全国ホ タル研 究会誌 ,(39):2531,(2006) 遺伝子解析 による豊 田地域 に生息す る ゲンジボタル の集団構造 について 増本 育 子キ・若尾 拓 志 キ・尾 田 敏 範 キ( 広島県広 島市) ・ 北村 徹 料・新 田 朗 料 ( 東京都港区) ・ 川 野 敬 介 料Ⅲ( 山田県下 関市) 1.は じめ に 下関市豊 田町 は山 口県 の 画部 に位 置 し, ゲ ンジボ タル 駒 "θ プ 2ごr」ごβr2の 生息 ・ 発生地 と して 古くか ら有名な町で ある。 特 に木尿川 とその 支川 に生息 す るゲ ンジ ボ タル は ,1958年 に 「 木屋川 ・音信川ゲ ンジボ タル発 生地 」 と して天然 記念物 に 指定 されてお り,現 在 は重 要な観光 資源 とな って いる。 ところで ,全 国 のゲ ンジボタル につ い て , ミ トコ ン ドリアDNAに コー ドされ る CO(Cy↓ ochromc Oxidase)Ⅱ遺伝 子 を分析 した Suzuki βr 2ノ (2002)に よる と, ゲ ンジボ タル は大 き く束 日本 ,西 日本ゥ 九州 とい う 3つ の グル ー プに分 類で きる ことが 示 されて いる。 さ らに本研究 によ る と,豊 ‖1地域 は 西 日本 グル ー プ と九州 グル ー プに含 まれ るハ プ ロタイ プが 混在 す る地域 で あ り,加 えて ,九 州 グル ー プ の 1つ で あ るが 他 の 地域で は見 られな い 「L型 (以下 の 記載 は便宜 上 ,「豊 田型」 と した)Jと い うハ プ ロタイ プを持 つ個 体 が 生忠 す る ことが 明 らか にな って いる。 そ こで 本研 究 では,豊 田地域 内 を流れ る木尿川水 系 と粟野川水 系 に分布す るゲ ンジボ タルにつ いて、CO Ⅱ 遺伝子 の 部分 領域 の塩 基配列分析 を行 い ,豊 田型 とい -25- うハ プ ロタイ プ , な らび に西 日本 グル ー プ と九州 グル ー プの分 布状況 を把 握 して , 豊 田地域 内 のゲ ンジボ タル の遺伝学的集 団構造 を明 らか にす る ことを 同的 とした。 さ らに本研究 を通 して , 木 屋川 のゲ ンジ ボ タル を将来 にわた って保全 して い くた め に参考 とな る情報が得 られた場合 は , それ らにつ いて もと りま とめ る こととし た。 2 . 実 験材料 と方法 実験材料 として , 木 屋川水系お よび 粟 野 川水 系 の 各支川数地点か らゲ ンジボ タ ル幼 虫 を採集 し, エ タ ノー ル 中 に浸漬 し て実験 に供す るまで冷蔵で 保存 した。 採 取位 置 は図 1 に 示す とお りで ある。 本研 究 では , 豊 田地域 内 とい うせ まい 地域 に分布す る集 団 を分 析対象 として い .(2002)に おい るため , S u z u k i θ ′2 ノ て 多検体分析 に用 い られて いるR F L P ( R e 一 siric↓ lon Fragment polymorphism)分 析 よ りも精度が高 い と思われ る , 塩 基配 列デ ー タを用 いた分析 を行 った。サ ンプ ルか らの l o ↓ al DNAの 抽 出 には, Q I A G E N i ↓ いた。既報 社 製D N e a s y T i s s u e Kを用 の プ ライマ ー ( S u z u k i e i a l . 2 0 0 2 ) を l i e d B l o s y s i c m s )用 をいて 塩 基 配 列 を決 した 。 定 また , 決 定 した塩 基 配 列 ( 6 2 9 b p ) につ いて は , G e n B a n k に 登録 され て い るゲ ン 己デ ジボ タル の 各 ハ プ ロ タイ プの塩 基 1 1列 ー タ と共 に , D N A S I S P r o V 2 . 2 ( H ia↓c h i ware Enginncring)を Sof↓ 用 いて ア ライ ー . 1ン トを行 った後 , 系 統 解 析 プ ロ グ ラム プライマ とB i g D y e T e r m i n a t o r v 3メ M c g a v e r . 