バイオ医薬品分析をより高速・高分離に～ 2μm SECカラム “SWタイプ”

バイオ医薬品分析をより高速・高分離に
～ 2μm SECカラム “SWタイプ”
東ソー株式会社
バイオサイエンス事業部
JASIS 2014 新技術説明会
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
内容
• 新開発 SECカラム “SWタイプ” の特長
• 従来の TSKgel SWタイプとの比較
• 流速が分離に及ぼす影響
• 市販の UHPLC-SECカラムとの比較
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
2
内容
• 新開発 SECカラム “SWタイプ” の特長
• 従来の TSKgel SWタイプとの比較
• 流速が分離に及ぼす影響
• 市販の UHPLC-SECカラムとの比較
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
3
SEC とは？
“SEC" = Size Exclusion Chromatography
「サイズ排除クロマトグラフィー」
• 小さい分子は，固定相の細孔内部に拡散しながら移動するため移動速度が小さく溶出が遅い
• 大きい分子は，細孔内部まで拡散できないため移動速度が大きく溶出が早い
（サイズ排除効果）
抗体分子（測定試料）
Flow
aggregate
monomer
fragment
移動相
細孔
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
固定相
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新開発 TSKgel UP-SW mAb（仮称）の特長
• 粒子径 2 μm のシリカゲル表面にジオール基を化学結合し，
充塡剤表面の特性は従来の TSKgel® SW タイプと同様
（TSKgel は，東ソー株式会社の登録商標です）
• 細孔特性（細孔容積，較正曲線の傾きなど）を
抗体 (IgG) の二量体，単量体，フラグメントの分離に最適化
• UHPLC, HPLC いずれのシステムにも対応
（ただし，カラム性能を十分発揮させるためには，
デッドボリュームを低減したセミミクロ仕様であることが必要です）
• カラムサイズ: 分析カラム 2種類 + ガードカラム 2種類
• 超高分離用カラム： 4.6 mm I.D. x 30 cm （材質：ステンレス）
• 超高速分析用カラム： 4.6 mm I.D. x 15 cm （材質：ステンレス）
• ガードカラム：
4.6 mm I.D. x 2 cm （材質：ステンレス）
- 配管を使用して分析カラムに接続する通常型ガードカラム
- 分析カラムに直結できるねじ込み型ガードカラム「DCタイプ」
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充塡剤・カラムの仕様
（従来の TSKgel SWタイプとの比較）
新開発カラム
従来カラム
TSKgel
UP-SW mAb HR
TSKgel
UP-SW mAb HTP
TSKgel
UltraSW Aggregate
4.6 mm I.D.
x 30 cm
4.6 mm I.D.
x 15 cm
7.8 mm I.D.
x 30 cm
7.8 mm I.D.
x 30 cm
7.8 mm I.D.
x 30 cm
シリカゲル
シリカゲル
シリカゲル
シリカゲル
官能基
ジオール
ジオール
ジオール
ジオール
粒子径
2 μm
3 μm
4 μm
5 μm
細孔径
25 nm
30 nm
25 nm
25 nm
排除限界
分子量
800 kDa
2,500 kDa
（推定）
800 kDa
800 kDa
分子量
測定範囲
10 k – 500 kDa
10 k – 2,000 kDa
10 k – 500 kDa
10 k – 500 kDa
カラム
サイズ
基材
用途
抗体（二量体/単量体
/フラグメント）の超高
分離分析
抗体（二量体/単量体）
の超高速分析
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抗体（凝集体）の高
分離分析
TSKgel
SuperSW mAb HR
抗体（二量体/単量
体）の高分離分析
TSKgel
G3000SWXL
一般的なタンパク質，
抗体（二量体/単量
体）の高分離分析
6
内容
• 新開発 SECカラム “SWタイプ” の特長
• 従来の TSKgel SWタイプとの比較
• 流速が分離に及ぼす影響
• 市販の UHPLC-SECカラムとの比較
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標準タンパク質のクロマトグラムの比較
Conditions
Column:
A) TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
B) TSKgel SuperSW3000
4 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
C) TSKgel G3000SWXL,
5 μm, 7.8 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
A,B) 0.35 mL/min, C) 1.0 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm
A,B) micro flow cell, C) standard flow cell
Injection vol.: 10 μL
Sample:
1. thyroglobulin, 640,000 Da
(1’ thyroglobulin dimer)
2. γ-globulin, 155,000 Da
(2’ γ-globulin dimer)
3. ovalbumin, 47,000 Da
4. ribonuclease A, 13,700 Da
5. p-aminobenzoic acid, 137 Da
Particlce
size
N
(peak 4)
As
(peak 4)
A) TSKgel UP-SW mAb HR
2 μm
45,625
0.95
B) TSKgel SuperSW3000
4 μm
24,419
1.02
Column
5 μm
18,325
C) TSKgel G3000SW
XL
TOSOH
CORPORATION
Bioscience
Division
1.05
• 分離パターンは従来の G3000SWXL
および SuperSW3000 と同様
• 理論段数が従来のSWタイプより向上
8
G3000SWXL x 2本連結との比較
(1) ガンマグロブリン製剤の分離
Conditions
Column:
A) TSKgel G3000SWXL
5 μm, 7.8 mm I.D. x 30 cm x 2
B) TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
