2.6.1 緒言 MDV3100 2.6.1 2.6.1.1 緒言 名称及び化学構造式 MDV3100 の名称及び化学構造式は以下のとおりである。 一般名:INN JAN enzalutamide(r-INN: WHO Drug Information 2013 年 27 巻 1 号 r-INN: List 69 p.56) (日本名)エンザルタミド,(英名)Enzalutamide 化学名:4-{3-[4-cyano-3-(trifluoromethyl)phenyl]-5,5-dimethyl-4-oxo-2-sulfanylideneimidazolidin-1yl}-2-fluoro-N-methylbenzamide 構造式: 分子式:C21H16F4N4O2S 分子量:464.44 2.6.1.2 MDV3100 の薬理作用 MDV3100 は,アンドロゲン受容体(AR)アゴニスト活性を持たない,経口投与可能な AR シ グナル伝達阻害薬である。MDV3100 は,AR へのアンドロゲンの結合を競合的に阻害し,AR の 過剰発現下及び既存の抗アンドロゲン薬に抵抗性を示す前立腺癌細胞において,AR の核内移行及 び AR とその下流遺伝子との結合を阻害する。また,MDV3100 は,AR 依存性の遺伝子発現を阻 害し,前立腺癌細胞の増殖を抑制するとともに,前立腺癌細胞の細胞死及び腫瘍退縮作用を示す。 2.6.1.3 効能・効果 前立腺癌 2.6.1.4 用法・用量 通常,成人にはエンザルタミドとして 160 mg を 1 日 1 回経口投与する。 / アステラス製薬 1 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 目次 2.6.2 薬理試験の概要文 .........................................................................................................4 2.6.2.1 まとめ.........................................................................................................................6 2.6.2.1.1 効力を裏付ける試験 ................................................................................................6 2.6.2.1.2 副次的薬理試験........................................................................................................8 2.6.2.1.3 安全性薬理試験......................................................................................................10 2.6.2.1.4 結論 ........................................................................................................................11 2.6.2.2 効力を裏付ける試験.................................................................................................11 2.6.2.2.1 MDV3100 による AR リガンド結合部位へのアンドロゲン結合の阻害................12 2.6.2.2.2 MDV3100 による AR 核内移行阻害作用 ...............................................................13 2.6.2.2.3 MDV3100 による AR とその下流遺伝子との結合阻害作用 ..................................15 2.6.2.2.4 MDV3100 による AR 依存性転写活性阻害作用,癌細胞増殖阻害作用,細胞死 誘導作用及び腫瘍退縮作用 ...................................................................................17 2.6.2.2.5 MDV3100 のアゴニスト活性 .................................................................................25 2.6.2.2.6 代謝物の効力を裏付ける薬理作用.........................................................................28 2.6.2.3 副次的薬理試験 ........................................................................................................30 2.6.2.3.1 MDV3100 の副次的薬理作用 .................................................................................31 2.6.2.3.2 代謝物の副次的薬理作用 .......................................................................................33 2.6.2.4 安全性薬理試験 ........................................................................................................34 2.6.2.4.1 中枢神経系に及ぼす影響 .......................................................................................36 2.6.2.4.2 呼吸系に及ぼす影響 ..............................................................................................40 2.6.2.4.3 心血管系に及ぼす影響...........................................................................................41 2.6.2.5 薬力学的薬物相互作用試験 ......................................................................................42 2.6.2.6 考察及び結論............................................................................................................42 2.6.2.7 図表 ..........................................................................................................................43 2.6.2.8 参考文献 ...................................................................................................................43 図表一覧 表 2.6.2-1 略号及び用語の定義一覧 ...............................................................................4 表 2.6.2-2 去勢抵抗性前立腺癌患者血漿中最大非結合型濃度の予測値のまとめ ..........9 / アステラス製薬 1 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2-3 副次的薬理試験で得られた結果のまとめ....................................................10 表 2.6.2.2-1 MDV3100 の効力を裏付ける試験に使用した前立腺癌細胞........................12 表 2.6.2.2.1-1 MDV3100,ビカルタミド及びヒドロキシフルタミドのヒト野生型 AR に対する結合親和性.....................................................................................13 表 2.6.2.2.1-2 ヒト変異型 AR に対する MDV3100 の結合親和性......................................13 図 2.6.2.2.2-1 MDV3100 による AR 核内移行阻害作用の 1 例 ..........................................14 表 2.6.2.2.2-1 AR の核内移行に対する MDV3100 の阻害作用 ..........................................15 図 2.6.2.2.3-1 MDV3100 による AR とその下流遺伝子との結合阻害作用(AR アゴニスト の存在下及び非存在下) .............................................................................16 図 2.6.2.2.3-2 VP16-AR ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける,MDV3100 による AR 核内移行下流シグナル阻害作用.................................................17 図 2.6.2.2.4.1-1 LNCaP/AR 細胞における MDV3100 の AR 依存性遺伝子発現阻害作用 ....18 図 2.6.2.2.4.2-1 MDV3100 による前立腺癌細胞 VCaP 増殖抑制作用 ..................................19 図 2.6.2.2.4.2-2 前立腺癌細胞 LNCaP 及び W741C-LNCaP における DHT による細胞増殖 に対する MDV3100,ビカルタミド及びヒドロキシフルタミドの阻害作用 .....................................................................................................................20 図 2.6.2.2.4.2-3 ヒト前立腺癌細胞 VCaP における MDV3100 による細胞死誘導 (PARP 断片化).........................................................................................21 図 2.6.2.2.4.2-4 ヒト前立腺癌細胞 LNCaP/AR における MDV3100 による細胞死誘導 (カスパーゼ-3 断片化).............................................................................21 図 2.6.2.2.4.3-1 去勢抵抗性前立腺癌 LNCaP/AR 担癌マウスモデルにおける MDV3100 の 腫瘍退縮作用................................................................................................22 表 2.6.2.2.4.3-1 去勢抵抗性前立腺癌 LNCaP/AR 担癌マウスにおける MDV3100 の 腫瘍退縮作用................................................................................................23 図 2.6.2.2.4.3-2 LNCaP/AR 担癌マウスにおける MDV3100 投与による体重増加作用........24 図 2.6.2.2.4.3-3 LNCaP/AR 担癌マウスにおける MDV3100 投与による Ki-67 染色 抑制作用.......................................................................................................24 