関節リウマチ滑膜マクロファージを 標的とした軟骨・骨破壊抑制剤 鹿児島大学 大学院医歯学総合研究科 健康科学専攻 感染防御学講座 免疫学分野 講師 永井拓 鹿児島大学 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター 客員教授 松山隆美 注）発表当日には配付資料に載せていないデータと補足説明があります。 1 関節炎に対する局所投与薬の比較 持続時間 炎症抑制 ヒアルロン酸 ステロイド 生物製剤 短期 短期 長期 弱い 強い 強い 軟骨・骨 破壊抑制 薬価 なし あり１） あり２） 安価 安価 高価 １）初期のRA患者(発症期間が8ヶ月未満で中央値73日)でステロイド群と併用群（ステロイド+生物 製剤）間で同効果(Axelsen MB, et al. Ann Rheum Dis 2014;0:1–9. doi:10.1136/annrheumdis-2013-204537) ２）TNF製剤に抵抗性を示すRAではステロイドと同効果 (Roux CH, et al. J Rheumatol 2011 38:1009-1011) 2 関節リウマチ(RA)治療薬の 軟骨・骨破壊抑制に対する問題点 １）ステロイドや生物製剤の効能を高める目的で 関節内投与が治験で行われているが、軟骨・骨破 壊の抑制についてエビデンスに乏しい。 ２）生物製剤に抵抗性を示すRAでは成功例が少 ない。 ３）軟骨・骨破壊の責任分子は炎症性サイトカイン 以外にも存在する。単一の制御では期待する効 果が得られない場合がある。 3 本技術の背景① RA滑膜の活性化マクロ ファージは軟骨・骨破壊に関与する 関節リウマチ滑膜 正常滑膜 ・滑膜マクロファージはTNF-αや IL-6などの炎症性サイトカインを 広汎に分泌するだけでなく、破骨 細胞に分化する。(Nagayoshi. R., et al. A&R., 52:2666, 2005, Nagai T., et al. A&R., 54:3126, 2006) ・抗TNF製剤が有効な患者では、 滑膜マクロファージが減少する。 (Carla A., et al., A&R, 56:3869, 2007) サイトカイン 増殖因子 タンパク分解酵素 破骨細胞 軟骨・骨 4 本技術の背景② 滑膜マクロファージは葉酸 受容体β(FR-β)を発現する Ctrl CD14 （マクロファージマーカー） FR-β CD163 （マクロファージマーカー） RA OA 関節リウマチ(RA)および変形性関節炎(OA)患者の滑膜を抗FR-βで免疫染 色を行った。その結果、滑膜マクロファージはFR-βを発現する事が示された。 5 FR-β発現細胞中の陽性率 (%) 本技術の背景③ FR-β発現滑膜マクロ ファージが分泌するサイトカインの比較（免疫 組織染色） 100 ** * RA OA 80 60 40 20 0 TNF-α TGF-β IL-10 RAとOAの滑膜組織を用い、 FR-β発現滑膜マクロファージ のサイトカイン分泌を免疫染 色で比較したところ、TNF-α とTGF-β分泌量の相違が確 認された。(当教室 Tsuneyoshi et al., Scand J Rheumatol. 41:132, 2012 一部 編集) 6 葉酸結合タンパク質と発現組織 タンパク質名 発現組織・細胞 葉酸キャリアタンパク質（膜型） 全ての細胞 FR- （膜型） 上皮細胞（固形がん） FR-β （膜型） 組織内で活性化したマクロファージ （肝臓クッパー細胞で低発現、末梢血単球では未発現） FR-γ （分泌型） FR-δ （膜型） 好中球 制御性Ｔ細胞 7 本技術の背景④ 抗ヒトFR-βイムノトキシン の効果（RA滑膜-SCIDマウス移植モデル） Control rIT CD68 （マクロファー ジマーカー） VL VH IL-6 抗FR-β イムノトキシ ン（後述） TUNEL RA滑膜をSCIDマウスに移植後、イムノトキシンを移植組織周囲に投与した。