Advanced-nano-LC/MALDI

MSSJ2014 2P - 35
Advanced-nano-LC/MALDI-MSを用いた血漿中の糖タンパク質E-カドヘリンの糖ペプチド分析
Glycopeptide analysis of E-cadherin glycoprotein from human plasma with high sensitive advanced-nano-LC/MALDI-MS system
〇関谷禎規・金子直樹・谷村里都子・日置雄策・児嶋浩一・岩本慎一・田中耕一
（株）島津製作所田中最先端研究所
Sadanori Sekiya, Naoki Kaneko, Ritsuko Tanimura, Yusaku Hioki, Koichi Kojima, Shinichi Iwamoto, Koichi Tanaka
3. Results and Discussion
1. Introduction
MALDI-MSは、プロテオミクスやグライコミクス分野において強力な分析ツールであ
る。多種多様な成分が含まれる生体試料のMALDI-MS分析では、LCとMALDIをオフ
ラインで接続した LC/MALDI-MSが用いられている。我々はこれまでに、① nano-LC
②ナノリットルレベルの微量滴下を実現するnano-LC用カラム一体型スポッティングプ
ローブ（カラムプローブ）、③微小なDHB結晶を親水性アンカーとした高濃縮試料プ
レート、から構成される高感度なLC/MALDI-MS（Advanced-nano-LC/MALDI-MS）シ
ステムを開発した 1)。今回我々は、開発したAdvanced-nano-LC/MALDI-MSを用いて、
ヒト血漿中の糖タンパク質である内在性E-カドヘリンをモデル試料として糖ペプチド分
析を行った。E-cadherinは細胞接着分子でN型糖鎖をもつ糖タンパク質であり、糖鎖
が癌の転移や浸潤などに関係することが知られている。しかしながら、糖鎖の構造に
ついては詳細な解析が行われておらず不明な部分が多い。また、E-カドヘリンの糖ペ
プチドを混合物のまま測定する簡便な“Direct-MALDI分析”との比較も行った。
558 570
Domain 1
Propeptide
Domain 2
Domain 3
Transmembrane
3-2. Advanced-Nano-LC/MALDI分析
 参照データとして、市販の組換え型E-カドヘリンの糖ペプチド
分析を実施し、その解析結果を踏まえて内在性E-カドヘリン
の糖ペプチド構造を推定した。
622 637
N
N
Domain 4
3-1. Direct-MALDI分析
Figure 3. 組換え型E-カドヘリン（1000 ng）のマススペクトル
N型糖鎖結合部位
（コンセンサス配列）
Signal peptide
1 23
Koichi Tanaka Laboratory of Advanced Science and Technology, Shimadzu Corporation
N
N
Domain 5
155
Topological
domain
710
882
Asp-N消化で生成する糖鎖結合部位を含むペプチド配列
Peptide-1 （Pep1）: 552-DFEHVKNSTYTALIIA-567
Peptide-2 （Pep2）: 569-DNGSPVATGTGTLLLILS-586
Peptide-3 （Pep3）: 618-DLPPNTSPFTAELTHGASANWTIQYN-643
 組換え型E-カドヘリンではpeptide-1およびpeptide-3由来の
糖ペプチドが検出された。また、m/z 5800～6500付近にも糖
ペプチドが検出されたが、構造は推定できていない。
MS/MS
Figure 1. E-カドヘリンの構造図
2. Experimental Section
ヒト血漿
F(ab’)-PEG 24ビーズ抗体
F(ab’)
E-カドヘリンの精製
（IP: F(ab’)-PEG24 ビーズ抗体）
 Advanced nano-LC/MALDI分析では、N型糖ペプチドに加えてDirect-MALDI分析では検出されなかったO型糖ペプチドも検出された。
O型糖ペプチドのMS/MSも実施したが、糖鎖結合部位の同定には至らなった。
（抗E-cadherin抗体
（IgG）由来）
 E-カドヘリンのO型糖ペプチドについては、我々の知る限り報告例は無く、今回が初めての解析例となる。
PEG24
電気泳動
（SDS-PAGE）
Figure 6. O型糖ペプチド（2種）のMS/MSスペクトル
Figure 5. 内在性E-カドヘリン（血漿1000 µL）のマススペクトル
（市販品）
 m/z 6000～8000の範囲にも糖ペプチドと考えられるイオンピークが確認されたが、構造は推定できていない。
磁性ビーズ
ゲル内酵素消化
Table 1. 検出したE-カドヘリン糖ペプチドリスト
（酵素：Asp-N）
Advanced Nano-LC-MALDI
Figure 4. 内在性E-カドヘリン（血漿500 µL）のマススペクトル




