抗原提示および腫瘍細胞障害における共抑制シグナルの関与

抗原提示および腫瘍細胞障害に
おける共抑制シグナルの関与
新潟大学医学部保健学科検査技術科学専攻 M12d328k　山口友美
背　景
がん免疫を賦活する腫瘍免疫療法の臨床試験におい
ては、必ずしも満足できる成績は得られていない。その
理由としては、抗原提示段階における免疫抑制機構の
存在、および共抑制シグナルを利用した腫瘍細胞の免
疫監視機構からの逃避反応が想定されている。
近年、免疫逃避/抑制機構を阻害することによるがん
免疫療法の有用性が確認され、共抑制シグナルに関
する研究とその応用が注目されている。
目　的抗腫瘍免疫療法における共抑制シグナルの関与につい
て、抗原提示段階および腫瘍細胞傷害段階について以
下の点を明らかにする。 v  抗原提示段階においては、抗原提示細胞（樹状細
胞）の共抑制分子の発現様式およびその成熟度との
関連について v  腫瘍細胞傷害段階においては、混合リンパ球ペプチ
ド培養で誘導した抗原特異的細胞傷害性T細胞(CTL)
の共抑制分子の発現様式について樹状細胞ｰＴ細胞間の共刺激/共抑制シグナル
ペプチド
樹状細胞
MHC
CD80 or 86
CD80 or 86
CD200(OX2)
TCR
CD28
CD152(CTLA-4)
CD200R
CD270(HVEM)
CD272(BTLA)
CD273(PD-L2)
CD279(PD-1)
CD274(PD-L1)
CD279(PD-1)
CD276(B7-H3)
Gal-9
B7-H4
?
CD366(TIM3)
?
T細胞
単球由来樹状細胞(moDC)の誘導法
末梢血附着細胞
（単球）
未熟単球由来樹状細胞
未熟単球由来樹状細胞の誘導
•  GM-CSF 100 ng/ml
•  IL-4　10 ng/ml
を加えて CO2 インキュベーターで
37 ℃、6 日間培養する。
成熟単球由来樹状細胞
成熟単球由来樹状細胞の誘導
•  LPS　0.1 µg/ml
•  IFN-γ 1,000 U/ml
を加え CO2 インキュベーターで
37℃、24 時間培養する。
単球由来樹状細胞 (moDC)における共刺激/接着分子の発現と
成熟度との関連（代表例）
CD1a
CD1d
CD29
CD40
5.39
0.94
61.0
7.70
13.1
1.04
88.8
53.0
CD49d CD54 (VLA4α) (ICAM-‐1)
2.95
5.21
未熟moDC 3.89
15.9
成熟moDC CD58 CD80 CD83 (LFA-‐3) (B7/BB1) (HB15)
2.65
2.71
1.13
CD86 (B7-‐2)
24.3
CD209 HLA-‐DR HLA-‐ABC (DC-‐SIGN)
36.6
2.47 5.16
未熟moDC 5.77
成熟moDC 50.0
4.39
240.9
96.3
5.14
3.49
単球由来樹状細胞 (moDC)における共抑制分子の発現と成熟度との関連（代表例）
CD200 (OX2)
1.30
CD270 CD273 (HVEM) (PD-‐L2)
3.44
1.54
CD274 CD276 (PD-‐L1) (B7-‐H3)
9.29
66.4
Gal-‐9
B7-‐H4
1.76
1.06
2.59
1.18
未熟moDC 2.17
成熟moDC 4.99
5.25
128.4
52.6
単球由来樹状細胞 (moDC)における共刺激/抑制分子の発現と
成熟度との関連（n=3）
未熟moDC
成熟moDC
共刺激・接着分子
共抑制分子
樹状細胞ｰＴ細胞間の共抑制シグナル
ペプチド
樹状細胞
MHC
CD80 or 86
CD80 or 86
CD200(OX2)
TCR
CD28
CD152(CTLA-4)
CD200R
CD270(HVEM)
CD272(BTLA)
CD273(PD-L2)
CD279(PD-1)
CD274(PD-L1)
CD279(PD-1)
CD276(B7-H3)
Gal-9
B7-H4
?
CD366(TIM3)
?
T細胞
混合リンパ球ペプチド培養法（MLPC法）
末梢血20mlを採取
5 U/ml トロンビン加
37℃, 1〜2時間
血漿
血清
細胞数 3×105/100µｌ, CMVpp65 5µg/ml
5%自己血清加培養液 (RPMI1640)
100µl/well ずつ well に播種
3,000rpm,
10分間遠心
比重遠心
CMVpp65ペプチド
TCR
CD8
96wellプレート
分離された
末梢血単核球
3日後
5%自己血清, IL-2 50U/ml加培養液100µl/well加える
3日後
MHC classⅠ
抗原提示細胞
CD8＋T細胞
各wellから上清を100µlずつ除き、新たに5%自己血清,
IL-2 50U/ml加培養液を100µl/wellずつ加える。
活性化
＊2日ごとに繰り返す。
CMVpp65ペプチド
特異的TCR
培養2週目
CD8＋T細胞
各wellについてCMVpp65 テトラマー陽性
CD8+T細胞の割合をFACSを用いて解析する。
混合リンパ球ペプチド培養(MLPC)法で誘導した
CMVpp65特異的細胞傷害性T細胞(CTL)の継代培養法
MLPC法で
2週間培養後の
細胞
2日ごとに
半分ずつ培地交換
1週間後
新しい培地を
加える
ウェルの細胞を
2つに分ける
1週間後
2つのウェルから
細胞を回収し
24ウェルプレートで培養
1週間後
継代培養22日目
(MLPC開始後36日目)に
テトラマー解析
CMVpp65特異的細胞傷害性T細胞（テトラマー陽性
細胞）は共抑制分子を発現していない
ウェルNo.1
CMVpp65 tetramer
005/+/PD-1.005
ウェルNo.2
ウェルNo.3
007*/+/CD200R.007
3.33
007/+/CTLA4.006
3.40
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD8 PerCP/Cy5.5
ウェルNo.4
008/+Tim3.008
3.25
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD8 PerCP/Cy5.5
ウェルNo.5
018/+/BTLA.018
3.25
3.28
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD8 PerCP/Cy5.5
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD8 PerCP/Cy5.5
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD8 PerCP/Cy5.5
100
CD8 PerCD/Cy5.5
0.47
99.53
BTLA
CD272(BTLA)
96.07
0.00
CD366(Tim3)
Tim3
91.80
3.93
CTLA4
CD152(CTLA4)
8.20
CD200R
PD-1
CD279（PD-1）
CD8 PerCP/Cy5.5
0.47
99.53
結論
v 成熟樹状細胞は種々の共抑制分子を発現しており、
樹状細胞の臨床応用に際しては、抗体等による共抑
制分子の阻害処理を併用することにより、その有効
性が高まる可能性が想定された。 v 混合リンパ球ペプチド培養で誘導した抗原特異的細
胞傷害性T細胞においては、共抑制分子の発現が認
められなかったことから、その細胞活性が十分保たれ
ていることが確認され、臨床応用における有用性が
示唆された。
謝　辞
v  新潟大学医学部保健学科
内山孝由　成田美和子　高橋益廣　

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