移植組織の免疫染 色を行い、IL-6の減少とFR-β発現マクロファージの細胞死を確認した。また、RA滑膜マクロファー ジの破骨細胞への分化誘導時にイムノトキシンを添加し、破骨細胞の減少を確認した (当教室 Nagai et al., A&R., 54:3126, 2006 一部編集)。 8 背景まとめ • 間接内投与は全身投与に比べて軟骨・骨破 壊の抑制に有効と推察されるが、マウスモデ ルでは限界がある（関節が小さい）。 • そこで、ラット関節炎モデルにて、イムノトキシ ンによる軟骨・骨破壊の抑制効果を検討した。 9 実施例① マウス抗ラットFR-βモノクローナ ル抗体の作製 FR-β発現細胞株 対照用細胞株 FR-β発現 FR-β発現強度 FR-β発現強度 FR-β発現強度 チオグリコレート誘発ラット腹腔マクロファージ CD11b/c発現強度 （マクロファージマーカー） マウス抗ラットFR-βモノクロー ナル抗体(クローン名4A67、IgM タイプ)を作製し、反応性をラット FR-β強制発現細胞株とチオグ リコレート誘発ラット腹腔マクロ ファージで確認した。 10 FR-β発現マクロファージの選択除去を目的 としたイムノトキシン VL VH VL VH CDR 軽鎖 抗FRβイム ノトキシン リコンビナントタイプイムノトキシン：抗体の抗原 認識領域 (VH、VL）に、Phase IIで実績がある 遺伝子改変型緑膿菌外毒素（PE38）を組み込 んだ融合タンパク質。 抗体に比べて低分子(60 kDa)で血中半減期が 短い特徴をもつ。 重鎖 抗FRβ抗体 PE38はエンドサイトーシスにより 細胞内に取り込まれ、細胞死を誘 導する。（抗体に比べて低濃度で 作用する） The EMBO Journal (2000) 19, 5943 11 実施例② リコンビナントタイプ抗ラットFR-β イムノトキシンの作製 CDR1 CDR2 CDR3 VL VH kD ラットFRβ発現B300-19細胞 イムノトキシン 65- 対照タンパク質 49イムノトキシン濃度(ng/ml) 9-SH +SH -SH ラット腹腔マクロファージ 細胞死誘導率（％） VH イムノトキシン (62 kDa) 細胞死誘導率（％） 対照タンパク質 VH-PE38 (50 kDa) イムノトキシン濃度(ng/ml) 抗ラットFR-βイムノトキシンおよび対照タンパク質（重 鎖とPE38の融合）を大腸菌発現系から作製・精製し、 細胞死の誘発をラットFR-β強制発現系とチオグリコ レート誘発ラット腹腔マクロファージで確認した。 12 関節腫脹 (mm) 実施例③ 抗ラットFR-βイムノトキシンの関 節内投与はメチル化BSA誘発ラット関節炎 の関節腫脹を抑制する 対照タンパク質（50μg） イムノトキシン（2μg） イムノトキシン（10μg） イムノトキシン（50μg） ** **** ** * ** 対照タンパク質 (50μg, 2.0 mm) ** ** ** * ** ****** ** ***** ** ***** * ** *, P<0.05 イムノトキシン (50μg, 0.8 mm) mBSA投与(0) 関節内投与 Days Lewisラットにメチル化BSAを後肢左膝関節に注入して関節炎を誘発させた（0日）。誘発後（1, 3, 5, 7日）、 対照タンパク質 (VHPE)あるいはイムノトキシンを関節内に投与し、関節腫脹を計測した。縦軸は関節炎 誘発後の日数を示し、縦軸は正常関節幅（右膝）との増加 (mm)を示す。 13 実施例④ 抗ラットFR-βイムノトキシンの関 節内投与はメチル化BSA誘発ラット関節炎 の軟骨・骨破壊を抑制する 正常 対照タンパク質(50μg) 滑膜 滑膜 軟骨 骨髄 イムノトキシン(50μg) 滑膜 軟骨 骨髄 軟骨 骨髄 炎症スコア (0-3) 2.5 2 1.5 * * 1 滑膜肥厚スコア (0-2) 2.5 2 1.5 * * 1 0.5 0.5 0 0 イムノトキシン イムノトキシン 軟骨・骨破壊スコア (0-3) 軟骨・骨破壊領域 3 0.2 mm 3 2.5 2 1.5 1 0.5 * * 0 イムノトキシン 実施例③のラッ ト関節を脱灰後、 ヘマトキシリン・ エオシン染色を 行い、炎症、滑 膜肥厚、軟骨・ 骨破壊のスコア を比較した。 