アレルギー 53(10), 1088-1090,2004(平 16) 速報〕〔 E S R ラジカルイムノアッセイ法による C r y j l の超高感度測定法の開発 1)生物ラジカル研究所 , 2)山形県衛生研究所青山正明D 高橋裕一のアセタミドフェノールとヒド回キシルアミン体を併用したスギ花粉抗原 Cttj lの測定系を開発し ″‐ た日本測定系による最低検出感度は 3.5 pg/1111であリー個以下の花粉数でも Cttj lの検出が可能であつた日測定系の高感度化により患者の発症前に飛散している微量の Cttjェの検出ならびに情報発信が可能となった日 Keywords i Cryj l― 一一 ESR― 一一 radicalilnmunoassay 目的方法サンドイッチ ELISA法による空中 Cryj l淑 j定ではスギ花粉飛散開始日前の超微量濃度の Cryj lを捉えることができなかった。榎本らが開発した高感度 Cryj l測定法Dにおいても大気中の Cryj lはスギ花粉数にして 13個以上ないと測定できなかった。馬場はスギ花粉症の発症や症状の経過と花粉飛散との関係を検討し,スギ花粉の初観測日からの累積花粉数の平方根と累積発症率がよく相関することを見出しており, ごく微量の花粉抗原により感受性が元進するとしているの.このことからもスギ花粉飛散開始日前の大気中に存在するごく微量の Cryj lが重要で,その微量の Cryj lを測定する価値があると考えられる。最近,著 ― AP)と者の一人,青山らにより開発された酵素基質 (″ ヒドロキシルアミン体 (HT10)を併用した高感度 HRP 検出系め (ラジカルイムノアッセイ法)で HBs抗原等を超高感度に検出できるとの報告がなされている。9 . 我々は大気中のスギ花粉アレルゲン ( C r y j l ) にこの方法を応用できないかを検討した. 1.測定方法 Nunc社の 8穴マイクロプレートに抗 Cryjl MAb (林原,013)を定法により固定し (lμ g/well),Stabil― Guard 300ぃ 1を加え 4℃ にて一晩ブロッキングを行った.測定時に必要枚数のプレートを取り出し,超純水で洗浄後に使用した。MOPS緩衝液 (0。 l M,pH7.0, 10%のウシ胎児血清を含む)で希釈された試料抽出波 1 0 0lμ に同緩衝波で 1 0 0 0 倍に希釈した H R P 標識 Cryjl MAb(林原,053)50μlを加え室温下で 40分問反応させた。エルジア・F用洗浄液にて洗浄後, ″― AP(4mM),HTIO(0.34mM)と過酸化水素 (0,01%) を含む基質緩衝液 150μ lを加え 37℃ で 30分間反応させた。酵素反応の結果生成した安定ニトロキシドラジカルの量は E S R ( F R 3 0 ,E 」 O L ) で測定した. E S R の淑J定は,Center Field i 336.100± 5mT,Power:4 mW, Mlodulation Width:0.lnlT, Time Constant i O.3sec, Sweep Tilne:4 rnin, AInplitude: 400∼ × × 一 10にて行った.測定の例を Fig.1に示す。安定ニトロキシドラジカルは等価な 3本線より構成されるため最も低続場側のシグナルの高さを滅l定し,比較した。 Received:」 uly 8,2004 Accepted i Septelnber 7,2004 Abbに胡L品ぃぃ :II「10 1‐hydroxy‐2,2,5,5-tetramethyl‐ 1■ lidazoline 3-oxide;jp‐ 3‐ AP″ ― acetattlidophenol 青山正明 : 生物ラジカル研究所ラジカル応用分析研究室〔山形県山形市松栄二丁目 2 番 1 号〕 E"mall:[email protected]― techno.or.jp 2.大気試料からの Cryj l抽出法 c l o n e 大気中の C r y j C ly は s a m p l e r ( B u 90M)を用いて採集した.試料は 24時間間隔で採集した。試料の交換は午前 6時に行った。試料の吸引容量ま16.6″ ヤ / minなので,1時間で約 lm3サンプリングされることになる。したがって,24時間では 24m3採集さ青山正明他 1089 バーグラスの全面を計数し l c m 2 当たりの数に換算した. れる。サンプリング後の試料は 0,125Mの NH4HC03 (0,1%BSA含む)溶波 100μ lで 2時間槍拌しながら室温で抽出した.2時間抽出した後に 3000rpmで 10分間遠心し上清を分取し測走に用いた。ダーラム補集器は同一地点に設置し,Cyc10ne samplerの試料と同様午前 6時にスライドグラスを交換し,18× 18cm2のカ結果及び考察同一条件で行ったサンドイッチ ELISA法では 400 pg/mlが Cryj lの測定限界であったが,ラジカルイムノアッセイ法では 3.5pg/mlまで検出でき,患者が発症する前から情報を提供することができた.Fig。2は 2004年のスギ花粉シーズンのごく初期の時期 (スギ花 100pg/ml 粉の初観測日 (2月 29日 )前から飛散開始日 (3月 11 日)の後に,山形市にてダーラム捕集器で日ごとに測定したスギ花粉数とラジカルイムノアッセイ法で測定した Cryj lの値を示したものである。図のようにラジカルイムノアッセイ法ではダーラム捕集器で花粉が校出される 5日前からの Cryj l測定が可能であった。榎本らDは回相化抗体にモノクローナル抗体を用い,第二標識抗体にポリクローナル抗体を用いた ELISA法で,空中の Cryj lを高感度に測定できる方法を開発した。