表 2.6.2.2.5-1 AR 核内移行に対する MDV3100 及びビカルタミドのアゴニスト活性 についての定量的評価 .................................................................................25 図 2.6.2.2.5-1 AR 核内移行評価系における MDV3100 及び抗アンドロゲン薬の作用......26 図 2.6.2.2.5-2 AR と AR コアクチベータ蛋白との結合に対する MDV3100,DHT, ビカルタミド及び RD162 の作用 ................................................................27 表 2.6.2.2.6-1 LNCaP 細胞におけるヒトアンドロゲン受容体に対する MDV3100 代謝物 の結合親和性................................................................................................28 図 2.6.2.2.6-1 アンドロゲン受容体核内移行に対する MDV3100 代謝物 M1,M2,M3 及び M4 の阻害作用 .....................................................................................29 2 MDV3100 表 2.6.2.2.6-2 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 と代謝物 M2 の in vitro 薬効を裏付ける試験結果のまとめ: AR に対する結合親和性及び AR 核内移行阻害作用 ...................................29 表 2.6.2.3-1 副次的薬理作用として評価した各種受容体,チャネル,トランスポー ター,酵素 ...................................................................................................31 表 2.6.2.3.1-1 MDV3100 の特異性についての試験結果.....................................................32 表 2.6.2.3.2-1 MDV3100 代謝物の特異性についての試験結果 ..........................................34 表 2.6.2.4-1 MDV3100 安全性薬理試験...........................................................................35 表 2.6.2.4.1.2-1 MDV3100 の痙攣誘発性に関する in vivo 非臨床試験 .................................36 表 2.6.2.4.1.2-2 マウス単回投与時 a の MDV3100 の Cmax 及び AUC24h ...............................37 表 2.6.2.4.1.2-3 マウス単回投与時 a の M2 の Cmax 及び AUC24h ..........................................38 表 2.6.2.4.1.2-4 雄性マウスの痙攣に関する用量依存性 a .....................................................39 表 2.6.2.4.1.2-5 MDV3100 投与により痙攣の認められた最低投与量での MDV3100 の 血漿中薬物濃度(各群各性の平均値) .......................................................40 3 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 2.6.2 薬理試験の概要文 本項で使用した略号及び用語の定義一覧を表 2.6.2-1 に示す。 表 2.6.2-1 略号及び用語の定義一覧 略号及び用語 定義 AR Androgen Receptor(アンドロゲン受容体) AUC Area Under the Curve(血漿中濃度-時間曲線下面積) AUC24h 0 時間から 24 時間までの血漿中濃度-時間曲線下面積 AUC168h 0 時間から 168 時間までの血漿中濃度-時間曲線下面積 Bic Bicalutamide(ビカルタミド) β-gal Beta-Galactosidase(ベータガラクトシダーゼ) CHO Chinese Hamster Ovary(チャイニーズハムスター卵巣) Cmax Maximum Plasma Concentration(最高血漿中濃度) COS-1 アフリカミドリザル腎臓由来細胞 CSS Charcoal-Stripped Serum(チャコール処理血清) DHT Dihydrotestosterone(ジヒドロテストステロン) FBS Fetal Bovine Serum(ウシ胎仔血清) FOB Functional Observational Battery(機能観察総合評価法) GABA Gamma Aminobutyric Acid(ガンマアミノ酪酸) GLP Good Laboratory Practice(医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施 基準) GnRH Gonadotropin Releasing Hormone(性腺刺激ホルモン放出ホルモン) HEK293 Human Embryonic Kidney 293(ヒト胎児腎臓由来細胞) hERG Human Ether-a-Go-Go-Related Gene(ヒト ether-a-go-go 関連遺伝子) IC50 Concentration Required for 50% Inhibition(50%阻害濃度) Ki Inhibition Constant(阻害定数) LNCaP Human prostate cancer cells which express T877A-mutated AR(ヒト前立 腺癌の転移巣から樹立されたヒト前立腺癌細胞株,発現している AR は T877A 変異型) LNCaP/AR Human prostate cancer LNCaP cells in which wild type ARs are transfected(野生型アンドロゲン受容体を強制発現させたヒト前立腺 癌細胞株 LNCaP,去勢抵抗性前立腺癌のモデルとして使用) M1 Major Human Metabolite (Inactive) MDPC0001(ヒト主要代謝物(非活 性) ,MDPC0001,MDV3100 カルボン酸体) M2 Major Human Metabolite (Active) MDPC0002(ヒト主要代謝物(活性), MDPC0002,MDV3100 N-脱メチル体) 4 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 M3 Metabolite MDPC0003(代謝物 MDPC0003,M4 N-脱メチル体) M4 Metabolite MDPC0004(代謝物 MDPC0004,MDV3100 ヒダントイン 体) M5 Metabolite MDV3105(代謝物 MDV3105,M4 カルボン酸体) M6 Metabolite MDV3106(代謝物 MDV3106,MDV3100 水酸化体) M7 Metabolite MDPC196(代謝物 MDPC196,MDV3100 シアノ水和体) M9 M2 シアノ水和体,M7 N-脱メチル体 M10 M1 シアノ水和体,M7 カルボン酸体,M9 カルボン酸体 M11 Metabolite MDPC197(代謝物 MDPC197,M1 グルクロン酸抱合体) M12 Metabolite MDPC198(代謝物 MDPC198,M5 グルクロン酸抱合体) M13 Metabolite MDPC200(代謝物 MDPC200,MDV3100 N-メチル-S-グル タチオン抱合体) M14 MDV3100 N-メチル-S-システイニルグリシン M15 MDV3100 N-メチル-S-システイン M16 MDV3100 N-メチル-S-アセチルシステイン M17 M5 タウリン抱合体 mRNA Messenger Ribonucleic Acid(メッセンジャーRNA) PARP Poly Adenosine Diphosphate-Ribose Polymerase(ポリアデノシン二リン 酸リボースポリメラーゼ) PSA Prostate-Specific Antigen(前立腺特異抗原) R-1881 Methyltrienolone(メチルトリエノロン) RLU Relative Light Unit(相対的発光量) QTc corrected QT(補正 QT 間隔) SCID Severe Combined Immunodeficiency(重度複合免疫不全) TBPS t-butylbicyclophosphorothionate t1/2 Elimination Half-Life(消失半減期) TMPRSS2 Transmembrane Protease, Serine 2(膜貫通プロテアーゼ,セリン 2 型) tmax Time to Maximum Drug Concentration(最高薬物濃度到達時間) VCaP Human prostate cancer cell line which overexpresses wild type AR(野生 型アンドロゲン受容体を過剰発現するヒト前立腺癌細胞株,去勢抵 抗性前立腺癌のモデルとして使用) VP16-AR, Cos-7 Cos-7 細胞に導入したアンドロゲン依存性化学発光レポーター遺伝 子を VP16-AR によって活性化させる系,VP16-AR 融合蛋白はアン ドロゲン非依存的に核内に移行する W741C-LNCaP Human prostate cancer LNCaP cells in which W741C-mutated ARs are transfected(W741C 変異アンドロゲン受容体を導入したヒト前立腺癌 細胞株 LNCaP,去勢抵抗性前立腺癌のモデルとして使用) YFP Yellow Fluorescent Protein(黄色蛍光蛋白質) 5 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 2.6.2.1 まとめ MDV3100 は,アンドロゲン受容体(AR)アゴニスト活性を持たない AR シグナル伝達阻害薬 であり,去勢療法及び既存の抗アンドロゲン薬治療に対して抵抗性を示す進行性前立腺癌患者に 対して有効性を示すと考えられる新規の経口投与可能な化合物である。MDV3100 は,AR へのア ンドロゲンの結合を競合的に阻害し,AR の過剰発現下及び既存の抗アンドロゲン薬に抵抗性を示 す前立腺癌細胞において AR の核内移行及び AR とその下流遺伝子との結合を阻害した。また, MDV3100 は,AR 依存性の遺伝子発現を阻害し,前立腺癌細胞の増殖を抑制するとともに,前立 腺癌細胞の細胞死を誘導した。去勢抵抗性前立腺癌担癌モデルにおいては,腫瘍退縮作用を示し た。更に,MDV3100 が AR アゴニスト活性を持っていないことが示された。ヒト主要代謝物であ る M2 は,AR 結合親和性及び AR 核内移行阻害作用において,MDV3100 と同等の活性を示した が,もう一つのヒト主要代謝物である M1 は MDV3100 様の薬理活性を示さなかった。 MDV3100 及び M2 は GABA 開口性クロライドチャネルに結合し,阻害作用を示した。安全性 薬理試験において高用量の MDV3100 をマウスに投与した際に認められた用量依存的な痙攣誘発 作用は,MDV3100 及び M2 の GABA 開口性クロライドチャネル阻害作用に起因する可能性が推 察された。安全性薬理試験においてはそれ以外に中枢神経系,呼吸系,心血管系に対する作用は 認められなかった。 薬理試験の概要文及び概要表は,効力を裏付ける試験(2.6.2.2) ,副次的薬理試験(2.6.2.3) ,安 全性薬理試験(2.6.2.4)及び薬理試験概要表(2.6.3)により構成される。 2.6.2.1.1 効力を裏付ける試験 In vitro 及び in vivo 非臨床薬効薬理試験において,MDV3100 の AR シグナル伝達経路に対する 阻害作用並びに AR 依存性前立腺癌細胞増殖阻害作用,細胞死誘導作用及び腫瘍退縮作用を評価 した(2.6.2.2 効力を裏付ける試験) 。去勢抵抗性及び既存抗アンドロゲン薬抵抗性前立腺癌細胞 として,LNCaP/AR,VCaP 及び W741C-LNCaP を用いた。 