一残基の違いも検出！ - tosoh hplc site

JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
一残基の違いも検出！
～医薬抗体の異性体／凝集体の
HPLCによる分離を中心として～
東ソー株式会社
バイオサイエンス事業部
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
1
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
背景
医薬抗体の不均一性
・凝集
・断片化
・C末端リジンの欠失
・アスパラギン残基の脱アミド（Asn→Asp）
・アスパラギン酸残基の異性化（Asp→isoAsp）
・メチオニン残基の酸化
・N末端グルタミンのピログルタミン酸形成
・糖鎖構造の違い
・その他（PEG化など）
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
2
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
今回紹介する分離モード
1. イオン交換クロマトグラフィー (IEC)
•
イオン性の違い ⇒ アミノ酸残基の違い、脱アミド、
Ｎ末端、Ｃ末端の切断/変化
2. 疎水クロマトグラフィー (HIC)
•
疎水性の違い ⇒ 立体構造の違い、酸化、アミノ酸
残基の違い、凝集体
3. 逆相クロマトグラフィー(RPC)
•
分配性の違い ⇒ アミノ酸残基の違い
4. サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)
•
分子サイズの違い ⇒ 凝集体、分解物、PEG化
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
3
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
今回紹介する分離モード
1. イオン交換クロマトグラフィー (IEC)
•
イオン性の違い ⇒ アミノ酸残基の違い、脱アミド、
Ｎ末端、Ｃ末端の切断/変化
2. 疎水クロマトグラフィー (HIC)
•
疎水性の違い ⇒ 立体構造の違い、酸化、アミノ酸
残基の違い、凝集体
3. 逆相クロマトグラフィー(RPC)
•
分配性の違い ⇒ アミノ酸残基の違い
4. サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)
•
分子サイズの違い ⇒ 凝集体、分解物、PEG化
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
4
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
充てん剤の表面構造（IEC）
STAT の表面構造
NPRの表面構造
タンパク質
Protein
市販担体の表面構造例
Ionic
group
イオン基
タンパク質
イオン基
非多孔性担体
Hydrophilic
親水性鎖
chain
Non非多孔性担体
porous material
タンパク質
イオン基
非多孔性担体
（疎水性）
親水性ﾎﾟﾘﾏｰ層
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
5
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
市販抗体医薬の分析例（IEC）
TSKgel CM-STAT(4.6mmI.D.x10cm)
Conditions
Column
: TSKgel CM-STAT (4.6mmI.D. x 10cm)
Eluent
: A; 20mmol/L MES (pH6.0)
B; 20mmol/L MES + 0.5mol/L NaCl (pH6.0)
Gradient :
0min
10% B
15min
30% B
15.1min 100% B
18min
100% B
18.1min
10% B
23min
10% B
Flow rate : 1.0mL/min
Detection : UV (280nm)
Temp.
: 25℃
Inj. volume : 20μL
Conc.
: 0.5g/L
Sample
: A ; humanized, IgG1
B ; humanized, IgG1
C ; chimera, IgG1
D ; chimera, IgG1
E ; chimera, IgG1
80
70
60
E
mAU
50
40
D
30
C
20
B
10
A
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
min
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
30
32
34
(財)相模中央化学研究所柿谷均博士のご厚意によります。
6
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
市販抗体医薬EのC末端Lys切断（IEC）
TSKgel CM-STAT(4.6mmI.D.x10cm)
Conditions
Column
: TSKgel CM-STAT (4.6mmI.D. x 10cm)
Eluent
: A; 20mmol/L MES (pH6.0)
B; 20mmol/L MES + 0.5mol/L NaCl (pH6.0)
Gradient :
0min
10% B
15min
30% B
15.1min
100% B
18min
100% B
18.1min
10% B
23min
10% B
Flow rate : 1.0mL/min
Detection : UV (280nm)
Temp.
: 25℃
Inj. volume : 20μL
Conc.