その結果、イム ノトキシン投与 は軟骨・骨破壊、 滑膜肥厚、炎症 を有意に抑制し た。 14 実施例⑤ 抗ラットFR-βイムノトキシンの関 節内投与は破骨細胞を減少させる 正常 CD68 マクロ ファー ジ 対照タンパク質 正常 イムノトキシン 対照タンパク質 イムノトキシン CatK （破骨 細胞） 0.1 mm FRβ ラット関節の免疫染色をCD68(マクロ ファージマーカー）、CatK（カテプシン K、破骨細胞マーカー）、FR-β抗体 を用いてラット関節の免疫染色を行 い、イムノトキシン投与群における破 骨細胞の減少を確認した。 0.2 mm 15 実施例⑥ 抗ラットFR-βイムノトキシンの関 節内投与では免疫原性が生じにくい 0.5 関節内投与 1 3 5 7 14 Days 21 Absorbance at 415 nm 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 ベースライン （0.1以下） 0.1 0.05 0 7 14 21 (n=5) (n=5) (n=12) メチル化BSA誘発ラットにイムノトキシン(50μg)の関節内投与を行い、関節炎誘発後7日、14 日、21日に採血し、血清中の抗PE38ラット抗体の抗体価をELISA法で測定した。その結果、 誘発後14日群の1個体を除き、ベースライン（0.1）以下の値を示した。 16 新技術の特徴・従来技術との比較 • 従来の問題点であった、関節内投与による抗FR-βイム ノトキシンの軟骨・骨破壊の抑制を確認した。 • 炎症組織のマクロファージに選択的な薬剤には、イムノ トキシンに比べて作製コストに優れる葉酸誘導体が挙 げられる。しかしながら、血中の葉酸濃度によって効果 が左右されやすい。 • 当該抗体はFR-βの反応において葉酸濃度の影響を受 けないクローンを用いている。 17 想定される用途 • 抗FR-βイムノトキシンは、PE38領域を任 意のタンパク質やペプチド、化合物と融合 可能である。 • 活性化マクロファージの検出系を基とした 用途（治療剤、診断剤）に貢献できる。 • ヒト、マウス、ラットに対するモノクローナル 抗体やイムノトキシンが利用可能。 18 実用化に向けた課題 • イムノトキシンの問題点である免疫原性と血 中半減期の改善。 • FR-β発現マクロファージの局在と機能の明確 化（特に病態の初期に出現するFR-β発現マク ロファージや正常組織に局在するクッパー細 胞について）。 • 毒性評価システム（急性ならびに慢性毒性） の確立。 19 企業への期待 • イムノトキシンの免疫原性と血中半減期につ いては、PEG化などに代表されるタンパク質 修飾技術により克服できると考えている。 • タンパク質修飾（ドラッグデリバリーシステム） 技術を持つ企業、毒性評価システムを持つ企 業との共同研究を希望。 • また、検出試薬を開発中の企業や慢性炎症 が関わる疾患への展開を考えている企業に は本技術の導入が有効と思われる。 20 本技術に関する知的財産権 • • • • 発明の名称 ：軟骨・骨破壊抑制剤 出願番号 ：PCT/JP2012/070872 出願人 ：国立大学法人鹿児島大学 発明者 ：永井拓、松山隆美 21 産学連携の経歴 • • • • 2008年 2009年 2011年2013年 JSTシーズ発掘試験に採択 JSTシーズ発掘試験つなぐしくみに採択 ImaginAb社と共同研究開始（継続中） JST A-STEP（探索タイプ）に採択 22 お問い合わせ先 鹿児島大学産学官連携推進センター 知的財産部門 ＴＥＬ 099-285-3881 ＦＡＸ 099-285-3886 e-mail [email protected] 23
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