AR へのアンドロゲン結合阻害作用 AR に対する MDV3100 の結合は in vitro 結合実験により評価した(2.6.2.2.1 MDV3100 による AR リガンド結合部位へのアンドロゲン結合の阻害) 。MDV3100 は野生型 AR(野生型 AR 発現 COS-1 ]の結合を阻害し, 細胞より調製)に対する放射性リガンド[[3H]dihydrotestosterone([3H]DHT) その Ki 値は 0.038 μmol/L(0.018 μg/mL)であった。また,変異型 AR(LNCaP より調製)に対す る放射性リガンド[[3H]メチルトリエノロン([3H]R-1881)]の結合も同様に阻害し,その IC50 値 は 0.060 μmol/L(0.028 μg/mL)であった。更に,MDV3100 は,AR のリガンド結合ドメインに対 して,合成 AR アゴニストである R-1881 と競合的に結合することが示された。 6 MDV3100 2.6.2 薬理試験の概要文 AR 核内移行阻害作用 MDV3100 の AR 核内移行阻害作用の評価には,AR と蛍光蛋白との融合蛋白を用いた定性的な 方法及び,ベータガラクトシダーゼ(β-gal)酵素断片コンプリメンテーションアッセイを用いた 定量的な方法を用いた(2.6.2.2.2 MDV3100 による AR 核内移行阻害作用) 。本評価は,AR アゴニ ストの存在下で実施した。その結果,蛍光蛋白を用いた評価系において,MDV3100 は DHT によ る AR 核内移行を阻害した。 定量的な β-gal 酵素断片コンプリメンテーションアッセイにおいても, MDV3100 は AR アゴニスト(ノルゲステロール)による AR 核内移行を阻害し,その IC50 値は 1.88 μmol/L(0.873 μg/mL)であった。 AR とその下流遺伝子との結合阻害作用 MDV3100 の AR とその下流遺伝子との結合に対する阻害作用は,クロマチン免疫沈降法を用い た細胞系により評価した(2.6.2.2.3 MDV3100 による AR とその下流遺伝子との結合阻害作用) 。 MDV3100 は,AR によって制御されている遺伝子[前立腺特異抗原(PSA)及び膜貫通プロテアー ゼ,セリン 2 型(TMPRSS2) ]を含むクロマチンと AR との結合を阻害した。更に,AR に依存し て活性化されるルシフェラーゼレポーター遺伝子と VP16-AR 融合蛋白を導入した細胞を用いて, MDV3100 の阻害作用を評価した。この融合蛋白は,核に移行する際(第一段階)にアンドロゲン 刺激を必要としないが,転写の際(第二段階)にはアンドロゲンが必須となる。MDV3100 は, AR アゴニストである R-1881 による転写活性化を阻害したことから,AR とその下流遺伝子との 結合に対して阻害作用を示すことにより,AR シグナルを阻害することが示唆された。 AR 依存性転写活性阻害作用,癌細胞増殖阻害作用,細胞死誘導作用及び腫瘍退縮作用 MDV3100 の AR シグナル伝達阻害の結果として起こる,前立腺癌細胞での AR 依存性転写活性 阻害,細胞増殖阻害,細胞死誘導及び腫瘍退縮について評価した(2.6.2.2.4 MDV3100 による AR 依存性転写活性阻害作用,癌細胞増殖阻害作用,細胞死誘導作用及び腫瘍退縮作用) 。MDV3100 は,複数の去勢抵抗性前立腺癌細胞(LNCaP/AR,VCaP,W741C-LNCaP)において,AR を介す る遺伝子発現及び細胞増殖を抑制し,アポトーシス誘導により細胞死を増加させた。 去勢抵抗性前立腺癌細胞を移植した担癌モデルマウス[LNCaP/AR 腫瘍を担癌した複合免疫不 全(SCID)マウス]において,腫瘍増殖に対する MDV3100 及びビカルタミド(1 日 1 回経口投 与,28 日間)の作用を評価した。MDV3100 は 1,10 及び 50 mg/kg で抗腫瘍作用を示し,10 mg/kg 及び 50 mg/kg で腫瘍を退縮させた(投与 28 日目において,10 mg/kg 投与群で 37%,50 mg/kg 投 与群で 68%の腫瘍退縮が認められた)。一方,ビカルタミド 50 mg/kg 投与群の腫瘍体積は,投与 28 日において溶媒投与群と同程度であった。 AR に対するアゴニスト活性 AR シグナル伝達の種々のステップ(AR 核内移行,AR とコアクチベータ蛋白との結合,及び AR とその下流遺伝子との結合)及び AR の下流シグナル(AR 依存性遺伝子発現,及び細胞増殖) 7 MDV3100 2.6.2 薬理試験の概要文 に対する MDV3100 のアゴニスト作用について評価した(2.6.2.2.5 MDV3100 のアゴニスト活性)。 全ての評価系において,ビカルタミドなどの抗アンドロゲン薬はアゴニスト活性を示したが, MDV3100 はアゴニスト活性を示さなかった。 以上の効力を裏付ける試験により,MDV3100 は,既存の抗アンドロゲン薬とは異なる,AR シ グナル伝達経路の複数のステップを阻害する AR シグナル伝達阻害薬であり,また AR に対して アゴニスト活性を持たないことが示された。これらの結果は,臨床第 III 相二重盲検試験[CRPC2] において MDV3100 が去勢抵抗性前立腺癌患者の全生存期間を延長させたという臨床成績を支持 するものと考えられた。 MDV3100 代謝物における効力を裏付ける試験 非臨床試験において,現在までに 16 種の代謝物(M1–M7,M9–M17)が同定されている(表 2.6.4.5-1,表 2.6.4.5-2)。これらの中で,ヒト血漿中の主代謝物は M1(MDPC0001)及び M2 (MDPC0002)であった[2.7.2.2.2.1 健康被験者を対象とした単回投与マスバランス試験(マスバ ランス試験[CL-0001] ) ] 。この M1 及び M2 については,MDV3100 の効力を裏付ける試験中の主 な試験(AR へのアンドロゲン結合阻害作用及び AR 核内移行阻害作用)において,その薬理活性 を評価した(2.6.2.2.6 代謝物の効力を裏付ける薬理作用) 。その結果,M2 は AR に対して MDV3100 と同等の高い親和性を示し(IC50 = 0.12–0.176 μmol/L) ,AR アゴニストによる AR 核内移行に対し ても MDV3100 と同等の阻害作用を示した(IC50 = 3.2 μmol/L)。以上のことから,M2 は MDV3100 の薬効発現に寄与していると考えられた。また,これらの評価系において,M1 は薬理活性を示さ なかった。他の代謝物は,ヒト血漿中でわずかしか検出されなかったか,あるいは AR に対する 親和性は極めて低かった。 2.6.2.1.2 副次的薬理試験 副次的薬理試験として MDV3100,M1 及び M2 の AR 以外への作用を評価した(2.6.2.3 副次的 薬理試験) 。まずは 89 種(M1 及び M2 は 86 種)の受容体,酵素,イオンチャネル及びトランス ポーターに対する MDV3100,M1 及び M2 の 10 μmol/L(それぞれ MDV3100: 4.64 μg/mL,M1: 4.51 μg/mL,M2: 4.50 μg/mL に相当)における結合親和性を検討した。この濃度は,160 mg を投 与された去勢抵抗性前立腺癌患者における血漿中最高非結合型濃度と比較して,7.3 倍以上高い濃 度であった(表 2.6.2-2) 。 8 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2-2 去勢抵抗性前立腺癌患者血漿中最大非結合型濃度の予測値のまとめ 化合物 定常状態における患者血漿中 最大濃度(μg/mL) 蛋白非結合率 定常状態における患者血漿中 最大非結合型濃度(μg/mL)a MDV3100 16.6 b 2.77% e 0.460 M1 8.87 c 2.03% f 0.180 M2 d f 0.613 a b c d e f 12.7 4.83% :定常状態における患者最高血漿中濃度と蛋白非結合率の積として記載 :160 mg/day 投与患者の定常状態における Cmax 値(表 2.7.2-5[CL-0007]) :160 mg/day 投与患者の定常状態における Cmax 値(表 2.7.2-6[CL-0007]) :160 mg/day 投与患者の定常状態における Cmax 値(表 2.7.2-7[CL-0007]) :MDV3100 のヒト血漿中 in vitro 蛋白結合率最低値より算出(PRO3100NC32) :M1 及び M2 のヒト血漿中 in vitro 蛋白結合率最低値より算出(9785-ME-0018) MDV3100 と M2 はヒトプロゲステロン受容体及びラット並びにヒト GABA 開口性クロライド チャネルに対して同程度の作用を示し,副次的薬理作用としては基本的に同じであった(表 2.6.2-3)。ヒトプロゲステロン受容体に対する親和性(IC50)は,MDV3100 が 16.1 μmol/L (7.48 μg/mL) , M2 が 6.2 μmol/L (2.79 μg/mL) であった。これらの IC50 値は, 患者血漿中の MDV3100 及び M2 の最高非結合型濃度と比較して少なくとも 4.6 倍高かった(表 2.6.2-2) 。ラット GABA 開 口性クロライドチャネルに対する親和性(IC50)は,MDV3100 が 2.6 μmol/L(1.21 μg/mL) ,M2 が 7.1 μmol/L(3.20 μg/mL)であった。これらの IC50 値は,患者血漿中の MDV3100 及び M2 の最 高非結合型濃度と比較して少なくとも 2.6 倍高かった(表 2.6.2-2) 。なお,MDV3100 及び M2 は, 表 2.6.2-3 にまとめた分子種以外の分子種に対しては親和性を示さなかった。 一方 M1 は,ヒト GABA 開口性クロライドチャネルに対しては弱い阻害作用を示した(IC50 値: 20.7 μmol/L)が,プロゲステロン受容体を含め評価した他の全ての分子種に対して親和性を示さ なかった。 同様に,200 種以上のヒトキナーゼに対する MDV3100,M1 及び M2 の阻害作用についても検 討した。MDV3100,M1 及び M2 は評価した全てのキナーゼに対して,阻害作用を示さなかった。 9 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2-3 分子種 副次的薬理試験で得られた結果のまとめ 試験系 ラット GABA 開口性 クロライドチャネル In vitro binding ヒト GABA 開口性ク ロライドチャネル Cell-based activity a In vitro binding ヒトプロゲステロン 受容体 Cell-based activity (β receptor) Cell-based activity (α receptor) IC50, μmol/L 2.6 NA NA 7.1 3.0 20.7 2.3 16.1 NA 6.2 Ki, μmol/L 2.1 NA NA 5.9 NA NT NT 6.08 NA 5.0 NA 47% at 10 μmol/L 81% at 10 μmol/L NA NA NA NA NA 74% at 10 μmol/L NA MDV3100 13.5 NT NA MDV3100 > 30 NT NA 被験物質 MDV3100 M1 M2 M2 MDV3100 M1 M2 MDV3100 M2 阻害率 a:GABA 受容体発現アフリカツメガエル卵母細胞における GABA 刺激による電流を指標とした。 GABA:ガンマアミノ酪酸,IC50:50%阻害濃度,Ki:阻害定数,NA:該当なしまたは算出されず, NT:実施せず 2.6.2.1.3 安全性薬理試験 MDV3100 は in vitro において hERG 電流を阻害することが示されたが,その IC50 は臨床推奨用 量である 160 mg/day を反復投与された去勢抵抗性前立腺癌患者の血漿中非蛋白結合型濃度よりも 10 倍以上高かった(2.6.2.4.3.1) 。また,中枢神経系,呼吸系及び心血管系に対する急性の作用を, マウス,ラットあるいはイヌを用いて検討した(2.6.2.4) 。ラットを用い,中枢神経系に対する作 用を機能観察総合評価法(FOB)により,呼吸系に対する作用をプレチスモグラフィー法により, いずれも 30,100 及び 200 mg/kg の投与量で検討したところ,いずれの用量でも MDV3100 投与に 関連すると考えられる急性の作用は認められなかった。心血管系に対する作用を無麻酔イヌを用 いたテレメトリー試験により 5,15 及び 30 mg/kg の用量で検討したところ,いずれの用量におい ても MDV3100 は血圧,心拍数及び心電図に影響を及ぼさなかった。 MDV3100 は GABA 開口性クロライドチャネルを阻害したことから,マウスにおける痙攣誘発 作用を検討した(2.6.2.4.1.2) 。その結果,MDV3100 は単回投与及び 7 日間反復投与試験において 用量依存的に痙攣を誘発した。痙攣は 200 mg/kg/day 以上の投与群で認められたが,単回投与毒性 試験の 100 mg/kg 投与群,4 週間反復投与毒性試験の 60 mg/kg/day では認められなかった。