3 ( K u m a r f r β/ , , 2 0 0 1 ) を Cycle Sequcnce Ki↓ (Applied Blosys ー Tamura Nciに よ 用 いて , 」u k e s C a n l o r と t e m s ) によ る シ ク エ ンス 反 応 を行 い , の よび非 重結 る 加 合 法 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (App― 遺 伝 距 離 計算 , お 用 いて , C O Ⅱ遺 伝 子 部分 領 域 をP C R 法 に よ り増 幅 した 。 P C R 反 応 の 設定 や 反応 液 ′〃 ( 2 0 の 組 成 等 につ いて はS u z u k i θ に た増 0 2 ) を 参 考 した 。 得 られ 幅産物 に ァ) ぃ 【r に其, G F X T M P C R D N A a l l d G c l B a n d Purification Kil (Amersham Phar81aCia B i o t c c h ) を用 い て精 製後 , P C R に 用 い た ￨l ill14111‐ ￨￨li 粟野 川水 系 1 霊 ヽ 1 1 4 t , 1 ト J ′ 'T岳 liず￨十 111 1ヽ 十 it l‐ ￨!￨￨、 IF t― .i‐ ￨‐1 !(￨ 木屋 1 2 ( 幼虫放 流実績 あり ！ ， 一 一 ！！ 一 一 一 ！ 一 ！ ， ヤ ！ ， ｒ 山田 1 5 ( 幼虫放流実績 あり) ャ 一ヤ ！ 一¨ 一 !.￨￨￨1声 ￨十1-印 一 ☆一 “一 一 ， 一 一咋 一 一 ， ゃ ！ ︼ ！ ﹁ ！ 一一 一 ヽ 一 一 “ 一 や ！ 一 ， 鉢朴 ■ ヽ 冊 ギ!二ず ￨ ユ , 十■ ■ 十 ャ i !￨ ギ 単 、 、 = ￨F ド iギ i ハ 十1 十 F 0i木 屋川水 系 O : 粟 野 川水 系 ■ ・ ￨￨■ ￨lilllri‐ ■よ 、 0 l ナ お￨ 図 1 . 採 取位置 図 - 2 6 - 1km ― e ↓h o d w i t h ( U l l w c i g h t c d p a igrr― 別 され て い る。 oup Ⅲ a r i t h m e t r i c m e a n i U P C M)Aと 法 ゃ近 隣 本研 究 で 九州 グル ー プの ク ラスタ ー に 一1 に 結 合 法 ( N c i g h b o r i o i n i n g m e t h o d i N J含 まれ た 3 3 個体 は企 てC t a d c l l l - 致 し, 西 「1 本グル ー プの ク ラス タ ー に 分 類 法 ) に よ る 系統 樹 の 作 成 を行 った 。 体 131回 され た 1 6 1 L aのl うち 体 はC l a d e 正一i なお , ハ プ ロ タイ プ多様 度 お よび塩 基 に含 まれ た。 た だ し西 日本 グル ー プの ク 多様 度 等 の 分 析 につ い て は , D n a S p v c r . 4.10.4(Rozas et al.2003)を ラス タ ー に分 類 され たK O Y A 4 , Y A M A - 3 , 用 いて 計 お よび I N A M I - 1 の3 個 体 は , 塩 基 配 列 か 算 を行 った 。 らの分 類 で は大 き く西 日本 グル ー プの ク 3 実 験 結 果 および考察 ラス タ ー に入 るが , C l a g e 正 - 1 に もC l a de H一 i i にも令 まね な か った。 そ の た め , 栗野 川 水 系 6地 点 お よび 木屋 川 水 系 6 Suzuki θ ′2 / , ( 2 0 0 2 ) が 用 い た 6 種 類 地 点 の 合 計 12地 点 か ら採 集 した ,H ll回 の の の につ ゲ ンジボ タル幼 制 限 酵 素 の 認 識 配 列 か ら推 定 され る 体 うち49個 体 虫 い て ,CO Ⅱ 遺 伝 子部分 領 域 629塩 基 対 の R F L P パタ ー ンで 分類 を確 認 した と ころ , C l a d e Ⅱ- 1 に 含 まれ る 」型 を示 す ことが 塩 未 配 列 を決 定 した。 629塩 基 対 の うち 48の 部 位 にお いて 塩 基 置 換 が確 認 され , わ か った 。 ロ のハ 31種 プが得 た。 プ られ 回 の 研 究 で はC l a d e 工 1 1 の塩 基 配 列 デ 今 合計 類 タイ ー タが 少 な いた め , 3 個 体 の 遺 伝 的解 釈 な お ,図 2に Jukes Cantorの 遺 伝 距 離 につ いて は明確 な判 断 は 出来 な い 。 しか を用 いて 作 成 した 近 隣 結 合 樹 を示す 。 