A) 1.0 mL/min, B) 0.35 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm
Injection vol.: 10 μL
Sample:
γ-globulin, human polyclonal
• G3000SWXL x 2本連結と
同等以上の分離能
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9
G3000SWXL x 2本連結との比較
(2) モノクローナル抗体の分離
Conditions
Column:
A) TSKgel G3000SWXL
5 μm, 7.8 mm I.D. x 30 cm x 2
B) TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
A) 1.0 mL/min, B) 0.35 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm
Injection vol.: 10 μL
Sample:
mouse-human chimeric IgG, monoclonal
1. trimer, 2. dimer, 3. monomer, 4. fragment
• G3000SWXL x 2本連結と
同等以上の分離能
Column
A) TSKgel G3000SWXL x 2
B) TSKgel UP-SW mAb HR
Dimension
Rs
Rs
Rs
mm I.D. x cmL (peak 1/2) (peak 2/3) (peak 3/4)
7.8x30+7.8x30
1.60
3.63
1.77
4.6 x 30
2.16
5.02
2.56
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
タンパク質の高分離分析に
要する時間を従来の1/2 に
短縮できます
10
内容
• 新開発 SECカラム “SWタイプ” の特長
• 従来の TSKgel SWタイプとの比較
• 流速が分離に及ぼす影響
• 市販の UHPLC-SECカラムとの比較
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流速がタンパク質の理論段数に及ぼす
影響
Conditions
Column:
TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
0.05-0.35 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 10 μL, injected via a Rheodyne® Model 8125
Sample:
bovine serum albumin (BSA), 66,500 Da
ribonuclease A, 13,700 Da
p-aminobenzoic acid, 137 Da
（Rheodyne は，IDEX Health & Scientific LLC 社の登録商標です）
• 分子量が大きいタンパク質（BSA，
リボヌクレアーゼ A ）では，流速が
小さいほど理論段数が高くなる
タンパク質の超高分離分析は，分析時間やシステムのデッドボリューム
による広がりを考慮した上で，できるだけ流速を下げることが望ましい
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流速と分離度 Rs（二量体/単量体）の関係
(TSKgel UP-SW mAb HR)
Conditions
Column:
TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
0.05-0.35 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 10 μL, injected via a Rheodyne Model 8125
Sample:
bovine serum albumin (BSA),
γ-globulin, human polyclonal
• 流速が小さいほど，
BSA の二量体/単量体，および
ガンマグロブリンの二量体/単量体の
分離度が向上
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低流速条件での超高分離分析
Conditions
Column:
TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
A) 0.35 mL/min, B) 0.05 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 10 μL, injected via a Rheodyne Model 8125
Sample:
mouse-human chimeric IgG, monoclonal
1. tetramer
2. trimer
3. dimer
4. monomer
5. fragment
Flow rate
Rs
(peak 1/2)
Rs
(peak 2/3)
Rs
(peak 3/4)
Rs
(peak 4/5)
A) 0.35 mL/min
0.88
2.20
5.07
2.52
B) 0.05 mL/min
1.49
3.51
7.00
3.34
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• システム（注入バルブ，配管，検
出器）の低デッドボリューム化に
留意し，流速を下げることによっ
て，30 cm カラム1本で抗体の
四量体～単量体，およびフラグメ
ントの超高分離を達成
14
粒子径が異なる SEC カラム間の
van Deemter プロットの比較
4 μm
2 μm
• 粒子径が小さいほど，流速を大きくした時の HETP の上昇（＝理論段数の低下）が
抑えられ，高速分析に有利となる
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15
流速と分離度 Rs（二量体/単量体）の関係
(TSKgel UP-SW mAb HTP)
Conditions
Column:
TSKgel UP-SW mAb HTP (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 15 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
0.05-0.6 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 10 μL, injected via a Rheodyne Model 8125
Sample:
bovine serum albumin (BSA),
γ-globulin, human polyclonal
• 流速を 0.5 mL/min に上げても
ガンマグロブリンの二量体/単量体の
ベースライン分離が可能
