ペプチドワクチン投与を受けた健常例およびCML例における抗原ペプチド特異的T細胞受容体（TCR）レパトワの解析新潟大学医学部保健学科検査技術科学専攻4年　M13D942H　白井竜二目的本研究室ではMLPC法（混合リンパ球ペプチド培養法）を用いて、体内に存在するCTL（細胞傷害性T細胞）を１個から増幅して解析し、 MLPC法がCTLの頻度測定および機能解析において極めて有用であることを報告してきた。本研究では、WT1ペプチドワクチン施行例におけるWT1ペプチドに特異的なCTLのTCR Vβ（T細胞受容体β鎖可変領域）レパトワのクローナリテイを解析するため、MLPC法とFACSを用いて、TCR Vβレパトワの検討を行った。 T細胞受容体(TCR) CD8+T細胞 Vβ Jβ Vβ1～ Jβ1～ TCR MHCクラスⅠ 抗原ペプチド抗原提示細胞 Dβ TCRのα鎖β鎖には、それぞれ定常 Dβ1～ α1 部と可変部がある。この可変部が提示される様々な抗原ペプチドをMHC分子を介して認識する。Ｄ T細胞受容体抗原認識部抗原ペプチドに対する特異性を決定しているのが可変部の3つの相補性決定領域（CDR）である。特に3つ目のCDR3が結合に大きく関わっている。その抗原認識部では、VDJ可変部遺伝子の再構成や塩基の挿入や欠失が生じる。その結果、膨大な抗原を認識し得る多様性を獲得する。結果1 ペプチド投与を受けた健常例におけるペプチド特異的TCRVβ 0 Vb 1 Vb 2 Vb 3 Vb 4 Vb 5.1 Vb 5.2 Vb 5.3 Vb 7.1 Vb 7.2 Vb 8 Vb 9 Vb 11 Vb 12 Vb 13.1 Vb 13.2 Vb 13.6 Vb 14 Vb 16 Vb 17 Vb 18 Vb 20 Vb 21.3 Vb 22 Vb 23 % Vβ usage in CD8+ lymphocytes WT1ペプチド投与を受けた健常例の末梢血CD8＋T細胞 15 10 5 TCR Vβ 健常例におけるMLPC2週目のWT1テトラマー解析結果 mWT1 tetramer-PE 035 MT B2.035 100 FITC-CD8 036 MT B3.036 104 040 MT B7.040 100 FITC-CD8 FITC-CD8 104 FITC-CD8 104 100 FITC-CD8 104 100 FITC-CD8 100 FITC-CD8 038 MT B5.038 104 042 MT B9.042 104 046 MT C3.046 050 MT C7.050 100 FITC-CD8 041 MT B8.041 045 MT C2.045 100 100 037 MT B4.037 100 FITC-CD8 100 FITC-CD8 104 100 FITC-CD8 104 104 100 FITC-CD8 104 048 MT C5.048 104 051 MT C8.051 104 FITC-CD8 043 MT B10.043 047 MT C4.047 104 100 039 MT B6.039 CD8-FITC 100 FITC-CD8 100 FITC-CD8 104 044 MT B11.044 100 FITC-CD8 104 049 MT C6.049 104 100 FITC-CD8 104 WT1ペプチド投与を受けた健常例のMLPC後のテトラマー陽性well中のCD8+細胞のレパトワ解析 D3 well mWT1-tetramer mWT1-tetramer 21.3% (/ CD8+ T cells) Vb5.3 0.00 Vb9 0.00 Vb7.1 0.84 Vb3 0.00 Vb5.2 CD8 CD8 0.00 Vb2 96.1 Vb18 0.00 Vb16 0.00 Vb23 0.00 Vb12 0.00 Vb17 0.52 Vb1 1.07 Vb5.1 0.51 Vb20 0.00 Vb11 0.00 Vb21.3 0.00 WT1特異的TCRの 96.1％がVβ2を使用 Vb22 2.11 Vb14 0.00 Vb13.1 Vb13.6 1.68 0.84 Vb8 0.00 Vb4 Vb13.2 0.00 0.44 Vb7.2 0.00 WT1ペプチド投与を受けた健常例のMLPC後のテトラマー陽性well中のCD8+細胞のレパトワ解析 D3 well mWT1-tetramer 21.3% (/ CD8+ T cells) CD8 average + 1SD : 23.5 結果2 ペプチドワクチンを受けたCML例におけるペプチド特異的TCRVβ Vb1 Vb2 Vb3 Vb4 Vb5.1 Vb5.2 Vb5.3 Vb7.1 Vb7.2 Vb8 Vb9 Vb11 Vb12 Vb13.1 Vb13.2 Vb13.6 Vb14 Vb16 Vb17 Vb18 Vb20 Vb21.3 Vb22 Vb23 % Vβ usage in CD8+ lymphocytes