マウス 単回経口投与時に痙攣の認められなかった最高投与量(100 mg/kg)の Cmax 及び AUC24h は, 160 mg/day を服用する患者で予想される Cmax 及び AUC24h のそれぞれ 2.5 倍及び 2.3 倍であった。 また,マウスで痙攣の認められた最低用量(200 mg/kg)投与時の Cmax 及び AUC24h は,臨床で 160 mg/day を投与された患者の定常状態の Cmax 及び AUC24h のそれぞれ 3.4 倍及び 3.3 倍であった。 10 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 2.6.2.1.4 結論 MDV3100 は,AR に対するアンドロゲンの結合を競合的に阻害し,AR の過剰発現下及び既存 抗アンドロゲン薬抵抗性の前立腺癌細胞において AR の核内移行及び AR とその下流遺伝子との 結合を阻害した。MDV3100 は,AR 依存性の遺伝子発現及び前立腺癌細胞の増殖を阻害し,細胞 死を誘導した。また,MDV3100 の投与により去勢抵抗性前立腺癌モデルにおいて腫瘍の退縮が認 められた。更に,MDV3100 は AR に対してアゴニスト活性を示さなかった。以上より,MDV3100 は,AR シグナル伝達経路の複数のステップを抑制する AR シグナル伝達阻害薬であり,且つ AR アゴニスト作用を持たないことが示された。ヒト主要代謝物である M2 は,AR 結合親和性及び AR 核内移行阻害作用において,MDV3100 と同等の活性を示したが,もう一つのヒト主要代謝物 である M1 は MDV3100 様の薬理活性を示さなかった。 MDV3100 及び M2 は GABA 開口性クロライドチャネルに結合し,阻害作用を示した。また, MDV3100 は 200 mg/kg 以上の投与により, マウスに痙攣を惹起した。 GABA 開口性クロライドチャ ネルを阻害する化合物が痙攣を誘発することが知られている(Treiman, 2001)ことから,安全性 薬理試験において高用量の MDV3100 をマウスに投与した際に認められた用量依存的な痙攣誘発 作用は,MDV3100 及び M2 の GABA 開口性クロライドチャネル阻害作用に起因する可能性が推 察された。安全性薬理試験において,MDV3100 は臨床推奨用量である 160 mg/day に相当する曝 露量において中枢神経系,呼吸器系及び循環器系に対する急性作用を示さなかった。 2.6.2.2 効力を裏付ける試験 MDV3100 の AR シグナル伝達阻害薬としての作用を in vitro 及び in vivo において評価した。こ れらの試験はアンドロゲン感受性ヒト前立腺癌細胞(LNCaP)及び去勢抵抗性前立腺癌細胞 (LNCaP/AR,W741C-LNCaP,及び VCaP)を用いて実施した。また,AR が細胞質から核に移行 する際にアンドロゲン刺激を必要としないが,転写の際にはアンドロゲンが必須となる AR 依存 性遺伝子転写の細胞モデルとして,VP16-AR, Cos-7 を用いた(表 2.6.2.2-1) 。 11 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2.2-1 Cell types MDV3100 の効力を裏付ける試験に使用した前立腺癌細胞 Characterization References LNCaP ヒト前立腺癌の転移巣から樹立された。発現している AR は,877 位のトレオニンがアラニンに置換された変異 AR である。この変異は多くの前立腺癌において認められ, 細胞増殖を促進し,細胞死に対する抵抗性を獲得するこ とにより細胞を生存させる。更に他のステロイドによる AR 活性化を促進する。 Horoszewicz, 1983 Taplin, 1999 Gaddipati, 1994 Suzuki, 1996 Sun, 2006 LNCaP/AR ヒト野生型 AR を過剰発現させた LNCaP の遺伝子組み替 え体。AR 依存性増殖を示すが,ビカルタミドが無効であ ることから,去勢抵抗性前立腺癌モデルとして使用され ている。 Chen, 2004 W741C-LNCaP 発現ベクターを用いて LNCaP に W741C 変異 AR(741 位 のトリプトファンがシステインに置換された変異 AR)を 組み入れた遺伝子組み換え体。W741C 変異 AR はビカル タミド抵抗性を有する。 細胞内に内在性の T877A 変異 AR と外因性の W741C 変異 AR が発現している。 Hara, 2003 VCaP 去勢抵抗性前立腺癌患者の脊椎転移巣から樹立された。 内在性の AR 遺伝子増強が認められる。 Korenchuk, 2001 Liu, 2008 VP16-AR, Cos-7 Cos-7 細胞に導入したアンドロゲン依存性化学発光レ ポーター遺伝子を VP16-AR によって活性化させる系。 VP16-AR は完全長ヒト AR と VP16 ビリオンの融合蛋白を コードする。その融合蛋白はアンドロゲン非依存的に核 内に移行する。 Hsieh, 2008 AR:アンドロゲン受容体 2.6.2.2.1 MDV3100 による AR リガンド結合部位へのアンドロゲン結合の阻害 添付資料 4.2.1.1-17, 4.2.1.1-1, 4.2.1.1-2, 4.2.1.1-3, 4.2.1.1-4, 4.2.1.1-5 MDV3100 による AR リガンド結合部位へのアンドロゲン結合の阻害作用は,野生型 AR を発現 させた COS-1 細胞から調製した細胞質画分を用いて,[3H]DHT の結合置換実験により検討した (9785-PH-0002) 。MDV3100 は野生型 AR に対する[3H]DHT の結合を阻害し,その Ki 値は 0.038 μmol/L(0.018 μg/mL)であった(表 2.6.2.2.1-1) 。 12 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2.2.1-1 MDV3100,ビカルタミド及びヒドロキシフルタミドの ヒト野生型 AR に対する結合親和性 Test compound MDV3100 Bicalutamide Hydroxyflutamide Ki (nmol/L) (95% CI) 38 (25 – 56) 42 (36 – 50) 18 (14 – 23) 数値は triplicate にて実施した 4 回試行の幾何平均を,カッコ内の数値は 95%信頼区間を示す。 CI:信頼区間,Ki:阻害定数 (9785-PH-0002 より抜粋) 他の複数の試験において,前立腺癌細胞 LNCaP に発現する変異型 AR(T877A,877 位のトレ オニンがアラニンに置換)に対する MDV3100 の親和性を評価した(PRO3100NC44,PRO3100NC66, PRO3100NC132 及び PRO3100NC134) 。MDV3100 は T877A 変異型 AR に対する放射性リガンド ([3H]R-1881) の結合を阻害し, その IC50 値は 0.060 μmol/L (0.028 μg/mL) であった(表 2.6.2.2.1-2) 。 表 2.6.2.2.1-2 ヒト変異型 AR に対する MDV3100 の結合親和性 MDV3100 Binding Studies to Androgen Receptor with Mutation Threonine 877 Alanine Study No. Ki (μmol/L) IC50 (μmol/L) PRO3100NC44 a 0.0130 0.0188 0.0345 0.0516 PRO3100NC66 PRO3100NC132 PRO3100NC134 Mean ± SEM 0.0131 0.0378 0.0205 0.022 ± 0.006 0.0359 0.108 0.0522 0.060 ± 0.016 a:2 回試行のそれぞれの数値 注:全ての試験は同一の方法にて実施した。細胞質画分は LNCaP 細胞より調製し,放射性リガンドとして [3H]R-1881 を用いた。 IC50:50%阻害濃度,Ki:阻害定数,SEM:平均値の標準誤差 Schild プロット解析を用いて,AR へのリガンド結合に対する MDV3100 の阻害様式(競合的あ るいは非競合的)を検討した(PRO3100NC81) 。合成 AR アゴニストである[3H]R-1881 を放射性リ ガンドとして,結合置換実験を実施した。MDV3100 は,様々な濃度の[3H]R-1881 の AR に対する 結合を濃度依存的に阻害した。阻害定数(Ki 値)は,[3H]R-1881 濃度の違いによって大きな影響 を受けなかった(0.033 – 0.073 μmol/L)ことから,MDV3100 の AR へのリガンド結合に対する阻 害作用は競合的であることが示唆された。 2.6.2.2.2 MDV3100 による AR 核内移行阻害作用 添付資料 4.2.1.1-6, 4.2.1.1-7, 4.2.1.1-8, 4.2.1.1-9 AR の核内移行は,AR と蛍光蛋白との融合蛋白を用いた定性的な評価法と,ベータガラクトシ ダーゼ(β-gal)酵素断片コンプリメンテーションアッセイを用いた定量的な方法の,2 種の細胞 評価系にて評価した。MDV3100 の阻害作用は,AR アゴニストの存在下で測定した。 13 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 定性的な評価には,ヒト組換え AR と黄色蛍光蛋白(YFP,Schaufele, 2005)の融合蛋白を発現 させたヒト胎児腎臓由来細胞(HEK293)を使用した。AR-YFP 融合蛋白の核内移行は蛍光強度を 指標に評価した。本評価において,AR アゴニストである DHT による AR-YFP 融合蛋白の核内移 。MDV3100 は 1 μmol/L において DHT による核内移行 行の誘導が確認された(PRO3100NC155) を阻害した。一方,ビカルタミドは 1 μmol/L において DHT による核内移行を部分的にしか阻害 しなかった。DHT 非存在下において,ビカルタミドと異なり,MDV3100 は AR の核内移行を誘 導せず,アゴニスト活性を示さなかった。 β-gal 酵素断片コンプリメンテーションアッセイを用いた定量的な方法により,化学発光を指標 として,MDV3100 の AR 核内移行に対する作用を検討した(PRO3100NC43) 。この試験において, MDV3100 及びビカルタミドはノルゲステロールによる AR 核内移行を阻害し, IC50 値はそれぞれ, 0.85 及び 0.7 μmol/L であった(図 2.6.2.2.2-1)。MDV3100 の阻害作用は独立した 3 回の試験により 。 検討し,平均 IC50 値は 1.88 μmol/L(0.873 μg/mL)であった(表 2.6.2.2.2-1) 図 2.6.2.2.2-1 MDV3100 による AR 核内移行阻害作用の 1 例 MDV3100 とビカルタミドによる,ノルゲステロール誘発 AR 核内移行阻害作用。AR の核内移行は,β-gal 酵素断 片コンプリメンテーションアッセイを用いた定量的な細胞評価系にて評価した。ノルゲステロールの濃度は,最 大反応の 80%を惹起する濃度である 2.6 nmol/L を用いた。縦軸の相対的光度(RLU)は AR 核内移行の指標であ る化学発光の強度を表す。 MDV3100 はノルゲステロールによる AR 核内移行を阻害し,IC50 値は 0.85 μmol/L であっ た。ビカルタミドの IC50 値は 0.7 μmol/L であった。各点は triplicate の平均値±標準誤差を示す。 (PRO3100NC43) 14 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2.2.2-1 Study No. IC50 (μmol/L) PRO3100NC43 AR の核内移行に対する MDV3100 の阻害作用 Androgen Receptor Nuclear Translocation PRO3100NC57 PRO3100NC78 0.85 3.275 1.5 Mean ± SD a 1.88 ± 1.26 a:平均値及び標準偏差は,同じ方法を使用して評価した 3 つの試験より得られた値から算出した。 IC50:50%阻害濃度,SD:標準偏差 2.6.2.2.3 MDV3100 による AR とその下流遺伝子との結合阻害作用 添付資料 4.2.1.1-20 AR とその下流遺伝子との結合に対する MDV3100 の阻害作用は,クロマチン免疫沈降法によっ て評価した。DHT 存在下で,LNCaP/AR 細胞を MDV3100 とともにインキュベートした後,AR 特異的抗体を用いた免疫沈降法にてクロマチンを分離し,AR により制御される遺伝子(PSA ま , [Tran, 2009 (参) ]。 たは TMPRSS2) を含むクロマチンを定量的 PCR 法にて測定した(9785-PH-0005) MDV3100 は,DHT によって生じた PSA または TMPRSS2 遺伝子を含むクロマチンと AR との結 合を阻害した(図 2.6.2.2.3-1) 。