本 しなが ら, 上 記 の よ うに塩 基 配 列 か らの 研 究 で は ,Jukcs Canlorと Tamura Nelと い う 2種 類 の 遺 伝 距 離 を用 い て ,非 加 重 分類 とR F L P からの分 類 との間 で ク ラス タ ー が 異 な る理 由 と して , S u z u k i θr β プ. 結 合 法 と近 隣 結 合 法 によ る系統 樹 を作 成 ( 2 0 0 2 ) の用 い たR F L P 分析 で は , 6 種 類 した 。遺 伝 距 離 と 系統 樹 の 作 成 方 法 の 組 ー の の にお る せ によ タ り各 ク ラス け 制 限酵 素 ( H p a I I , A s c l , H a c l H , H i 一 合 細部 n f l , M v a I , R s a I ) の 認識 部 位 ( この 場 構 造 は 多 少 異な るが ,以 下 の 議 論 を行 う に は支 障 が 無 く,ほ ぼ 同様 の 樹 形 を示す 合 2 6 塩基 ) を 対 象 と して分 類 して い るの に対 し, 今 回 の 研 究 で用 いた 塩 基 配 列 分 こ とが わ か った。 析 で は , 実 際 に比 較 に用 いた 全塩 基 配 列 <分 析 結 果 の 概 要 > 分 析 に用 いた49個 体 はSuzuki α′〃 (2002)で 示 され た西 日本 グル ー プ (16 個 体 )と 九州 グル ー プ (33個体 )と に 明 瞭 に区 別 す る こ とが で きた 。 Suzuki ar βプ (2002)に よ るRFLP分 析 の 結 果 か ら, 西 日本 グル ー プは ,さ らにCladeⅡ -1 (西 ￨1本地 域 )と Ciade Ⅱ―li(中部 地 域 ) 一i ( 北 九州 に, 九 州 グル ー プはC l a d e 皿 地域 ) と C l a d c Ⅲi l ( 南 九州地域) に 区 を対象 として分類 した ことが 挙 げ られ る。 これ によ り豊 田地域周辺だ けで, 日本 全 国 の個体 につ いてのRFLP分析で得 られ る 19種類 のハ プ ロタイプよ りも多 い31種類 も のハ プ ロ タ イ プが検 出 され た結 果 , -11の関係が不明瞭 -1と Cladc Ⅱ Ciadc Ⅱ にな った と考 え られ る。 <西 日本 グル ー プ と九州 グル ー プの遺伝 的多様性 > 豊田地域周辺 は ,遺 伝 的 に異な る西 日 よび塩基 多様 表 1 . 九 州 グル ー プおよび西 日本 グル ー プの ハ プ ロ タイプ多様 度 ( H d ) お 度 (Pl) 1同IⅢ敬 吾 換部 ￨_‐ ブヽコ ロ ど コイ フ ) ヽ フ ロ タイ フ 袖 多 様度 ( H d ) ( Y ( H〕 』 〕 塩き む 張E rPi) 打 融 打献 PI〕 tV〔 士‐ 1路 1答 [,353 8.81S 8.92せ 84 筑 JⅢ ギ 〕ター ■ B.tt 38 8.838 0.88502 8.80285 0.00858 8_71 は.12g 0.00255 0,00088 西 日 本 ギ 】ノ ゴ 13 8 8 -27- 凡 例 九 州 グル ー プ ( 北九 州 地 域 i C l a d e l l1l)・ 豊 田 型 を含 む 九 州 グル ー プ ( 南九 州 地 域 i C l a d e li ll l) ‐ 西 日本 グル ー プ □ ( 西日本 地 域 i C l a d e lil)‐ 西 日本 グ ル ー プ ・五) ( 中部 地 域 i C l a d e 工 ア ウ トグル ー プ ( 対照 グル ー プ) C a n t o r を用 い て 作 成 し 図2」 ukes‐ た 、ゲ ンジボタル の近 隣結 合 樹 "haplotypeⅢ lまGenBankか ら 弓￨ ハ ロ プ の プ タ イ 塩 基 配 用 した 、 各 列 を示 す。 AWA:粟 野 、ERA:江 良 、HI:日 野 、 IMAIDEI今 出 、INAMI:稲 見 、KAI: 開作 、KOYA:木 屋 、MUKU:杢 路子、 SANO:佐 野 、TAK洋 鷹 子 、YAMA: 山 田。 ま た 、 各 校 の 横 に示 した 数 字 は ー ブ トス トラ ップ値 を 示 す 。 な お 、 ク メ ジ マ ホ タ ル の 3種 の ハ プ ロタ イ プ は、 系統 樹 作 成 の ア ウ トグ ル ー プ と して 用 いた 。 -28- 本 グル ー プ と九州 グル ー プの どち らかが 分布域 を拡 大 して いる境界地域 で あ る可 能性 が高 い と考 え られ る。 このよ うな解 釈 につ いて検 討 を行 うため, 両 グル ー プ の遺伝 的多様性 につ いて検 討 を行 った結 果 を表 1 に 示す。なお, ハ プ ロタイ プの 区別 が不明瞭な , K O Y A 4 , Y A M A - 3 , お よ つ いて は分析か ら除外 した。 びINAMI-1に 検 討 の結果 , 九 州 グル ー プは西 日本 グ ル ー プに比 較 してハ プ ロタイ プ多様度 , 塩基 多様度 とも高 い値 を示 し, 遺 伝 的多 様性 が高 い ことが 明 らか とな った。特 に 塩基多様度 は 2 倍 近 い値 を示 して いる こ とか ら, 豊 田地域周辺 に分布す る西 日本 集 団は九州集 団よ りも小 さ い と推定 され る。 さ らに, 2 水 系 に分布す る九州 グル ー プの個体数 も, 西 日本 グル ー プの個体 数 の倍 以 上で ある ことか ら, 両 グル ー プ の境界 の 中心 は多少東側 に位 置す る可能 性 が示唆 され た。 < 粟 野川水系 と木屋川水系 における西 日 囲 :豊田型 ■:豊田型以外の九)11グ ループ ロ:西日本グループ 山田 5 (幼虫放流実績あり) や 鷹子 5 い FIド 杢路 子 上 流 地点名の後の数字は分析個体数 図 3 . 分 析個体 のR F L P ハプ ロタイプ別 出現頻度 -29- 難十 ぱ弊“ 本 グル ー プ と九州 グル ー プの分布状況 > 各地点 にお ける西 日本 グル ー プ と九州 グル ー プの 出現頻 度 を図 3 に 示 した。 塩 基配列か ら推定 した近隣結 合樹 か ら, 単 同地域 を流れ る 2 つ の 水 系 には , 西 日 ー 本 グル ー プお よび九州 グル プの 2 つ の ー グル プに属す る集 団が同水 系内 に分布 して いる ことが明 らか にな った。5 個 体 を分析 した地点 に限 る と, どち らか のグ ル ー プだ けが 出現す る地点 は 栗野 川水 系 の 開作 と佐 野 の 2 地 点 だ けであ り, 木 屋 川水系で は全て の地 点 にお いて 2 グ ル ー プが 混 在 して いた。なお, 山 I J , 木 屋地 点 にお いて は, 過 去 にゲ ンジボタル幼 虫 の 放流実績 が確 認 されて いる。 また, 2 水 系間 にゲ ンジボ タル の交流 を物理 的 に 抑 制す るよ うな地理的特長 は存在 しな い ため , 放 流 された幼 虫 が周辺地域 に広 が った可能性 も否定 で きな い と思われ る。 豊 田地域周辺 にお いて2 グ ル ー プが 混 在す る理 由を解 明す るため には , 分 析検 体 教 を増やす だ けでな く, よ り広 い地域 か ら採集 したl l a lにつ 体 いて も分析 を行 い , ゲ ンジボ タルの 日本 へ の侵 入経路や , 日 本 での分散経路等 を含 めた考察が必 要で あ る と考 え られ る。S u z u k i ごア2 / ( 2 0 0 2 ) に よ る と, 九 州 グル ー プ と西 日本 グ ル ー プは6 7 0 万 年前 に分岐 した と推定 さ れ て いる。 この ことか ら, 本 研究 で分析 を行 った 2 水 系 で は 非常 に 占い時代 に分 一 岐 した 2 グ ル ー プが 1 司 河 川 に分 布 して いる ことにな る。 このよ うな 2 集 団が会 合 して いる地域 は動物地理学 的 に見て非 常 に重 要な地域 で ある と考 え られ る。 < 豊 田型の分布状 況 > 分析 の 結果 , R F L P ハ プ ロタイ プが豊 田 型 を示 した個体 は , 分 析 に用 いた4 9 個体 の うち栗野 川水 系鷹 子川 か ら得 られ た 1 個体 の みで あつた。 この 1 個 体 は G c n ― B a n k から引用 した L 型 のハ プ ロタイ プの 完 全 に 一致 して いた 。S u z u k i 焔 基配 / / 1 と β′β/ ( 2 0 0 2 ) が ゲ ンジボ タル を採取 し た河川が, 撃 田地域 内 の どこで ある のか ` 確 認 出来て いな いが, S u z u k i θr 2 プ ( 2 0 0 2 ) が 1 0 個体 分析 した 中で豊 田型 を 示す個体 は 1 個 体 だ けで あつた ことや , 本研 究 にお いて も分析 した4 9 個体 の うち 1 個 体 ( 図2 . 