WT1ペプチドワクチン施行CML例の末梢血CD8＋T細胞 10 8 6 4 2 0 TCR Vβ CML例におけるMLPC2週目のWT1テトラマー解析結果 004 YA B2.004 100 CD8-FITC 005 YA B3.005 104 mWT1 tetramer-PE 010 YA B8.010 100 CD8-FITC CD8-FITC 104 CD8-FITC 104 100 CD8-FITC 104 104 100 CD8-FITC 104 CD8-FITC CD8-FITC 104 100 CD8-FITC 104 018 YA C6.018 104 023 YA C11.023 100 100 007 YA B5.007 012 YA B10.012 017 YA C5.017 022 YA C10.022 100 CD8-FITC 011 YA B9.011 016 YA C4.016 100 100 006 YA B4.006 104 100 CD8-FITC CD8-FITC CD8-FITC 104 013 YA B11.013 100 CD8-FITC 104 019 YA C7.019 104 024 YA D2.024 100 100 008 YA B6.008 100 CD8-FITC 100 CD8-FITC CD8-FITC CD8-FITC 104 014 YA C2.014 100 CD8-FITC 104 100 CD8-FITC 104 100 CD8-FITC CD8-FITC 104 100 CD8-FITC 104 021 YA C9.021 104 026 YA D4.026 104 100 015 YA C3.015 020 YA C8.020 025 YA D3.025 104 100 009 YA B7.009 100 CD8-FITC 104 027 YA D5.027 104 100 CD8-FITC 104 WT1ペプチドワクチンを受けたCML例のMLPC後のテトラマー陽性well中のCD8+細胞のレパトワ解析 C10 well mWT1-tetramer 71.0% (/ CD8+ T cells) Vb5.3 0.00 Vb7.1 1.15 Vb9 0.08 Vb3 0.35 Vb5.2 0.00 CD8 Vb2 0.43 Vb12 0.00 Vb17 0.00 Vb18 0.00 Vb16 0.08 Vb23 0.00 Vb1 1.09 Vb5.1 80.2 Vb13.1 Vb13.6 0.12 0.24 Vb20 0.36 Vb11 0.12 Vb21.3 0.00 WT1特異的TCRの 80.2％がVβ5.1を使用 Vb22 0.25 Vb14 0.25 Vb8 0.00 Vb13.2 0.00 Vb4 13.7 Vb7.2 0.00 WT1ペプチドワクチンを受けたCMLのMLPC後のテトラマー陽性well中のCD8+細胞のレパトワ解析 C10 well mWT1-tetramer 71.0% (/ CD8+ T cells) CD8 average + 1SD : 20.2 結果3 健常例およびCML例のTCR Vβ の使用分布健常例およびCML例のTCR Vβ の使用分布 Vβ1、2、5.1、7.1、 Vβ1、3、5.1、7.1、 9、18、21.3、22 Vβ1、5.1、7.1、が健常例、CML例13.6が使用されが使用されていていた。で共通して使用されていた。た。健常例 (n=14） CML例 (n=10) 結　果 u  健常例では誘導されたCTLにおいて、TCRVβ 1、2、5.1、 7.1、9、18、21.3、22 が使用されており、Vβ 1、22 が最も高　い頻度で使用されていた。 u  CML例では Vβ1、3、5.1、7.1、13.6 が使用されており、 Vβ 5.1 が最も高い頻度で使用されていた。 u  同じペプチドワクチンを投与した2例において、Vβ1と　Vβ5.1、そしてVβ 7.1 が共通に使用されていることが分　かった。結　論 u MLPCを用いた抗原特異的細胞傷害性T細胞（CTL）の増幅は、FACSを用いたVβレパトワの解析に有用であると考えられた。 u HLA-A*24:02拘束性WT1ペプチド（CYTWNQMNL）ワクチンによって誘導されたCTLのTCRには、複数のクローンが存在していることが明らかになった。共同研究者 ² 新潟大学大学院保健学研究科内山孝由　岩谷俊平　大岩恵理　西澤幹則 ² 新潟大学医学部保健学科検査技術科学専攻4年赤木裕美子　加藤瑞希　神山瑛洋　木曽里奈　高橋周汰 ² 新潟大学医学部保健学科高橋益廣　成田美和子健常例およびCML例のTCR Vβ の使用分布健常例 (n=14） Vβ1、2、5.1、7.1、 9、18、21.3、22 が使用されていた。健常例 + CML例 (n=24) CML例 (n=10) Vβ1、3、5.1、7.1、 13.6が使用されていた。