ビカルタミドも阻害作用を示した。 MDV3100 及びビカルタミドのアゴニスト活性を評価するために,DHT 非存在下で,LNCaP/AR 細胞を MDV3100 とともにインキュベートした後, クロマチン免疫沈降法を実施した (図 2.6.2.2.3-1, [Tran, 2009(参) ] 。MDV3100 は,10 μmol/L においても PSA あるいは TMPRSS2 9785-PH-0005) 遺伝子を含むクロマチンと AR との結合を促進しなかったことから,アゴニスト活性を持たない ことが示された。一方で,ビカルタミドは,AR とクロマチンとの結合を促進したことから,アゴ ニスト活性を持つことが示された。 15 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 MDV3100 による AR とその下流遺伝子との結合阻害作用 (AR アゴニストの存在下及び非存在下) 0.20 10 mol/L MDV3100 1 mol/L MDV3100 10 mol/L Bicalutamide 1 mol/L Bicalutamide Vehicle 0.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 10 mol/L MDV3100 0.40 1.00 1 mol/L MDV3100 0.60 Vehicle 1 nmol/L DHT 1.20 10 mol/L Bicalutamide 0.80 1.40 1 mol/L Bicalutamide Vehicle 1 nmol/L DHT Vehicle PSA ChIP (% input) 1.00 TMPRSS2 ChIP (% input) 図 2.6.2.2.3-1 LNCaP/AR 細胞は,チャコール処理血清 5%含有アンドロゲン除去培地中,被験物質とともに 1 時間プレインキュ ベーションした後, 更に 1 nmol/L DHT の存在下及び非存在下で 3 時間インキュベーションした。 被験物質として, ジメチルスルフォキシド(溶媒: Vehicle) ,ビカルタミド(Bic,1 及び 10 μmol/L),MDV3100(1 及び 10 μmol/L) を使用した。図の縦軸は,免疫沈降した PSA エンハンサー(左図)及び TMPRSS2 エンハンサーの定量値を示す (% input,1 回試行 duplicate の平均値) 。各エンハンサーの定量値は,リアルタイム PCR を用いて測定した。 (9785-PH-0005) AR 依存性ルシフェ MDV3100 の AR とその下流遺伝子との結合に対する阻害作用を示すために, ラーゼレポーター遺伝子を活性化する VP16-AR 融合蛋白を用いた系にて評価した[Tran, 2009 (参) ] 。この VP16-AR 融合蛋白は,VP16 ドメインを介した核への局在化作用により,アンドロ ゲンの刺激が無くても AR の核内移行が起こる(Hsieh, 2008) 。また,核内に移行した AR とその 下流遺伝子とが結合すると,ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現亢進が認められる。本評価 系において,AR アゴニストである R-1881 はルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を亢進させた (図 2.6.2.2.3-2) 。MDV3100 は,核内において AR とその下流遺伝子との結合を阻害することによ り,R-1881 によるルシフェラーゼレポーター遺伝子発現亢進を阻害した。MDV3100 は R-1881 の 非存在下,10 μmol/L においてルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を誘導しなかったことから, アゴニスト活性を持たないことが示された。一方で,ビカルタミドはルシフェラーゼレポーター 遺伝子の発現を誘導した。 16 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 図 2.6.2.2.3-2 VP16-AR ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける, MDV3100 による AR 核内移行下流シグナル阻害作用 VP16-AR による AR 依存性レポーター遺伝子発現誘導。Cos-7 細胞に ARE(4x)-ルシフェラーゼプラスミドと VP16-AR 融合蛋白を導入した。細胞は 1 nmol/L R-1881 の存在下及び非存在下で,ジメチルスルフォキシド(溶 媒; Veh) ,ビカルタミド(Bic,1 及び 10 μmol/L),RD162(MDV3100 と同様の薬理作用を有する構造類似体,1 及び 10 μmol/L),MDV3100(1 及び 10 μmol/L)とともに 24 時間インキュベーションした。細胞を溶解し,ルシ フェラーゼアッセイを実施した。縦軸は相対的光度を示す(3 回試行の平均値±標準誤差)。 (Tran, 2009 Figure 3C) 2.6.2.2.4 MDV3100 による AR 依存性転写活性阻害作用,癌細胞増殖阻害作用, 細胞死誘導作用及び腫瘍退縮作用 ビカルタミドが細胞増殖抑制作用を示さない前立腺癌細胞株(LNCaP/AR,VCaP,及び W741C-LNCaP,表 2.6.2.2-1 を参照)を用いて,MDV3100 の AR シグナル伝達阻害作用に基づく 作用について検討した。 2.6.2.2.4.1 去勢抵抗性前立腺癌細胞における MDV3100 の AR 依存性遺伝子転写活性 阻害作用 MDV3100 の AR 依存性遺伝子転写活性に対する作用は,LNCaP/AR 細胞を用いて,AR の標的 遺伝子である PSA と TMPRSS2 の mRNA の発現量を測定することにより評価した [Tran, 2009 (参) ]。 MDV3100 は, R-1881 による PSA 及び TMPRSS2 の mRNA 発現上昇を阻害した (図 2.6.2.2.4.1-1)。 一方,ビカルタミドはこの系において明らかな阻害作用を示さなかった。R-1881 非存在下, MDV3100 は PSA 及び TMPRSS2 の mRNA 発現を増加させなかったことから,アゴニスト活性を ] 。一方,ビカルタミドは PSA 及び TMPRSS2 の mRNA 持たないことが示された[Tran, 2009(参) 発現を増加させたことから,アゴニスト作用を持つことが示された。 17 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 図 2.6.2.2.4.1-1 LNCaP/AR 細胞における MDV3100 の AR 依存性遺伝子発現阻害作用 LNCaP/AR 細胞における MDV3100 の AR 依存性遺伝子発現阻害作用。細胞はチャコール処理血清 5%含有アンド ロゲン除去培地にて培養し,PSA 及び TMPRSS2 mRNA 発現量を定量的 PCR によって測定した。細胞は 1 nmol/L R-1881 の存在下及び非存在下,ジメチルスルフォキシド(溶媒; Veh) ,ビカルタミド(Bic,1 及び 10 μmol/L), RD162(MDV3100 と同様の薬理作用を有する構造類似体,1 及び 10 μmol/L),MDV3100(1 及び 10 μmol/L)とと もに 8 時間インキュベーションした。縦軸はアクチン mRNA 量に対する相対値を表す(3 回試行の平均値±標準偏 差) 。 (Tran, 2009 2.6.2.2.4.2 Figure 1C) 前立腺癌細胞培養系における MDV3100 の細胞増殖阻害作用及び細胞死誘導 作用 添付資料 4.2.1.1-18, 4.2.1.1-19, 4.2.1.1-6 ビカルタミド感受性 (LNCaP) 及びビカルタミド抵抗性 (W741C-LNCaP, LNCaP/AR, 及び VCaP, 表 2.6.2.2-1)前立腺癌細胞における,細胞増殖及び細胞死に対する MDV3100 の作用を検討し,ビ カルタミドの作用と比較した。MDV3100 は LNCaP,W741C-LNCaP,及び VCaP において,DHT 刺激時あるいは FBS 存在下での細胞増殖を抑制し,生細胞数を減少させた[Tran, 2009(参), 9785-PH-0003,9785-PH-0004] 。MDV3100 の細胞増殖抑制作用はビカルタミドより強力であり, 且つ MDV3100 は細胞増殖促進作用を示さなかった(図 2.6.2.2.4.2-1 及び図 2.6.2.2.4.2-2) 。 18 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 図 2.6.2.2.4.2-1 MDV3100 による前立腺癌細胞 VCaP 増殖抑制作用 MDV3100 及び関連物質による前立腺癌細胞 VCaP 増殖抑制作用。VCaP 細胞は,ウシ胎仔血清(FBS)含有培地に て,図中に示した被験物質とともに培養した(点線:1 μmol/L,実線:10 μmol/L)。対照として,FBS 含有培地に て培養した細胞と,チャコール処理血清(CSS)含有培地にて培養した細胞の結果を示す。生細胞数は CellTiter-Glo® にて測定した(3 回試行の平均値±標準誤差) 。Bic:ビカルタミド,RD162:MDV3100 と同様の薬理作用を有する 構造類似体 (Tran, 2009 Figure 1D) 19 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 図 2.6.2.2.4.2-2 前立腺癌細胞 LNCaP 及び W741C-LNCaP における DHT による細胞増殖に 対する MDV3100,ビカルタミド及びヒドロキシフルタミドの阻害作用 A. B. 前立腺癌細胞 LNCaP(A)及び W741C-LNCaP(B)における,DHT による細胞増殖に対する MDV3100,ビカル タミド,ヒドロキシフルタミドの阻害作用。LNCaP 及び W741C-LNCaP 細胞は 1 nmol/L の DHT 及び様々な濃度 の被験物質とともに 6 日間インキュベーションした。生細胞数は CellTiter-Glo®を用いて測定した。値は 3 回試行 の平均値±標準誤差を示す。各試行において,各濃度 6 ウェルからデータを得た。図中の ASP9785 は MDV3100 を 表す。 (9785-PH-0004) MDV3100 による細胞死(アポトーシス)の誘導は,VCaP 及び LNCaP/AR 細胞におけるポリア デノシン二リン酸リボースポリメラーゼ(PARP)及びカスパーゼ-3 のウエスタンブロットにより 評価した。MDV3100(10 μmol/L)で 1 日または 3 日間処理した VCaP 細胞において,PARP 断片 化が認められた[図 2.6.2.2.4.2-3,Tran, 2009(参) ] 。その PARP 断片化の強度は,チャコール処理 によりアンドロゲンを除去した血清で培養した細胞と同程度であった。一方,ビカルタミド (10 μmol/L)は PARP の断片化を起こさなかった。また,MDV3100(1 及び 10 μmol/L)により 2 日または 4 日間処理した LNCaP/AR 細胞においても,カスパーゼ-3 の断片化が認められた(図 20 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 2.6.2.2.4.2-4,PRO3100NC155) 。これらの結果から,検討に用いられた細胞において,MDV3100 は細胞死誘導作用を有することが示唆された。 図 2.6.2.2.4.2-3 ヒト前立腺癌細胞 VCaP における MDV3100 による細胞死誘導 (PARP 断片化) PARP 断片化に対するビカルタミド,RD162(MDV3100 と同様の薬理作用を有する構造類似体) ,及び MDV3100 の作用。VCaP 細胞は,ウシ胎仔血清(FBS)含有培地中で,溶媒及び 10 μmol/L の被験物質により 1 日あるいは 3 日間処理した。対照として,FBS 含有培地にて培養した細胞と,チャコール処理血清(CSS)含有培地にて培養し た細胞を示す。10 μmol/L の etoposide により 1 日間処理した細胞を,細胞死陽性対照とした。細胞溶解物をウエス タンブロットにて評価した。Bic:ビカルタミド,RD162:MDV3100 と同様の薬理作用を有する構造類似体 (Tran, 2009 Figure 1E) 図 2.6.2.2.4.2-4 ヒト前立腺癌細胞 LNCaP/AR における MDV3100 による細胞死誘導 (カスパーゼ-3 断片化) LNCaP/AR 細胞における MDV3100 のカスパーゼ-3 断片化(C-3 clv,アポトーシスマーカー)誘導作用。細胞は, 溶媒,MDV3100(1 及び 10 μmol/L)ノコダゾールにより 2 日あるいは 4 日間処理した。