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高流速条件での標準タンパク質の分離
Conditions
Column:
TSKgel UP-SW mAb HTP (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
A) 0.35 mL/min, B) 0.50 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 5 μL, injected via a Rheodyne Model 8125
Sample:
1. thyroglobulin, 640,000 Da
(1’ thyroglobulin dimer)
2. γ-globulin, 155,000 Da
(2’ γ-globulin dimer)
3. ovalbumin, 47,000 Da
4. ribonuclease A, 13,700 Da
5. p-aminobenzoic acid, 137 Da
• 分析時間 5 min で標準タンパク質を
良好に分離
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17
流速と圧力の関係
Conditions
Column:
TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
TSKgel UP-SW mAb HTP (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 15 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate + 0.05 % sodium azide
Flow rate:
0.025-0.59 mL/min
Temperature: 25 °C
• 超高分離用カラム
TSKgel UP-SW mAb HR，
超高速分析用カラム
TSKgel UP-SW mAb HTP
どちらもカラム操作圧は 30 MPa 以下
耐圧が低い HPLC システムでも
使用できるカラムです
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18
内容
• 新開発 SECカラム “SWタイプ” の特長
• 従来の TSKgel SWタイプとの比較
• 流速が分離に及ぼす影響
• 市販の UHPLC-SECカラムとの比較
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SEC の分離性能を決める 2つの因子
1. 充塡剤の粒子径
粒子径を小さくする
理論段数
の向上
分子
サイズ
カラム圧力
の増大
較正曲線
2. 充塡剤の細孔特性
細孔容積を大きくする
（＝較正曲線の傾きを緩やかにする）
ピーク間隔
が広がる
分子
サイズ
溶出容量
充塡剤の
強度が低下
較正曲線
溶出容量
粒子径：大
分離度：小
細孔容積：小
粒子径：小
分離度：大
細孔容積：大
分離度：小
分離度：大
粒子径と細孔容積を最適化することで，低圧力かつ高分離な SEC カラムを実現
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標準タンパク質による較正曲線の比較
Conditions
Column:
TSKgel UP-SW mAb HTP (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 15 cm
commercial UHPLC-SEC column
1.7 μm, 4.6 mm I.D. x 15 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
0.35 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm
Injection vol.: 5 μL
Sample:
(1’ thyroglobulin dimer)
1. thyroglobulin, 640,000 Da
(2’ γ-globulin dimer)
2. γ-globulin, 155,000 Da
3. ovalbumin, 47,000 Da
4. ribonuclease A, 13,700 Da
5. p-aminobenzoic acid, 137 Da
• 市販 UHPLC-SEC カラムとくらべて
較正曲線の傾きが緩やか
elution time [min]
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標準タンパク質のクロマトグラムの比較
Conditions
Column:
A) TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
B) commercial UHPLC-SEC column
1.7 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
0.35 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 10 μL, injected via a Rheodyne Model 8125
Sample:
1. thyroglobulin, 640,000 Da
(1’ thyroglobulin dimer)
2. γ-globulin, 155,000 Da
(2’ γ-globulin dimer)
3. ovalbumin, 47,000 Da
4. ribonuclease A, 13,700 Da
5. p-aminobenzoic acid, 137 Da
N
(peak 4)
As
(peak 4)
Pressure
A) TSKgel UP-SW mAb HR
48,896
1.14
30 MPa
B) commercial UHPLC-SEC
57,668
1.15
33 MPa
Column
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
• 市販 UHPLC-SEC カラムとくらべて
ガンマグロブリン（ピーク2）近傍の
ピーク間隔が広い
抗体の分離に適した分画範囲
22
30 cm カラムによる
ガンマグロブリン製剤の分離
Conditions
Column:
A) TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
B) commercial UHPLC-SEC column
1.7 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
0.35 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 10 μL, injected via a Rheodyne Model 8125
Sample:
γ-globulin, human polyclonal
• ガンマグロブリン製剤の