 セルロース処理（糖ペプチド精製）
 3-AQ/CA（液体マトリックス）
 MALDI-DIT-TOFMS
Column probe
0 .15 0 m m
0 .0 75 m m
a. 溶融シリカ
キャピラリ
Nano-LC
150 mm
d. 逆相樹脂
Reversed phase
b. インラインフリット
2 mm
Laser sensor
c. 疎水コーティング
e. 端面
プレート表面を CYTOP
（CTX-109AE, 旭硝子）で
疎水性コーティング
（180℃・60分熱硬化）
逆相HPLC
カラムプローブ
プリスポットDHB
MALDI-DIT-TOFMS
LC-MALDI Condition
Nano-LC system：Prominence nano (Shimadzu Corp.)
Column：Column probe (RP resin; Unison UK-C18, Imtact)
O.D.：150 µm, I.D.：75 µm, Length：150 mm
Mobile Phase：A) 0.1% HFBA in water
B) 0.1% HFBA in MeCN
Gradient：35-65 min, B conc. 0-50 % (1.67 %/min)
Injection volume: 2 µL
LC (sample) flow rate：0.2 µL/min
Spotting interval：12 sec/well (40 nL/well)
MALDI-DIT-TOFMS
MALDI spotter
150 µm-DHB precoated plate
DHB
1 mm
 内在性E-カドヘリンではpeptide-3由来の糖ペプチドのみが
検出された。
4. Conclusion
開発したAdvanced Nano-LC/MALDIシステムを用いて、
極微量の血漿（1 µL）からでもE-カドヘリンの糖ペプチド
（O型糖ペプチド）を検出することができた。
Figure 2. Advanced Nano-LC/MALDI-MS system
N
型
糖
ペ
プ
チ
ド
血漿中のE-カドヘリンの糖ペプチドを質量分析した例は
これまでになく、本分析システムが生体試料の分析に対
して実用レベルにあることが示された。
本分析システムを分析対象試料に応じてカスタマイズす
ることによって、他の様々なバイオマーカー分析へ応用
することができる。
0.1 mm
プリスポットDHB：ピエゾインクジェット装置（Labojet-1000Bio, Microjet）で
塗布［DHB塗布量：0.4 µg/well（MDPNA 0.2 µg含む）］
種類
References
[1] Hioki Y et al. Anal. Chem. 2014, 86, 2549 − 2558
O
型
糖
ペ
プ
チ
ド
構造
Direct-MALDI
血漿 1000 µL
血漿 10 µL
血漿 1 µL
血漿 500 µL
Pep3
✓
✓
－
✓
Pep3
✓
✓
－
－
Pep3
✓
✓
－
✓
Pep3
✓
✓
－
－
Pep3
✓
✓
－
✓
Pep3
✓
✓
－
－
Pep3
✓
✓
－
✓
Pep3
✓
✓
－
－
Pep3
✓
✓
－
－
Pep3
✓
✓
－
✓
Pep3
✓
✓
－
✓
Pep3
✓
✓
－
✓
Pep3
✓
✓
－
✓
Pep3
✓
－
－
Pep4 + Hexose× 4
✓
✓
－
－
Pep4 + Hexose×3
✓
✓
－
－
Pep4 + Hexose×2
✓
－
－
－
Pep5 + Hexose×1
✓
✓
✓
－
 Peptide-5由来のO型糖ペプチドに関し
ては血漿1µLからでも検出できており、
Advanced Nano-LC/MALDI分析が高感
度であることが示された。
 Direct-MALDI分析で利用したセルロー
スによる糖ペプチド精製法は簡便ではあ
るが、この手法は親水性相互作用を利
用して糖ペプチドを回収するため、親水
性の低い糖ペプチドは回収効率が低下
する、あるいは回収できない問題を有す
る。一方、 Advanced Nano-LC/MALDI
分析では、E-カドヘリンの酵素消化物を
全てLC分析に用いるため、セルロース
精製のような糖ペプチドのロスを回避す
ることができる。
Acknowledgements
本研究は、日本学術振興会の最先端研究開発支援プログラムにより、助成を受けたものである。

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