細胞死の指標であるカス パーゼ-3 の断片化は,ウエスタンブロットにより確認した。上の 2 行は,全長のカスパーゼ-3 及び 175 位のアス パラギン酸部分で切断されたカスパーゼ-3 を認識する抗体#9665 を用いた結果,下から 2 行目は,切断されたカス パーゼ-3 を認識するが全長カスパーゼ-3 は認識しない抗体#9661 を用いた結果である。ノコダゾールは陽性対照 として用いた。 #9661:断片化カスパーゼ-3 を認識する抗体,#9665:全長及び断片化カスパーゼ-3 を認識する抗体,Actin:ベー タアクチン,C-3 clv:断片化カスパーゼ-3,C-3 t:全長カスパーゼ-3,Noc:ノコダゾール,Veh:溶媒 (PRO3100NC155) 21 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 2.6.2.2.4.3 去勢抵抗性前立腺癌担癌モデルマウスにおける MDV3100 の腫瘍退縮作用及び 腫瘍組織での細胞増殖抑制作用 添付資料 4.2.1.1-21, 4.2.1.1-22(参) 腫瘍増殖に対する作用は,去勢抵抗性前立腺癌担癌マウスを用いて評価した(PRO3100NC48)。 去勢した複合免疫不全(SCID)マウスに LNCaP/AR 細胞を皮下移植し,MDV3100 及びビカルタ ミドを経口投与した。MDV3100 の 10 及び 50 mg/kg 投与群の腫瘍体積は,溶媒投与群と比較して 有意に(p<0.05)小さかった(図 2.6.2.2.4.3-1) 。また,28 日間投与後の MDV3100 10 mg/kg 投与 群の腫瘍体積は,溶媒投与群より 62%小さく,投与開始時と比較すると腫瘍が 37%退縮していた。 また 50 mg/kg 投与群では, 溶媒投与群より 82%小さく,投与開始時と比較して 68%退縮していた。 一方,ビカルタミド 50 mg/kg 投与群の腫瘍体積は,投与 28 日において溶媒投与群と同程度であっ た。なお,本試験における MDV3100 の用量 50 mg/kg は,去勢抵抗性前立腺癌患者に 160 mg/day )と同程度の血 投与した際の定常状態の血漿中濃度(Cmax: 16.6 μg/mL,表 2.7.2-5[9785-CL-0007] 漿中濃度(Cmax: 10.4 μg/mL,PRO3100NC21)が得られる用量として設定された。また,ビカルタ ミドの用量 50 mg/kg は,前立腺癌患者(50 mg/day 投与:欧米における承認用量)における定常 状態の血漿中濃度(21.7 μmol/L)と同程度の血漿中濃度(25 μmol/L)になるように設定された (Cockshott, 1990) 。 図 2.6.2.2.4.3-1 去勢抵抗性前立腺癌 LNCaP/AR 担癌マウスモデルにおける MDV3100 の 腫瘍退縮作用 去勢した雄性 CB17 SCID マウスの肩胛骨上部皮下に LNCaP/AR 細胞(2 × 106 個)を移植した。各群の平均腫瘍体 積が 170–212 mm3 に達した時点(移植 84 日後)で薬物投与を開始した。被験物質(MDV3100,ビカルタミド)は 溶媒[1% CMC(カルボキシメチルセルロース)+ 0.1% Tween80]に懸濁し,1 日 1 回経口投与した(28 日間,各 群 7 例) 。測定可能な腫瘍体積は 40 mm3 以上であった。溶媒投与群と薬物投与群との腫瘍体積の比較には,ノン パラメトリック分散分析及び Kruskal Wallis 検定を実施した(*:p < 0.05,**:p < 0.01,溶媒投与群との比較) 。 値は 7 例の平均値を示し,図を見やすくするため,標準誤差は表記していない。 (PRO3100NC48) 22 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 MDV3100 投与群では,腫瘍体積が測定不能な大きさにまで退縮する個体が認められた(低用量 1 mg/kg 投与群において 1/7 例,高用量 50 mg/kg 投与群において 3/7 例) 。一方,ビカルタミド (50 mg/kg)投与群では腫瘍増殖抑制作用はわずかであり,腫瘍退縮は認められなかった(表 2.6.2.2.4.3-1) 。 表 2.6.2.2.4.3-1 去勢抵抗性前立腺癌 LNCaP/AR 担癌マウスにおける MDV3100 の腫瘍退縮作用 Number of Mice Day 0 Day 28 with No Measurable Treatment Group Tumor Volume mm3 Tumor Volume mm3 % Inhibition of Tumors/Total Tumor Growth a Mean ± SD Mean ± SD Number of Mice Vehicle MDV3100 1 mg/kg/day MDV3100 10 mg/kg/day MDV3100 50 mg/kg/day Bicalutamide 50 mg/kg/day 0/7 176 ± 65 348 ± 192 NA 1/7 170 ± 41 202 ± 98 42 0/7 212 ± 91 133 ± 93 62 3/7 192 ± 85 62 ± 65 82 0/7 206 ± 67 330 ± 198 5 a:腫瘍増殖抑制率(%)= (1 – [薬剤投与群の腫瘍体積]/[溶媒投与群の腫瘍体積]) × 100 SD:標準偏差,NA:該当せず (PRO3100NC48) 投与期間中の体重について評価したところ,MDV3100 投与群では投与開始時と比較して体重減 少は認められなかった。MDV3100 の中用量(10 mg/kg)及び高用量(50 mg/kg)投与群では体重 の増加が認められた(図 2.6.2.2.4.3-2) 。ビカルタミド投与群では投与開始時と比較して,わずか に体重が減少したが,その減少は溶媒投与群と同程度であった。 23 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 図 2.6.2.2.4.3-2 LNCaP/AR 担癌マウスにおける MDV3100 投与による体重増加作用 Body weight: change from baseline (g) 4.0 vehicle 3.0 MDV3100 1 mg/kg 2.0 1.0 MDV3100 10 mg/kg 0.0 MDV3100 50 mg/kg bicalutamide 50mg/kg -1.0 -2.0 0 4 8 12 16 20 24 28 Treatment time (days) LNCaP/AR 担癌マウスにおける MDV3100 投与による体重増加作用。溶媒,ビカルタミド,及び MDV3100 を 1 日 1 回 28 日間経口投与した際のマウスの体重変化。グラフは投与開始時と比較した体重変化の平均値と標準偏差を 示す(各群 7 例) 。 (PRO3100NC48) 更に,LNCaP/AR 担癌マウスの腫瘍組織における細胞増殖を免疫組織学的に検討したところ, MDV3100 (50 mg/kg, 21 日間投与) は Ki-67 染色を指標とした細胞増殖を抑制した(図 2.6.2.2.4.3-3, ) 。 PRO3100NC48 Study 11(参) 図 2.6.2.2.4.3-3 LNCaP/AR 担癌マウスにおける MDV3100 投与による Ki-67 染色抑制作用 Vehicle MDV3100 溶媒及び MDV3100(50 mg/kg)を 21 日間投与した LNCaP/AR 担癌 SCID マウスより得た腫瘍組織の病理組織標本。 紫色の部分が Ki-67 染色部位。 (PRO3100NC48 Study 11(参) ) 24 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 2.6.2.2.5 MDV3100 のアゴニスト活性 添付資料 4.2.1.1-7, 4.2.1.1-8, 4.2.1.1-9, 4.2.1.1-10, 4.2.1.1-11 MDV3100 の AR アゴニスト作用は,AR 依存性腫瘍増殖に重要な AR シグナル伝達の 3 つのス テップ(AR 核内移行,AR とコアクチベータ蛋白との結合,及び AR とその下流遺伝子との結合) に関して細胞培養系を用いて検証した。更に,AR シグナル依存性遺伝子発現に対する作用も検討 した[Tran, 2009(参) ] 。全ての評価系において,MDV3100 は明らかなアゴニスト活性を示さな かった(PRO3100NC43,PRO3100NC127,PRO3100NC138,Tran, 2009) 。一方,抗アンドロゲン 薬(ビカルタミド,フルタミド,及びニルタミド)はこれらの系において,それぞれアゴニスト 活性を示した。 β-gal 酵素断片コンプリメンテーションアッセイ(2.6.2.2.2 MDV3100 による AR 核内移行阻害作 用)を用いた定量的な AR 核内移行評価系において,MDV3100 は,ほとんどアゴニスト活性を示 さなかった。 同様の方法で実施した一連の 5 試験において, MDV3100 の AR 核内移行誘導作用は, アゴニストであるノルゲステロールやビカルタミドと比較して弱かった(表 2.6.2.2.5-1) 。 表 2.6.2.2.5-1 AR 核内移行に対する MDV3100 及びビカルタミドのアゴニスト活性についての 定量的評価 Maximum Induction of Nuclear Translocation as Measured by Bioluminescence a Study No. PRO3100NC43 PRO3100NC57 MDV3100 1 2 1.7 1.7 2.6 Bicalutamide 2.8 10 b NT 16.8 17.1 c 12 35 19.6 NT NT Norgesterol PRO3100NC78 PRO3100NC127 PRO3100NC138 a:値は被験物質による最大発光強度と溶媒による発光強度との比を表す。試験報告書内では S/B と表記してい る。値が 1 の場合,核内移行作用が確認できないことを示す。 b:試験報告書中ではビカルタミドを MDV3000 と表記している。 c:ノルゲステロールは AR アゴニストであり,陽性対照として使用した。 NT:評価せず 更に,この AR 核内移行評価系において,MDV3100 の作用を抗アンドロゲン薬[ビカルタミド, ニルタミド及びヒドロキシフルタミド(フルタミドの活性本体) ]と比較した(PRO3100NC138)。 ビカルタミド,ニルタミド及びヒドロキシフルタミドは,いずれも濃度依存的に AR の核内移行 を誘発したが,MDV3100 は,ほとんど作用を示さなかった。同様の抗アンドロゲン薬との比較試 験においても,MDV3100 は,ほとんどアゴニスト作用を示さなかった。AR アゴニストである 6α-fluorotestosterone の作用を 100%とすると,ビカルタミド,ニルタミド及びヒドロキシフルタミ ドのアゴニスト作用はそれぞれ 11%, 22%及び 3%であり,MDV3100 のアゴニスト作用は 1%であっ た(PRO3100NC127,図 2.6.2.2.5-1) 。 25 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 図 2.6.2.2.5-1 AR 核内移行評価系における MDV3100 及び抗アンドロゲン薬の作用 MDV3100 及び抗アンドロゲン薬(ビカルタミド,ニルタミド,ヒドロキシフルタミド)による AR 核内移行作用。 AR を発現させたヒト胎児腎臓由来細胞(HEK293)を用いた β-gal 酵素断片コンプリメンテーションアッセイによ り評価した。相対的光度(RLU)は AR の核内移行度合いを反映したベータガラクトシダーゼ活性を示す。 (PRO3100NC127) AR シグナル伝達には, 活性化した AR が核内コアクチベータ蛋白と結合することも重要である。 蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)アッセイにおいて,MDV3100 は AR とコアクチベータ蛋白と の結合を促進しなかった[図 2.6.2.2.5-2,Tran, 2009(参) ] 。一方,DHT 及びビカルタミドは AR とコアクチベータ蛋白との結合を促進するアゴニスト活性を示した。 26 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 図 2.6.2.2.5-2 AR と AR コアクチベータ蛋白との結合に対する MDV3100,DHT, ビカルタミド及び RD162 の作用 AR リガンド結合ドメインとコアクチベータ蛋白 FxxLF との結合に対するジヒドロテストステロン(DHT), MDV3100,ビカルタミド(Bic) ,及び RD162(MDV3100 と同様の薬理作用を有する構造類似体)の作用。FxxLF 蛋白と AR リガンド結合ドメインとの結合により,テルビウムとフルオレセイン間の蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)が誘導される。