty
PAA
整理すると
Repeatability of the
determination
0.004978 mol/g
1.568E-6 kg/kg
wP CA
b1
b3
P wAA
CA/SA
W’’
Gross weight
128.36 g
0.000025 g
1.981E-8
/n(WwAA-Wb3)
VAA
CSA ×
Titration volume
′′ for
7.9374′′mL
VAAAA
=solution
(WwP
CA − Wb1 ) ×
WwAA
Gross weight
• アミノ酸の価数 n
large
(9) 式を整理すると
Wb3
large
Tare weight
mL
MP0.0005
CA/SA ×
-CSA
CSA
/n(W−
-Wb3)
wAAnA
large
(6)
1
large
large
4.194E-7
(9)
large
0.5515 g
0.0135 mg
-PAA/(WwAA-Wb3)
5.627E-7
large
0.4321 g
0.0135 mg
PAA/(WwAA-Wb3
5.627E-7
large
′′
′′
CSA × ((WwP
CA − Wb1 ) × MP CA/SA − VAA )
A=
n
PP HP
P HP
-CSAMPCA/SA
wPCA
/n(WwAA-Wb3) A(mol)
同様にアミノ酸について逆滴定を行った場合，
• 風袋重量 Wb2アミノ酸のモル数を
g
CSAMPCA/SA
とすると，以下のような関係が成り立つ。
W’’wPCA
Tare weight
107.26 g
0.000025 g
1.981E-8
(10)
よって，アミノ酸の重量モル濃度 PA (mol/g) は，
′
′
CSA × ((WwP
CA − Wb1 ) × MP CA/SA − VP HP ) =
CSA =
2
P HP
CSAMPCA/SA/
((W’wPCA-W’b1)
MPCA/SA-VPHP)
1
うな関係が成り立つ。
Source of uncertainty
(WwP HP − Wb2 ) × PP HP
′
′
CSA ×VP HP = (WwP
−W
×CSA − 107.62 g
W’
weight
0.000025 g
CA/SA
CA
b1 )×MPTare
b1
M WP HP
(7)
PPHP
Purity of PHP
0.99991 kg/kg
0.00007 kg/kg
整理すると
Blank solution
|∂f/∂xi|u(xi)
Degree of freedom
(L/g)
∂f/∂xi
wPCA
CP CA
Melting Point: 422.14 [K]
P: -0.4
•Logフタル酸水素カリウム分子量 M WP HP g/mol
不確かさ評価（フタル酸水素カリウムによる酢酸ナトリウムの力価決定）
Gross weight
VB
u(xi)
標準となるフタル酸水素カリウムについて逆滴定を行った時，以下のよ
(6) 式に (5) 式を代入すると，
不確かさ評価（酢酸ナトリウムによるアミノ酸純度決定）
Component
W’wPCA
CP CA
xi
VB0.000945 L/g 3.085E-7 mol/L
=
× CSA
(W
− WmLb1 ) 0.0005 mL
Titration
volume
wPforCA 15.0300
Repeatability of the
determination
Analysis: C, 52.16; H, 7.88; N, 12.17; O, 27.79
•Elemental
フタル酸水素カリウム純度 PP HP kg/kg
Boiling Point: 517.63 [K]
L(-)-Prolin(Pro)
2-Pyrrolidinecarboxylic acid
(6) 式に (5) 式を代入すると，
MPCA/SA
Source of uncertainty
Molecular Weight: 115.13
m/z: 115.06 (100.0%), 116.07 (5.6%)
OH
• フタル酸水素カリウム分子量 M WofPPHP
MWPHP
Molar mass
204.222 g/mol
HP g/mol
Component
実験的に VB を統一条件下で複数回測定することは困難であるため，単
W
Gross weight
123.05 g
0.000025 g
M
/(W
-W )
3.756E-8
Chemical Formula: C 位重量あたりの過酸化水素／酢酸溶液に相当する酢酸ナトリウム／酢酸溶
H NO
W
Tare weight
107.15 g
0.000025 g
-M
/(W
-W )
3.756E-8
Exact Mass: 165.08
Molecular Weight: 165.19
MP CA/SA (L/g) とおく。
m/z: 165.08 (100.0%),液の体積を
166.08 (10.2%)
PHyLys = 4977.57 µmol/g
µmol/g
u = 11.80
Chemical Formula: C5H9NO2
Exact Mass: 115.06
(PHyLys = 0.8073
kg/kg)
NH
Wb2
Tare weight
フタル酸水素カリウム純度 P
P HP kg/kg
Chemical Formula: C6H14N2O3
Exact Mass: 162.10
Molecular Weight: 162.19
m/z: 162.10 (100.0%), 163.10 (7.3%)
Elemental Analysis: C, 44.43; H, 8.70; N, 17.27; O,
29.59
Boiling Point: 602.42 [K]
Melting Point: 514.82 [K]
Log P: -2.11
9 11
O
•
整理すると，
O
u = 0. 00011 mol/L
CSA = 0.10017 mol/L
PA = CSA ×
2
′′
′′
(WwP
CA − Wb1 ) × MP CA/SA − VAA
n × (WwAA − Wb3 )
(11)
n: アミノ酸の価数
逆滴定におけるブランクの影響について
系内におけるブランク容量 Vb mL とすると，VB ，VP HP ，VAA の各項
がそれぞれ (VB − Vb )，(VP HP − Vb )，(VAA − Vb ) となる。
これらは，(4) 式，(9) 式，(11) 式において影響を与える上に，3 系列に
分けて行われる今回の実験において加える溶媒量が異なると，それぞれ異
なった値を持つことが予想される。そのため，これらの影響を最小限にす
るためには，(1) 試料量を増やすことで，影響をキャンセルする。(2) な
るべく同一量の溶媒を加えることで，その影響を画一化する。などの配慮
が必要になる。
よって，アミノ酸の重量モル濃度 P (mol/g) は，
アミノ酸標準品について，酢酸溶媒中における過塩素酸による非水滴定法を用いて純度の測定を行った。
(W
−W )×M
−V
P =C ×
(11)
測定対象とした17物質中14物質は，通常の非水滴定法により測定が可能であり，それぞれについて不確かさ評価を行った。
n × (W
−W )
塩酸塩として提供された3物質については，煮沸による塩酸除去を併用した逆滴定法により純度を決定し，それぞれついて不確かさ評価を行った。
2 逆滴定におけるブランクの影響について
純度校正サービスにおいて，これらの手法を用いることで十分な不確かさで純度測定が行えることを確かめた。
2
A
A
SA
′′
wP CA
′′
b1
P CA/SA
wAA
AA
b3
系内におけるブランク容量 Vb mL とすると，VB ，VP HP ，VAA の各項
がそれぞれ (VB − Vb )，(VP HP − Vb )，(VAA − Vb ) となる。
これらは，(4) 式，(9) 式，(11) 式において影響を与える上に，3 系列に
分けて行われる今回の実験において加える溶媒量が異なると，それぞれ異
なった値を持つことが予想される。そのため，これらの影響を最小限にす
るためには，(1) 試料量を増やすことで，影響をキャンセルする。(2) な
るべく同一量の溶媒を加えることで，その影響を画一化する。などの配慮
が必要になる。
2
http://www.aist.go.jp/, http://www.nmij.jp/~measure-sys/chemsys/
プロリン（Pro）
(NMIJ CRM 601

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