「 T A K A 4 」) しか検 出 され て いな い ことを考 える と, 性 田型 は希少 な ハ プ ロタイ プで ある と考 え られ る。 豊 田型が鷹子 川 に特 異的 な集 団 である と仮定 した場合 , 鷹 子川 の集 団が独 自 に 分化 して いる必要があ るが , 鷹 F 川 か ら は西 日本 グル ー プお よび 九州 グルー プに 含 まれ る豊 田型以外 の個体 が確 認 されて いる ことや , 塩 基配列デ ー タか ら鷹 子川 の検体 は多 系統 的 に 出現 して いる ことか ら, 鷹 子 川 の集 団 が分化 して いる とは考 え に くい。更 には鷹 子川が粟野川本 川や 木屋川 水系 と隔離 され るよ うな地理的障 壁 も存在 しな い ことか ら, 鷹 子 川集 I J が 他集 団 か ら独立 して いる とは考 え に くい。 整 田型が鷹 子川 だ けに分布 して いるの か否か につ いて は , よ り広 い範 囲か ら採 集 した検体 につ いて 分析す る必 要が ある が, 上 記 の 出現状況 か ら考 える と少な く とも豊 田型 のハ プ ロタイ プは希少である と考 え られ る。 < 豊 田地域 におけるゲ ンジボタルの保全 対策 > 本研 究 の 結果 か ら豊 田地域 は , 豊 円型 とい う希少なハ プ ロタイ プが存在す る地 域で あ り, ゲ ンジボタル の遺伝 的多様性 を保全す るため に非常 に重 要な保 全地域 で ある と考 え られ る。 J本 また, 同 地域 は九州 グル ー プ と西 と ー グル プ とい う遺伝 的 に非常 に古 くに分 岐 した 2 集 団が隣接す る 2 水 系 にお いて 混在す る とい う, 非 常 に興 味深 い集 田構 造 を示す ことが明 らか とな った。 今後 , 2 グ ル ー プの存 在機構 を解 明 し て い く上で も, 遺 伝的特徴 を乱す こと無 く, 豊 田地域 の 現在 の環境 を維 持 して い く必要が ある と考 え られ る。 引用文献 S u z u k l , H . ・S a i o , Y . ・O h b a , N . 2 0 0 2 , Gelle Diversity alld Geographic 3 0 - ノθび′/ 2 r P / 7θ ガ ″θ/ たs 2 ″び 子 系統 樹 か ら見 た地 理 的 分布 と遺 伝 的 dae).抑 gθ ー ー θノ冴 ブθ ″, 2 2 ( 2 ) i 2 9 3 2 0 5 . 分 化 . 昆 虫 D N A 研 究 会 ニ ュ ス レタ , 助 ・ (1):24-32, 日 政 和佳 草桶 秀 夫 2 0 0 4 , ホ タル の 分 ・ ・ 。 θt t F l . , 吉 川貴 浩 井 出幸 介 窪 田康 男 中村好 s o f t w a r e , И r ル θ〃』 ざr 2 ア Tempe,Arizona,USA. 宏 ・武 部 寛 ・中桶 秀 夫 2 0 0 1 , ミ トコ ン ド￨ ジ アN D 5 遺 伝 子 の 塩 来 配 列 か ら推 R o z a s , J . , S a n c h c z D e l B a r r l o , J . C . , 定 され た ゲ ンジボ タル の 種 内変 異 と分 Messeguer,X.and Rozas,R。 (2003). . ゎ . s 。 ″ / . 駒r , ( ヽ ),4(4)!117 DnaSP,DNA polymorphism analyses F系 統 -127. by the coalescellt alld other inetho― Kumar,S., Tamura,K., Jakobsen,I.B. ds. ,メθメ ″/θ r″2アブごJ,19t2496-2497. and Nei,M. 2001, MEGA2t Molecular Evoultionary Genc,ics Analysis Differentiation in Mi↓ ochondrial * :中 電技術 コンサルタント株式会社 ― * * : 日 D N A o f t h e C e n e j i F i r e f l声θ y,Z」 本 エヌ ・ユ ー ・エス株式会社 / 2 びr ど "2/2(ColeopteratLampyri * 料: 豊 田ホ タルの里 ミュー ジアム - 3 1 -
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