: 0.5g/L
Sample
: therapeutic antibody treated and antreated
with carboxypeptidaseB
55
50
45
40
35
mAU
30
treated with
carboxypeptidase B
25
20
KK
K
15
10
5
Before
treatment
0
-5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
min
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
13
14
15
Procedure :
To a 35μL of therapeutic antibody (10g/L), 1μL of
carboxypeptidase B (Sigma C9584, 140U/mg protein, 5g/L
in PBS) was added and incubated for 3 hours at 37 ℃.
After adding 664μL of 20mmol/L MES pH6.0 to dilute the
antibody concentration of 0.5g/L, 20μL of the diluted
sample was injected.
7
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
脱アミド異性体 (パパイン消化物)の分析（IEC）
医薬抗体B
↓
陽イオン交換クロマトグラフィーによる分離(TSKgel BioAssist S)
↓
各ピークを抗体濃度2g/Lに調製
(0.1mol/L Tris-HCl 20mmol/L Cysteine 4mmol/L EDTA pH7.2)
↓
1g/Lパパイン溶液を2vol%添加
↓
37℃ 2時間
↓
TSKgel CM-STAT、SP-STATによる分析
Papain: from papaya latex
Sigma P4762, 14Units/mg protein
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
8
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
脱アミド異性体 (パパイン消化物)の分析（IEC）
110
3.25
Peak2
3.00
2.75
isoAsp102
2.50
80
Peak1
2.00
Peak3
スクシンイミド中間体
イソアスパラギン酸(isoAsp)
60
1.50
50
1.25
40
1.00
30
0.75
0.50
20
0.25
10
0.00
0
-0.25
2
4
6
8
10
12
14
16
18
-10
min
Structural difference
Deamidated (to Asp) at Asn30 of one light chain
Main peak form
Isomerized (to isoAsp) at Asp102 of one heavy chain
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
%
mAU
アスパラギン(Asn)
70
1.75
Peak
1
2
3
アスパラギン酸(Asp)
90
Asp30
2.25
-0.50
0
脱アミド/異性化
100
Conditions
Column
: TSKgel CM-STAT (4.6mmI.D. x 10cm)
Eluent
: A; 20mmol/L MES (pH6.0)
B; 20mmol/L MES + 0.5mol/L NaCl (pH6.0)
Gradient :
0min
10% B
15min
25% B
15.1min 100% B
18min
100% B
18.1min
10% B
23min
10% B
Flow rate : 1.0mL/min
Detection : UV (280nm)
Temp.
: 30℃
Inj. volume : 20μL
Conc.
: 0.2g/L
at LC Asn30
Asn/Asp
Asn/Asn
Asn/Asn
at HC Asn55
Asn/Asn
Asn/Asn
Asn/Asn
at HC Asp 102
Asp/Asp
Asp/Asp
Asp/isoAsp
9
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
脱アミド異性体 (パパイン消化物)の分析（IEC）
37.5
TSKgel CM-STAT
35.0
papain
30.0
27.5
papain
30.0
27.5
Peak3
Peak3
25.0
22.5
20.0
17.5
papain
Asp30
15.0
LC Asn30
→ Asp30
22.5
LC Asn30
→ Asp30
mAU
mAU
HC Asp102
→ isoAsp102
isoAsp102
32.5
25.0
20.0
17.5
12.5
10.0
10.0
7.5
papain
Asp30
15.0
Peak1
12.5
Peak1
7.5
papain
5.0
papain
5.0
2.5
0.0
0
TSKgel SP-STAT
35.0
HC Asp102
→ isoAsp102
isoAsp102
32.5
37.5
2.5
Peak2
1
2
3
Conditions
Column
Eluent
Gradient
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
0.0
0
Peak2
1
2
3
4
min
: left: TSKgel CM-STAT (4.6mmI.D. x 10cm)
right: TSKgel SP-STAT (4.6mmI.D. x 10cm)
: A; 20mmol/L MES (pH6.0)
B; 20mmol/L MES + 0.5mol/L NaCl (pH6.0)
:
0min
0% B
15min
25% B
15.1min
100% B
18min
100% B
18.1min
0% B
23min
0% B
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
min
Flow rate
Detection
Temp.