図は被験物質無処置時の値を 1 とした比をプロットしたものである(quadruplicate,2 回 の試行の平均値±標準誤差) 。 (Tran, 2009 Figure 3D) AR の下流遺伝子と AR との結合に対しても,MDV3100 のアゴニスト活性を評価した(2.6.2.2.3 MDV3100 による AR とその下流遺伝子との結合阻害作用) 。 LNCaP/AR 細胞において, DHT は PSA 及び TMPRSS2 クロマチンの免疫沈降を促進し,アゴニスト活性を示した。DHT の非存在下にお いて,ビカルタミドは DHT と同様に免疫沈降を促進したが,MDV3100 は促進作用(アゴニスト 作用)を示さなかった(図 2.6.2.2.3-1) 。 VP16-AR 融合蛋白を用いたルシフェラーゼレポーター遺伝子活性化の系においても,MDV3100 のアゴニスト活性を検討した(2.6.2.2.3 MDV3100 による AR とその下流遺伝子との結合阻害作用) 。 R-1881 及びビカルタミドはルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化したが,MDV3100 は活性 化しなかった(図 2.6.2.2.3-2) 。 MDV3100 の AR シグナル伝達に及ぼす影響について,AR 依存性遺伝子である PSA 及び TMPRSS2 の mRNA 発現量を測定することにより評価した(2.6.2.2.4.1 去勢抵抗性前立腺癌細胞 における MDV3100 の AR 依存性遺伝子転写活性阻害作用) 。LNCaP/AR 細胞において,AR アゴ ニストである R-1881 により,これら 2 種の mRNA 発現量の上昇が認められた。AR アゴニストの 非存在下,ビカルタミドはこれらの mRNA 発現量を上昇させたが,MDV3100 は発現を促進しな かった(図 2.6.2.2.4.1-1) 。 27 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 以上より,MDV3100 は,AR 依存性腫瘍の増殖に重要な AR シグナル伝達経路の 4 つのステッ プ(AR 核内移行,AR とコアクチベータ蛋白との結合,AR とその下流遺伝子との結合,及び AR 依存性遺伝子発現)においてアゴニスト活性を示さないことが明らかとなった。 2.6.2.2.6 代謝物の効力を裏付ける薬理作用 添付資料 4.2.1.1-12, 4.2.1.1-13, 4.2.1.1-15, 4.2.1.1-16 非臨床試験において,16 種の代謝物(M1–M7,M9–M17)が同定されている(表 2.6.4.5-1,表 2.6.4.5-2) 。これらの代謝物の中で,M1(MDPC0001)と M2(MDPC0002)がヒト血漿中で主要 代謝物として検出されている。M1 及び M2 について,LNCaP 細胞における AR に対する結合親和 性を評価した。更に,2.6.2.2.2 にて記述されている AR 核内移行性評価系を用いて,AR シグナル 伝達に対する阻害作用についても評価した。 M1 及び M2 の AR に対する結合親和性(IC50 及び Ki 値)を表 2.6.2.2.6-1 に示す。M2 の親和性 は MDV3100 の親和性(Ki = 0.0131–0.0378 μmol/L,表 2.6.2.2.6-2)と同程度であったが,M1 の親 和性は低かった。 表 2.6.2.2.6-1 LNCaP 細胞におけるヒトアンドロゲン受容体に対する MDV3100 代謝物の 結合親和性 Study No. Metabolite Compound ID PRO3100NC65 PRO3100NC73 PRO3100NC59 IC50, μmol/L Ki, μmol/L IC50, μmol/L Ki, μmol/L IC50, μmol/L Ki, μmol/L M1 MDPC0001 > 10 ND > 10 ND > 10 ND M2 MDPC0002 0.176 0.0589 0.12 0.051 0.17 0.074 LNCaP 細胞から調製した AR を含有する細胞質画分を各代謝物(0.001–10 μmol/L)とともにインキュベーション した。放射性リガンドとして[3H]R-1881 を用いた。10 μmol/L において明らかな結合が認められなかった場合は Ki 値を算出しなかった。 IC50:50%阻害濃度,Ki:阻害定数,ND:実施せず AR アゴニストによる AR 核内移行に対する M1 及び M2 の阻害作用を,β-gal 酵素断片コンプリ メンテーションアッセイを用いて評価した。M2 は,ノルゲステロールによる AR 核内移行を阻害 し,その IC50 値は 3.2 μmol/L であった。M1 の IC50 値は 60 μmol/L 以上であった(図 2.6.2.2.6-1, PRO3100NC70) 。 28 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 図 2.6.2.2.6-1 アンドロゲン受容体核内移行に対する MDV3100 代謝物 M1,M2,M3 及び M4 の阻害作用 ノルゲステロールによる AR 核内移行に対する MDV3100 代謝物 M1(MDPC0001) ,M2(MDPC0002) ,M3 (MDPC0003) ,及び M4(MDPC0004)の阻害作用。ノルゲステロールの濃度は,最大反応の 80%の作用を示す 14 nmol/L を用いた。縦軸は化学発光の相対強度(RLU)を示す。陽性対照として使用したゲルダナマイシン(AR アンタゴニスト)の IC50 値は 0.018 μmol/L であった。図中凡例の MDPC00X(X は 1~4 の数字)は MDPC000X と同義である。 (PRO3100NC70) 以上より,M2 は AR に対して MDV3100 と同等の親和性を示し,AR 核内移行に対しても同等 の阻害作用を示した(表 2.6.2.2.6-2) 。また,ノルゲステロール非存在下で,いずれの代謝物もア ゴニスト活性を示さなかった(PRO3100NC70) 。M2 は,上記試験において MDV3100 と同等の AR シグナル伝達阻害作用を示したことから,MDV3100 を去勢抵抗性前立腺癌患者に投与した際 の薬効発現に寄与すると考えられた。 表 2.6.2.2.6-2 MDV3100 と代謝物 M2 の in vitro 薬効を裏付ける試験結果のまとめ: AR に対する結合親和性及び AR 核内移行阻害作用 Inhibition of DHT-Induced Nuclear Translocation Androgen Receptor Binding Affinity Test Compound IC50, μmol/L MDV3100 0.0359 – 0.108 M2 0.12 – 0.176 c Ki, μmol/L a 0.0131 – 0.0378 0.051 – 0.074 c IC50, μmol/L a 0.85 – 3.275 b 3.2 d a:表 2.6.2.2.1-2 を参照,b:表 2.6.2.2.2-1 を参照,c:表 2.6.2.2.6-1 を参照,d:PRO3100NC70 IC50:50%阻害濃度,Ki:阻害定数 29 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 2.6.2.3 副次的薬理試験 MDV3100 及びヒト主要代謝物(M1,M2)の副次的薬理試験として,表 2.6.2.3-1 に示す 89 種 の受容体,チャネル,トランスポーター及び酵素に対する in vitro 結合親和性を評価し,親和性が 認められた標的については機能に対する作用も評価した。MDV3100 と代謝物 M2 は,いずれも GABA 開口性クロライドチャネルとプロゲステロン受容体に結合し,阻害作用を示した。 加えて,200 種以上のヒトキナーゼ(一般的なキナーゼ,受容体キナーゼ,及び代謝キナーゼ を含む)に対する MDV3100 及び代謝物(M1,M2)の作用を in vitro にて検討した。MDV3100 及 び代謝物は評価した全てのキナーゼに対して作用を示さなかった。 30 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2.3-1 副次的薬理作用として評価した各種受容体,チャネル,トランスポーター,酵素 Adenosine Adenosine A1 Adenosine A2A Adenosine A3 Adrenergic Adrenergic α1 non-selective Adrenergic α2 non-selective Adrenergic β1 Adrenergic β2 Angiotensin AT1 AT2 Benzodiazepine BZD central Bradykinin B1 B2 Cannabinoid CB1 CB2 Cholecystokinin CCKA (CCK1) CCKB (CCK2) Corticotropin releasing hormone CRF1 Dopamine Dopamine D1 Dopamine D2S Dopamine D3 Dopamine D4.4 Endothelin ETA ETB GABA GABA (non-selective) Glutamate Glutamate, AMPA Glutamate, Kainate Glutamate, NMDA Growth hormone secretagogue Ghrelin (GHS) Histamine Histamine H1 Histamine H2 Histamine H3 Imidazoline Imidazoline I1 Imidazoline I2 Leukotriene LTB4 (BLT1) LTD4 (CysLT1) Gonadotropin-releasing LH-RH Melanocortin MC4 Muscarinic Muscarinic (non-selective) Neurokinin NK1 NK2 NK3 Neuropeptide Y (non-selective) Nicotinic N (neuronal) (α-BGTX-insensitive) (α4β2) Opiate Opioid (non-selective) Nociceptin ORL1 (NOP) Phencyclidine PCP Purinergic P2X P2Y Serotonin 5-HT (non-selective) Sigma Sigma σ (non-selective) Somatostatin SST5 Nuclear Hormone Receptors Glucocorticoid GR Estrogen ER Progesterone PR Androgen AR Thyroid TH Thyrotropin TRH1 Arginine vasopressin V1a V2 Channels Ca2+ channel (L, DHP site) Ca2+ channel (L, diltiazem site (benzothiazepines) Ca2+ channel (L, verapamil site) (phenylalkylamines) K+ ATP channel K+ channel (HERG) (membrane preparation) K+ V channel SK+ Ca channel Na+ channel (site 2) Cl- channel Transporters NE transporter DA transporter GABA transporter Choline transporter (CHT1) 5-HT transporter Enzyme Assays Phosphodiesterases PDE1 PDE2 PDE3 PDE4 PDE5 Cyclases Adenylyl cyclase Guanylyly cyclase Other enzymes PKCα Acetylcholinesterase Catecholamine O-methyl transferase (COMT) GABA-transaminase Monoamine oxidase A Monoamine oxidase B Phenylethanolamine-N-met hyltransferase Tyrosine hydroxylase ATPase (Na+/K+) 2.6.2.3.1 MDV3100 の副次的薬理作用 添付資料 4.2.1.2-1, 4.2.1.2-2, 4.2.1.2-3, 4.2.1.2-4, 4.2.1.2-5, 4.2.1.2-6, 4.2.1.2-7, 4.2.1.2-8, 4.2.1.2-9, 4.2.1.2-14, 4.2.1.2-15 31 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 89 種の受容体,チャネル,トランスポーター及び酵素に対する MDV3100 の結合親和性を評価 した(PRO3100NC49,PRO3100NC50)。