大腸菌の病原性関連遺伝子保有状況 長野県環境保全研究所 ○笠原ひとみ・関口真紀・中沢春幸・藤田暁 １．【 はじめに】 はじめに 大腸菌（ Escherichia coli ）はヒトの腸管常在菌の一つであるが、一部に下痢を引き起こす ものがあり、これらは「下痢原性大腸菌」と総称され、病原機序の違いにより表 1 のとおり分 1) 類されている 。これまで下痢原性大腸菌と非下痢原性大腸菌の鑑別は主に血清型別検査によ り行われてきたが、近年の遺伝子検査法の急速な普及に伴い、PCR 法により病原関連遺伝子を 検索する方法が提唱され、それに基づいた検査体制が構築されつつある。 そこで今回、PCR 法によるスクリーニング法導入について検討するため、今般当所で保管し ている下痢症患者等か ら分離された大腸菌の うち、従来の判定方法 では下痢原性大腸菌に 分類されなかった分離 株について、PCR 法によ り病原関連遺伝子の検 索を行ったので概要を 報告する。 表1 下痢原性大腸菌の分類1) 分類 腸管出血性大腸菌 （EHEC） 腸管毒素原性大腸菌 （ETEC） 腸管侵入性大腸菌 （EIEC） 腸管病原性大腸菌 （EPEC） 腸管凝集付着性大腸菌 （EAggEC） 他の下痢原性大腸菌 （DAEC、EAST1EC等） 発生機序 毒素 毒素 侵入性 細胞局在 付着性 細胞凝集 付着性 不明 病原因子 マーカー VT1、VT2 定義 ベロ毒素（VT）産生性あるいはVT遺伝子が確認されたもの 易熱性エンテロトキシン（LT）、耐熱性エンテロトキシン（ST）ある いはその両者の産生性あるいは毒素遺伝子が確認されたもの 組織侵入性プラスミドを保有していること、あるいは組織新入生遺 invE 、ipaH 伝子が確認されたもの eae 、bfpA 、 培養細胞への局在性、またはそれに関連する遺伝子が確認され EAF たもの（VT、LT、ST、侵入性が確認されたものを除く） aggR 、 培養細胞への凝集付着性、またはそれに関連する遺伝子が確認 CDV432 されたもの（VT、LT、ST、侵入性が確認されたものを除く） afa 、astA 、 上記5つに該当しないが胃腸炎の原因と考えられるもの、生化学 CDC、cnf 的性状が同じものが多数の患者より検出された場合 LT、ST ２．【 材料 およ び方法】 び方法 （1）検査材料 平成 2 年（ 1990 年）から平成 25 年（2013 年 ）の 間 に 保健 所 ・ 表2 マルチプレックスPCRセット 医療機関等で患者から分離された O 抗原血清型別により下痢原 性大腸菌を疑い、当所に送付された大腸菌のうち、下痢原性大 腸菌と判定されなかった菌株 281 検体を対象とした。 プライマー 病原関連 セット 遺伝子 EXEC elt (LT) estA1 (ST1a) estA2 (ST1b) （2）検査方法 invE 病原関連遺伝子の検索は、DHL 寒天培地で菌を増殖後、国立保 VT1/2 VT2f 健医療科学院主催の平成 24 年度新興再興感染症技術研修資料に EpAll 従い、表 2 に示す病原関連遺伝子 10 種類についてマルチプレッ クス PCR 法により実施した。いずれかの遺伝子が検出された場 eae aggR afaD astA 分類 ETEC ETEC ETEC EIEC EHEC EHEC EPEC EAggEC DAEC EAST1EC 合は、表 1 に示す定義に従い下痢原性大腸菌分類をした。 ３．【 結果】 結果 281 株について検索した結果、37 株（13.2％）でいずれかの病原関連遺伝子を保有していた （表 3）。EHEC は O26 の 2 株で、いずれも VT 遺伝子とともに細胞への密着に関与するインチミ ン遺伝子 eae を保有していた。この 2 株はいずれも VT の検査法として以前から普及している RPLA 法により陰性と判定されたため、分離当時は EHEC と判明されなかったものと思われる。 2) EPEC は 12 株、EAggEC は 10 株であった。このうち、頻繁に発生するとされている血清型 に当てはまる（可能性を含む）のは EPEC で O125（:H21）の 1 種類 1 株、EAggEC では O15:H18、 O86a:H2、O111:H21、O126:H27 の 4 種類 7 株のみであり、頻繁に発生するとされている血清型 表3 当所保有菌株における下痢原性大腸菌検出状況 以外にも病原関連遺伝子を保有してい 病原関連遺伝子 る大腸菌が多く存在することが判明し 分類 血清型別 菌株数 eae た。 