Inj. volume
Conc.
: 1.0mL/min
: UV (280nm)
: 30℃
: 20μL
: 0.2g/L
10
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
pHグラジエントによる抗体医薬分析（IEC）
TSKgel SP-STAT
20
8
16
7
18
7
14
6
16
6
5
14
5
4
12
4
10
3
8
2
6
1
UV 280nm
12
10
3
8
2
6
1
4
UV 280nm
8
pH meter (mV)
18
0
4
0
2
-1
2
-1
0
-2
0
-2
-3
-2
-2
0
10
20
30
40
Elution time (min)
pH meter (mV)
TSKgel CM-STAT
-3
0
10
20
30
40
Elution time (min)
Column
Eluent
: TSKgel CM-STAT (4.6 mmI.D. x 10 cm), TSKgel SP-STAT (4.6 mmI.D. x 10 cm),
: A; 10 mM NaCl in 20 mM MES + 20 mM HEPES (pH5.4)
B; 10 mM NaCl in 20 mM MES + 20 mM HEPES (pH9.0)
Gradient : A →B 30min linear
Flow rate : 1.0 mL/min
Detection : UV (280nm)
Sample : 医薬抗体E
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
11
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
今回紹介する分離モード
1. イオン交換クロマトグラフィー (IEC)
•
イオン性の違い ⇒ アミノ酸残基の違い、脱アミド、
Ｎ末端、Ｃ末端の切断/変化
2. 疎水クロマトグラフィー (HIC)
•
疎水性の違い ⇒ 立体構造の違い、酸化、アミノ酸
残基の違い、凝集体
3. 逆相クロマトグラフィー(RPC)
•
分配性の違い ⇒ アミノ酸残基の違い
4. サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)
•
分子サイズの違い ⇒ 凝集体、分解物、PEG化
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
12
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
市販抗体医薬品の分析例（HIC）
TSKgel Butyl-NPR(4.6mmI.D.x10cm)
40
Conditions
Column
: TSKgel Butyl-NPR (4.6mmI.D. x 10cm)
Eluent
: A; 20mmol/L PB 2MAS (pH7.0)
B; 20mmol/L PB (pH7.0)
Gradient :
0min
50% B
20min
80% B
20.1min 100% B
25min
100% B
25.1min
50% B
30min
50% B
Flow rate : 1.0mL/min
Detection : UV (280nm)
Temp.
: 35℃
Inj. volume : 20μL
Conc.
: 0.25g/L
Sample
: A ; humanized, IgG1
B ; humanized, IgG1
C ; chimera, IgG1
D ; chimera, IgG1
E ; chimera, IgG1
35
30
E
mAU
25
D
20
15
C
10
B
5
0
-5
0
A
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
min
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
13
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
脱アミド異性体 (パパイン消化物)の分析（HIC）
医薬抗体B
↓
陽イオン交換クロマトグラフィーによる分離(TSKgel BioAssist S)
↓
各ピークを抗体濃度2g/Lに調製
(0.1mol/L Tris-HCl 20mmol/L Cysteine 4mmol/L EDTA pH7.2)
↓
1g/Lパパイン溶液を2vol%添加
↓
37℃ 2時間
↓
TSKgel Butyl-NPR （4.6mmI.D.×10cm）による分析
Papain: from papaya latex
Sigma P4762, 14Units/mg protein
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
14
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脱アミド異性体 (パパイン消化物)の分析（HIC）
TSKgel Butyl-NPR(4.6mmI.D.x10cm)
350
Fab peaks
325
300
275
脱アミド
Fc peaks
HC Asp102
→ isoAsp102
isoAsp102
アスパラギン酸(Asp)
250
Peak3
225
アスパラギン(Asn)
スクシンイミド中間体
200
イソアスパラギン酸(isoAsp)
mAU
175
150
125
Peak2
100
75
LC Asn30
→ Asp30
50
Asp30
25
0
Peak1
-25
-50
2
3
4
5
6
7
8
9
Conditions
Column
: TSKgel Butyl-NPR (4.6mmI.D. x 10cm)
Eluent
: A; 20mmol/L Phosphate buffer containing
2mol/L (NH4)2SO4 (pH7.0)
B; 20mmol/L Phosphate buffer (pH7.0)
Gradient : 20min linear gradient from 25 to 60%B
Flow rate : 1.0mL/min
Detection : UV (214nm)
Temp.