二量体/単量体の分離能が高い
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
23
30 cm カラムによる
モノクローナル抗体の分離
Conditions
Column:
A) TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
B) commercial UHPLC-SEC column
1.7 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
0.35 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 10 μL, injected via a Rheodyne Model 8125
Sample:
mouse-human chimeric IgG, monoclonal
1. trimer
2. dimer
3. monomer
4. fragment
• モノクローナル抗体の三量体/二量体/
単量体の分離能が高い
• 単量体/フラグメントがベースライン分離
Column
Rs
(peak 1/2)
Rs
(peak 2/3)
Rs
(peak 3/4)
A) TSKgel UP-SW mAb HR
2.16
5.02
2.56
B) commercial UHPLC-SEC
1.64
4.66
2.57
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
24
30 cm カラムによる
抗体パパイン消化物の分離
Conditions
Column:
A) TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
B) commercial UHPLC-SEC column
1.7 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Mobile phase: 200 mmol/L phosphate buffer (pH 6.5)
Flow rate:
0.35 mL/min,
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 5 μL, injected via a Rheodyne Model 8125
Sample:
mouse IgG, monoclonal,
papain-digested for 30 min
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
Conditions
Column:
TSKgel UP-SW mAb HR (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm
Sample:
mouse IgG, monoclonal, papain-digested for 0-120 min
• 分子サイズが近接したフラグメント (~50 kDa)
である Fc と Fab が分離できた
25
15 cm カラムによる
ガンマグロブリン製剤の分離
Conditions
Column:
A) TSKgel UP-SW mAb HTP (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 15 cm
B) commercial UHPLC-SEC column
1.7 μm, 4.6 mm I.D. x 15 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
0.35 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 5 μL, injected via a Rheodyne Model 8125
Sample:
γ-globulin, human polyclonal
• ガンマグロブリン製剤の
二量体/単量体の分離能が高い
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
26
15 cm カラムによる
モノクローナル抗体の分離
Conditions
Column:
A) TSKgel UP-SW mAb HTP (prototype)
2 μm, 4.6 mm I.D. x 15 cm
B) commercial UHPLC-SEC column
1.7 μm, 4.6 mm I.D. x 15 cm
Mobile phase: 100 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)
+ 100 mmol/L sodium sulfate
+ 0.05 % sodium azide
Flow rate:
0.35 mL/min
Temperature: 25 °C
Detection:
UV 280 nm, micro flow cell
Injection vol.: 5 μL, injected via a Rheodyne Model 8125
Sample:
mouse-human chimeric IgG, monoclonal
1. trimer
2. dimer
3. monomer
4. fragment
• モノクローナル抗体の三量体/
二量体/単量体の分離能が高い
• 単量体/フラグメントの分離が良好
Rs
(peak 1/2)
Rs
(peak 2/3)
A) TSKgel UP-SW mAb HTP
1.52
3.56
B) commercial UHPLC-SEC
1.25
3.47
Column
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
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まとめ
新規開発 SECカラム “TSKgel UP-SW mAb（仮称）” をご紹介しました
• 従来のカラム TSKgel SW タイプより理論段数が高い，
抗体の二量体/単量体/フラグメントの分離に適した SEC カラムです
• 超高分離分析用カラム TSKgel UP-SW mAb HR は，カラム1本で
従来のカラム (TSKgel G3000SWXL) 2本連結よりも良好な分離が得られます
• 市販の UHPLC-SEC カラム (4.6 mm I.D. x 30 cm, 4.6 mm I.D. x 15 cm) よりも
良好な分離が得られます
• 低流速条件で超高分離分析が可能です
• 高流速条件でも良好な分離が得られ，抗体の二量体/単量体のベースライン分離が
可能です
• 以上の結果より，TSKgel UP-SW mAb は抗体医薬品の研究開発，品質管理に適
したカラムといえます
ご清聴ありがとうございました
TOSOH CORPORATION Bioscience Division
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