彼らの方法ではスギ花粉 13個に相当する花粉濃度まで測定することが可能であった。しかし, スギ花粉飛散開始日前の微量の Cryj lは測定できなかった.今回我々が開発した方法では Cryj lめ検出感度は 3.5pg/mlであった。スギ花粉 1個の Cryj l量は Fig.1.Cry,l detecuon hm比(3.5pg/ml)was esti 約 6pgと見積もられているD。したがって,ラジカル mated to a signal equalto the l.5-fold of blank signal. イムノアッセイ法ではスギ花粉が 1個以下でも充分に Beginning day of apο O′βiCa po‖ en dispersion 10 命ＥＱのＥ馬Ｌθ 9 8 ７５４３Ｄａ︶ｒ一ム﹂０介Ｅヽ６Ｅ空石ａ弱ｏミＯＬｎヽ６２１０ 23242526272829 1 2 3 4 5 6 7 8 91011 1213141516 February Fig.2. Amounts March of Cry j l(line %″ θ C″pollen season. graph)at the beginning Of c.!叩 g r a p″ h″θ )″ a' nC dp″o nl ul le nn b( eb ra sr of C.ブ 1090 ジカルイムノアッセイ法による Cryj lの超高感度測定法の開発 ESRラ検出することが可能である。同一地区に居住する患者アレルギーの臨床 2 3 0 ( 1 8 ) , 1 7 0 1 7 4 , 1 9 9 8 . の発症状況のデータと対比することにより数pym3 Aoyama,MI.,Shiga,A/1.,Ohya,H,and Kamada, の Cryj lで症状のでる息者がいることもわかった (別 H.:A novel ESR method for horseradish peroxl‐ ― dase actvity using a combination of ″ aceta‐ 途報告予定)。また花粉量と抗原量は定性的には相関するものの大きく食い違う日の存在も明らかになった。今回開発した方法を用いればその時期のアレルゲン量を情報化することができるようになる. ■1ldophenol and hydroxylattline,and its applica‐ tion to enzyme immunoassays.Aれ ″″ ,Scケ, 14,1107, 1998. MIatsuo,T.,Shinzawa,H.,Togashi,H.,Aokl,MI., Sugahara,K。 ,et al.:]五ighly sensitive hepatitis B surface antgen detection by lneasuring stable ni‐ 文 troxide radical forlnatlon、 vith ESR spectroscopy. 献 F/2夕R協冴,c.B″ θ】 .ハイタ冴25,92開 1)榎本雅夫,大西成雄,安枝浩 ,嶽良博 ,硲田猛真 ,斎藤優子,十河英世,藤村聡 ,藤木嘉明, 瀬野悟史,井出武 :高感度 Cryj l測定法について。日本花粉学会会誌 46,)16,2000. 2)馬場康太郎 :スギ花粉症修飾因子としての花粉飛散量 (特集 ;鼻アレルギー・花粉症の修飾因子)。 DEVELOPMENT OF SUPER― 35,1998. Aoki,M【.,Saito,T.,Watanabe,H.,MIatsuo,T。 ,Saito, K.,et al.i Clinical signiicance Of a highiy sensitive enzyme immunoassay of hepatitis B surface anti― gen using a novel electron spin resonance tech‐ /″ nique.ェMタグ.ル γ .66,166-170,2002. θア SENSITIVE RADICAL Iい江MUNOASSAY FOR CRYJl MIasaaki Aoyamal)and Yuichi Takahashi2) D,杯サガサ ″サ 2/07L控 5″″″θ 7サ晩ご %″θ lo9′の協初″ タP7Ⅲ Cサ ″初″筋S″ サ ″サ 2o/P力 J″ C Hθ ″ 7物 g″サ We have been developed super― sensitive method of Cry j l lneasurement by ESR radicalilnmunoassay using″― acetamidophenol and hydroxylamine system.The detecton limit for Cry j l was 3.5 pg/ml.It is reported that the average content of Cry j l in each C町初￠ γ ″'C″ 筋ル″θ pollen is about 6 pg,therefore,we can detect one grain or ?サθ even less one grain ofthe pollen by our method.It was possible to inform the usefulinformation for″ sensitive C.″ θ れC″ rneasurement. pollinosis patients before development their symptoms due sensitive to the super―