: 35℃
Inj. volume : 2µL
Conc.
: 2g/L
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
min
Peak
1
2
3
Structural difference
Deamidated (to Asp) at Asn30 of one light chain
Main peak form
Isomerized (to isoAsp) at Asp102 of one heavy chain
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
at LC Asn30
Asn/Asp
Asn/Asn
Asn/Asn
at HC Asn55
Asn/Asn
Asn/Asn
Asn/Asn
at HC Asp 102
Asp/Asp
Asp/Asp
Asp/isoAsp
15
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メチオニン酸化異性体（パパイン消化物）の
分析（HIC）
医薬抗体B
↓
1g/Lに調製
(5mmol/L NaOAc 150mmol/L NaCl 0.01% Tween20 pH5.0)
↓
70% t-BHP溶液を10倍希釈したものを1,0.1vol%添加
↓
25℃ 20時間
↓
透析
(0.1mol/L Tris-HCl pH7.2)
↓
抗体濃度2g/Lに調製
(0.1mol/L Tris-HCl 20mmol/L Cysteine 4mmol/L EDTA pH7.2)
↓
1g/Lパパイン溶液を2vol%添加
↓
37℃ 2時間
↓
TSKgel Butyl-NPR（4.6mmI.D.×10cm）による分析
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
16
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メチオニン酸化異性体（パパイン消化物）の
分析（HIC）
TSKgel Butyl-NPR(4.6mmI.D.x10cm)
酸化されたメチオニンの数（Met-255 → Met(O)-255
and/or Met-431 → Met(O)-431）
400
メチオニン酸化
350
Fab peaks
Fc peaks
300
oxidation
1
250
0
2
mAU
0.1% tBHP
200
Met
Met(O)
150
0.01% tBHP
100
50
0% t-BHP(control)
0
-50
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
min
Conditions
Column
: TSKgel Butyl-NPR (4.6mmI.D. x 10cm)
Eluent
: A; 20mmol/L Phosphate buffer containing
2mol/L (NH4)2SO4 (pH7.0)
B; 20mmol/L Phosphate buffer (pH7.0)
Gradient : 20min linear gradient from 25 to 60%B
Flow rate : 1.0mL/min
Detection : UV (214nm)
Temp.
: 35℃
Inj. volume : 2µL
Conc.