他の下痢原性大腸菌大腸菌は、DAEC 4 EHEC 小計 EPEC 株、EAST1EC 9 株であった。ETEC および EIEC の病原関連遺伝子が検出された株 はなかった。 一方、いずれの病原関連遺伝子も検出 されなかったのは 244 株あり、O 群型別 小計 EAggEC では O18、O1、O25、O6 が多く認められ た。このうち O18、O1 は、既存の報告に より EPEC や EHEC であるとされていたが、 現在では多くの菌株が VT や eae を保有 1） していないとされており 、今回もこ 小計 DAEC れらの血清型では検査したすべての菌 株から病原関連遺伝子は検出されな 小計 EAST1EC かった。 ４．【 考察】 考察 これまでの検査方法では下痢原性大 腸菌と判定されなかった大腸菌株のう ち 13.2％から病原関連遺伝子が検出さ れ、中でも従前の検査法では検出するこ 小計 陰性 O26 : H11 O6 O26 O26 O63 O121 O121 O125 O167 : : : : : : : : HNT HH11 H6 H19 H34 HNT H9 O6 O15 O86a O111 O111 O119 O126 O126 : : : : : : : : HUT H18 H2 HNT H21 HH7 H27 O15 O25 O25 OUT : : : : HHH4 H- O25 O78 O103 O128 O151 OUT : : : : : : HUT HNT H16 H42 HH- O1 O6 O18 O25 その他 とが難しかった EPEC および EAggEC とし て調査した半数以上の 22 株（59.5％） 小計 合計 *UT：Untypable NT：Not typed 2 2 1 1 3 3 1 1 1 1 12 1 1 1 1 2 1 1 2 10 1 1 1 1 4 1 1 1 1 4 1 9 39 11 49 27 118 244 281 2 2 1 1 3 3 1 1 1 1 12 astA aggR afaD VT1/2 2 2 1 1 2 1 1 1 2 1 1 2 9 1 1 1 1 2 1 1 2 10 1 1 1 1 4 1 1 1 1 4 1 9 14 20 10 4 2 が分類された。また、今まで病原性大腸 菌感染事例において頻繁に分離されるといわれていた血清型以外からも多くの下痢原性大腸菌 が確認された。一方、ETEC および EIEC の病原関連遺伝子が検出された株はなかった。ETEC に ついては従前から検出キットが市販されている等により検査法が確立されていたこと、EIEC に ついては生化学的性状が他の大腸菌と異なるため判別が比較的容易であったことにより、これ までの検査でも十分判別可能であったためと示唆された。 今回の検討では、O 血清型から下痢原性大腸菌であることが強く疑われた株を検査対象とし、 従来法では分類されなかった株のうち約 1 割の菌株が下痢原性大腸菌であることが判明したが、 さらに市販免疫血清では O 血清型別不能の大腸菌の中にも病原関連因子を保有しているものが 3) あるとの報告 もあり、従来の O 血清型別に依存した分類方法では、下痢原性大腸菌を見落と されていた可能性が危惧される。そのためにも病原関連因子をターゲットとした PCR 法による スクリーニング検査の導入が重要であると思われた。 【参考文献】 1） 国 立 感 染 症 研 究 所 ,厚 生 労 働 省 ： 病 原 微 生 物 検 出 情 報 Vol.33 No.1 1-7(2012.1) 2) MANUAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY 10TH EDITION:603-613 3 ）佐 藤 ら：市 販 免 疫 血 清 で は 同 定 で き な か っ た 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 に よ る 集 団 感 染 事 例 , 宮 城 県 保 健 環 境 セ ン タ ー 年 報 ,23,51-54(2005)
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