: 2g/L
t-BHP: tert-Butylhydroperoxide
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
17
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
今回紹介する分離モード
1. イオン交換クロマトグラフィー (IEC)
•
イオン性の違い ⇒ アミノ酸残基の違い、脱アミド、
Ｎ末端、Ｃ末端の切断/変化
2. 疎水クロマトグラフィー (HIC)
•
疎水性の違い ⇒ 立体構造の違い、酸化、アミノ酸
残基の違い、凝集体
3. 逆相クロマトグラフィー(RPC)
•
分配性の違い ⇒ アミノ酸残基の違い
4. サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)
•
分子サイズの違い ⇒ 凝集体、分解物、PEG化
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
18
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
TSKgel Protein C4-300の表面構造（RPC）
CH3
CH3
CH3
CH3
CH2
CH2
CH2
CH2
CH3
CH2 CH2
H3C Si
O Si O Si H C Si CH
H3C Si CH3
3
3
H3C
O O
O
O
O
シリカゲル
ポリメリック型ブチル（C4）基を導入
→ ODSカラムよりも疎水性が低いため
タンパク質の吸着を抑制
残存シラノール基をエンドキャップ
→ 優れた耐久性
30 nm の細孔径
→ タンパク質が出入りできる大きさの
細孔が高分離に寄与
多孔性
シリカゲル
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
3 µm の粒子径
→ 高い理論段数
19
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
医薬抗体（ジスルフィド還元物）の分析（RPC）
H鎖
Abs. (215 nm)
L鎖
mAb-2
L鎖
H鎖
mAb-1
15
16
17
18
19
20
Time [min]
21
22
23
24
測定条件
カラム： TSKgel Protein C4-300 (4.6 mmI.D. ×15 cm)
溶離液A： H2O/ACN/TFA = 90/10/0.05 (v/v/v)
溶離液B： H2O/ACN/TFA = 20/80/0.05 (v/v/v)
グラジエント： B 0% (0 min) ― 100% (45 min)
流速： 1.00 mL/min，検出： UV 215nm
温度： 50℃，注入量： 100 uL
試料： mAb-1, mAb-2, each reduced with dithiothreitol
H鎖に親水性の
高い成分が存在
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
20
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
今回紹介する分離モード
1. イオン交換クロマトグラフィー (IEC)
•
イオン性の違い ⇒ アミノ酸残基の違い、脱アミド、
Ｎ末端、Ｃ末端の切断/変化
2. 疎水クロマトグラフィー (HIC)
•
疎水性の違い ⇒ 立体構造の違い、酸化、アミノ酸
残基の違い、凝集体
3. 逆相クロマトグラフィー(RPC)
•
分配性の違い ⇒ アミノ酸残基の違い
4. サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)
•
分子サイズの違い ⇒ 凝集体、分解物、PEG化
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
21
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
抗体分析用SECカラム
カラム
TSKgel SuperSW mAb HR
(4 um, 7.8 mmID x 30 cm)
TSKgel SuperSW mAb HTP
(4 um, 4.6 mmID x 15 cm)
TSKgel UltraSW Aggregate
(3 um, 7.8 mmID x 30 cm)
特長と主な用途
•較正曲線はTSKgel G3000SWXLに類似
•粒子径を４μmにすることで高性能分離を達成
•二量体/単量体/抗体断片の高性能分離
•R&D (物性評価), 品質管理
•較正曲線はTSKgel G3000SWXLに類似
•カラム長さを15cmとすることでハイスループットを達成
•二量体含量の超高速、短時間分析
•R&D (スクリーニング), 品質管理
•二量体以上の抗体分離に適したポアサイズに設計
•凝集体（二量体以上）の高性能分離
•R&D (物性評価)
• TSKgel SuperSW mAb HTP カラムは、UHPLC用カラムではありません
• 従来の汎用HPLC システムで迅速分析が可能です
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
22
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
抗体医薬品の凝集体分析(SEC)
30
ABS @ 280 nm
Monoclonal
antibody-2
monomer
dimer
20
TSKgel
UltraSW Aggregate
(7.8mmID x 30cm)
10
trimer
aggregates
0
3
5
7
9
11
13
15
17
13
15
17
Time [min]
30
ABS @ 280 nm
Monoclonal
antibody-2
monomer
dimer
20
TSKgel
SuperSW mAb HR
(7.8mmID x 30cm)
10
trimer
aggregates
0
3
5
7
9
11
Time [min]
Column:
Elution :
Flow rate:
Sample:
TSKgel UltraSW Aggregate (7.8 mm ID x 30 cm), TSKgel SuperSW mAb HR (7.8 mm ID x 30 cm)
0.2 mol/L phosphate buffer (pH 6.7) + 0.05% NaN3
0.8 mL/min;
Temperature: 25℃;
Detection: UV(280 nm)
monoclonal antibody-2 (mouse-human chimeric IgG), 10 uL
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
23
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
標準タンパク質の分離(SEC)
5
200
1
2
4
Conditions
Column:
A. TSKgel SuperSW mAb HTP
(4.6 mmID x 15 cm)
A. TSKgel SuperSW mAb HTP (4.6 mmID x 15 cm),
B. TSKgel UltraSW Aggregate (7.8 mmID x 30 cm),
C. TSKgel SuperSW mAb HR(7.8 mmID x 30 cm),
D. TSKgel G3000SWXL (7.8 mmID x 30 cm)
Mobile phase : 200 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7) + 0.05% NaN3
Flow rate:
A. 0.35 mL/min, B-D. 1.0 mL/min
Temperature: 25℃
Detection:
UV 280 nm
Injection vol.: A. 5 μL, B-D. 10 μL
Samples:
1. Thyroglobulin (MW 640,000) (A: 2.0 g/L, B-D: 0.5 g/L)
2. γ-Globulin (MW 155,000) (A: 1.5 g/L, B-D: 1.0 g/L)
3. Ovalbumin (MW 47,000) (A: 1.5 g/L, B-D: 1.0 g/L)
4. Ribonuclease A (MW 13,700) (1.5 g/L)
5. p-Aminobenzoic acid (MW 137) (0.01 g/L)
3
4
5
150
UV 280nm
2
B. TSKgel UltraSW Aggregate
(7.8 mmID x 30 cm)
3
1
100
C. TSKgel SuperSW mAb HR
(7.8 mmID x 30 cm)
50
D. TSKgel G3000SW XL
(7.8 mmID x 30 cm)
0
0
2
4
6
8
Time [min]
10
12
TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION
14
24
JASIS2012新技術説明会 2012/09/07
抗体断片の分析（SEC）
35
25
ABS @280 nm [AU]
30
25
Monomer
20
15
Rs= 2.46
ABS @280 nm [AU]
A. TSKgel SuperSW mAb HTP
(4.6 mmID x 15 cm)
Fragments
(Fab + Fc)
F(ab')2
Dimer
10
5
0
Rs= 2.49
15
10
5
0
2
3
4
5
6
7
Time [min]
B. TSKgel SuperSW mAb HR
(7.8 mmID x 30 cm)
20
4
5
6
7
8
25
Rs= 2.87
ABS @280 nm [AU]
25
ABS @280 nm [AU]
C. TSKgel UltraSW Aggregate
(7.8 mmID x 30 cm)
20
15
10
5
0
D. TSKgel G3000SW XL
(7.8 mmID x 30 cm)
20
9
Time [min]
10
11
12
13
14
11
12
13
14
Rs= 2.50
15
10
5
0
4
5
6
7
8
9
Time [min]
10
11
12
13
14
4
5
6
7
8
9
Time [min]
10
Conditions
Column; A. TSKgel SuperSW mAb HTP (4.6 mmID x 15 cm), B. TSKgel SuperSW mAb HR(7.8 mmID x 30 cm),
C. TSKgel UltraSW Aggregate, (7.8 mmID x 30 cm), D. TSKgel G3000SWXL (7.8 mmID x 30 cm)
Elution:
200 mmol/L phosphate buffer (pH 6.7)+ 0.05% NaN3
Flow rate:
A 0.35 mL/min; B-D 1.0 mL/min
Temperature:
25 ℃,
Detection: UV(280 nm)
• 単量体と抗体断片の分離においては、
Samples:
10 g/L IgG digested with papain for 0-24 hr
TSKgel SuperSW mAb HRが最も高い分離能を示す
Injection volume: A 5 μL; B-D 10 μL
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まとめ
・抗体医薬や組換えタンパク質など、タンパク質医薬品がすでに
多く市販されており、品質管理や開発などにおいて、不均一性
検出へのニーズがますます高まっています。
・イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーでは、非
多孔性小粒径担体を充てんした高分離能カラムを使用すること
により、脱アミドや酸化などの１残基の違いの検出も可能です。
・大きな細孔径を持つTSKgel Protein C4-300を用いることで
タンパク質の逆相クロマトグラフィーによる分析も可能です。
・サイズ排除クロマトグラフィーは凝集体や断片、PEG化タンパ
ク質など、分子サイズが変化する物質の分離に有効です。
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