10 μmol/L における 50%以上の結合親和性並びに機能阻 害を薬理学的に意味のある活性として定義した。MDV3100 は,ヒト AR に加えて,ラット GABA 開口性クロライドチャネル及びヒトプロゲステロン受容体に対して親和性を示した(表 2.6.2.3.1-1) 。具体的には,MDV3100 は,ラット大脳皮質から調製した膜標本における GABA 開 口性クロライドチャネルに対する[35S]t-butylbicyclophosphorothionate(TBPS)の結合を阻害した。 ピクロトキシン等の痙攣誘発物質が,TBPS 結合部位で GABA 開口性クロライドチャネルを阻害 することによって痙攣作用を誘発するとの報告(Lewin, 1988, Treiman, 2001)があることから, MDV3100 の阻害作用を検討した。MDV3100 の GABA 開口性クロライドチャネルに対する阻害作 用は,ヒト GABA 受容体(α1β3 GABA-A 及び α1β3γ2 GABA-A サブタイプ)を発現させたアフリ カツメガエル卵母細胞における GABA 誘発電流に対する作用により評価した。その結果, MDV3100 は GABA 開口性クロライドチャネルにおける GABA 誘発電流を濃度依存的に阻害した。 一方,GABA 受容体へのアゴニスト作用による電流の増加は示さなかった(PRO3100NC72) 。ま た,MDV3100 は,細胞機能評価系においてプロゲステロン β 受容体を阻害したが,アゴニスト作 用は示さなかった(PRO3100NC131,PRO3100NC145)。プロゲステロン α 受容体に対する阻害作 用はわずかであった(PRO3100NC145) 。更に,MDV3100 はエストロゲン受容体に対して殆ど親 和性を示さず(10 μmol/L において-2%及び 2.5%,PRO3100NC49,PRO3100NC68) ,エストロゲン 受容体を介する細胞機能に対しても影響を及ぼさなかった(PRO3100NC129) 。なお, MDV3100 は,表 2.6.2.3.1-1 にまとめた分子種以外に対しては親和性を示さなかった。 表 2.6.2.3.1-1 MDV3100 の特異性についての試験結果 Test Compound MDV3100 Target Assay IC50, μmol/L Ki, μmol/L Rat GABA-gated chloride channel In vitro binding 2.6 2.1 Human GABA-gated chloride channel GABA-evoked currents in Xenopus laevis oocytes expressing GABA receptors 3.0 NA In vitro binding 16.1 6.08 Cell-based activity 13.5 NT Cell-based activity > 30 NT Human progesterone receptor Progesterone β receptor Progesterone α receptor IC50:50%阻害濃度,GABA:ガンマアミノ酪酸,Ki:阻害定数,NA:該当せず,NT:実施せず MDV3100 の副次的薬理作用として,200 種以上のヒトキナーゼ(一般的なキナーゼ,受容体キ ナーゼ,及び代謝キナーゼを含む)に対する作用を in vitro にて検討したが,MDV3100 は評価し た全てのキナーゼに対して明らかな作用を示さなかった(MDV3100 の濃度:1,3,10 μmol/L, PRO3100NC58,PRO3100NC136,PRO3100NC137) 。 32 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 2.6.2.3.2 代謝物の副次的薬理作用 添付資料 4.2.1.2-3, 4.2.1.2-10, 4.2.1.2-17, 4.2.1.2-16, 4.2.1.2-18, 4.2.1.2-3, 4.2.1.2-11, 4.2.1.2-12, 4.2.1.2-13 代謝物 M1 及び M2 の副次的薬理作用として,86 種の受容体,チャネル,トランスポーター及 び酵素に対する結合親和性を評価した(PRO3100NC63) 。10 μmol/L における 50%以上の結合親和 性並びに機能阻害を薬理学的に意味のある活性として定義した。 その結果,M2 は,GABA 開口性クロライドチャネルに対する親和性(ラット大脳皮質から調 製した可溶性膜画分に対する[35S]TBPS 結合の阻害)とプロゲステロン受容体に対する親和性 (T47D 細胞の細胞質画分に対する[3H]progesterone 結合の阻害)を示した(表 2.6.2.3.2-1) 。更に M2 は,ヒト GABA 受容体(α1β3 GABA-A サブタイプ)を発現させたアフリカツメガエル卵母細 胞における GABA 誘発電流を阻害した(PRO3100NC72) 。M2 は,エストロゲン受容体に対して は親和性を示さなかった(PRO3100NC63) 。 M1 は,アデノシン A3 受容体に対する親和性(ヒト A3 受容体発現 HEK293 細胞から調製した 膜画分に対する IB-MECA 結合の阻害)とノルエピネフリントランスポーターに対する親和性(ヒ トノルエピネフリントランスポーター発現 CHO 細胞から調製した膜画分に対するプロトリプチ ン結合の阻害)を示した(表 2.6.2.3.2-1)。しかしながら,複数濃度(10 μmol/L まで)で実施した 再試験においては,M1 の A3 受容体に対する親和性もノルエピネフリントランスポーターに対す る親和性も認められなかった(PRO3100NC158) 。更に,細胞機能評価系において,M1 はこれら の標的に対して,アゴニスト並びにアンタゴニスト作用を示さなかった(PRO3100NC159, PRO3100NC160) 。以上より,M1 は A3 受容体及びノルエピネフリントランスポーターに対して作 用を示さないと考えられた。また,M1 はラット GABA 開口性クロライドチャネルに対して低い 親和性を示し(10 μmol/L で 47%阻害,PRO3100NC63) ,ヒト GABA 受容体(α1β3 GABA-A 及び α1β3γ2 GABA-A サブタイプ) を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞における GABA 誘発電流 に対しても弱い阻害作用を示した(IC50 値: 20.7 μmol/L,PRO3100NC72) 。なお,M1 及び M2 は, 表 2.6.2.3.2-1 にまとめた分子種以外に対しては親和性を示さなかった。 加えて,200 種以上のヒトキナーゼに対する M1 及び M2 の作用を MDV3100 と同様に in vitro にて検討した。M1 及び M2 は評価した全てのキナーゼに対して明らかな作用を示さなかった (PRO3100NC141,PRO3100NC142) 。 33 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2.3.2-1 MDV3100 代謝物の特異性についての試験結果 Metabolite M2 Target Rat GABA-gated chloride channel Human GABA-gated chloride channel Human progesterone receptor Estrogen receptor Rat GABA-gated chloride channel Human GABA-gated chloride channel M1 Adenosine A3 receptor Activity IC50, μmol/L Ki, μmol/L 81% inhibition at 10 μmol/L NA NA NA 7.1 5.9 NA 2.3 NT 74% inhibition at 10 μmol/L NA NA NA 6.2 5.0 In vitro binding 3% inhibition at 10 μmol/L NT NT In vitro binding 47% inhibition at 10 μmol/L NA NA GABA-evoked currents in Xenopus laevis oocytes expressing GABA receptors NA 20.7 NT NT NT IA IA IA NA NT NT IA IA IA NA Assay In vitro binding GABA-evoked currents in Xenopus laevis oocytes expressing GABA receptors In vitro binding In vitro binding Cell-based activity assay Norepinephrine transporter In vitro binding Cell-based activity assay 69% inhibition at 10 μmol/L 26% inhibition at 10 μmol/L 10% inhibition at 100 μmol/L 56% inhibition at 10 μmol/L 26% inhibition at 10 μmol/L 48% inhibition at 100 μmol/L a a:M1 はノルエピネフリントランスポーターに対して濃度依存的な阻害作用を示さなかった。 GABA:ガンマアミノ酪酸,IA:値を算出するには活性が不十分,IC50:50%阻害濃度,Ki:阻害定数, NA:該当せず,NT:実施せず 2.6.2.4 安全性薬理試験 安全性薬理試験として, in vitro では HEK293 細胞に発現させた hERG チャネルに対する作用を, in vivo では中枢神経系,呼吸系及び心血管系に対する作用を GLP 適合試験として実施した。表 2.6.2.4-1 に実施した安全性薬理試験の概略を記載した。 34 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2.4-1 報告書番号 試験表題 hERGカリウムチャ ネルを発現させた PRO3100NC91(参)哺乳動物細胞に対 するMDV3100の作 用 hERG カリウムチャ ネルを発現させた PRO3100NC104 ヒト胎児由来腎臓 細胞に対する MDV3100 の作用 hERGカリウムチャ ネルを発現させた PRO3100NC92(参)哺乳動物細胞に対 するMDPC0002の作 用 hERG カリウムチャ ネルを発現させた PRO3100NC107 ヒト胎児由来腎臓 細胞に対する MDPC0002 の作用 MDV3100 をラット に経口投与した際 PRO3100NC96 の神経行動学的な 評価 マウスにおける 9785-PT-0005(参)MDV3100 の痙攣誘 発作用 PRO3100NC95 PRO3100NC94 MDV3100 を雄性 ラットに経口投与 した際の呼吸系に 対する評価 MDV3100 を無麻酔 の雄性ビーグル犬 に経口投与した際 のテレメトリーシ ステムを用いた心 血管系に対する安 全性薬理試験及び 血漿中薬物濃度測 定試験 MDV3100 安全性薬理試験 GLP 準拠 試験系 被験物質 及び 投与方法 試験実施施設 hERG カリウムチャ ネルを発現させた MDV3100, 否 in vitro ヒト胎児腎臓由来 細胞 hERG カリウムチャ ネルを発現させた MDV3100, 適 in vitro ヒト胎児腎臓由来 細胞 hERG カリウムチャ ネルを発現させた M2, 否 in vitro ヒト胎児腎臓由来 細胞 hERG カリウムチャ ネルを発現させた M2, 適 in vitro ヒト胎児腎臓由来 細胞 適 雄性 CD® [Crl:CD® MDV3100, 経口投与 (SD)]ラット 否 雄性マウス, Crlj:CD1(ICR) 適 雄性 CD® [Crl:CD® MDV3100, 経口投与 (SD)]ラット 適 無麻酔雄性ビーグ MDV3100, 経口投与 ル犬 MDV3100, 経口投与 35 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 2.6.2.4.1 中枢神経系に及ぼす影響 2.6.2.4.1.1 MDV3100 の中枢神経系に及ぼす影響 添付資料 4.2.1.3-6 各群 10 例の雄性 Sprague-Dawley(Crl:CD [SD])ラットに MDV3100 を 30,100 及び 200 mg/kg の投与量で単回経口投与し,FOB により神経行動学的な急性作用を検討した(PRO3100NC96)。 溶媒( ,以下 と略記)対照群として投与容量に応じて各群 10 例より成る 2 群を設定した。投与容量は 0,30 及び 100 mg/kg 投与群については 2.2 mL/kg,0 及び 200 mg/kg 投与群については 4.4 mL/kg とした。 神経行動学的評価は投与前ならびに投与後 2, 6 及び 72 時間に実施した。 その結果,いずれの投与量においても MDV3100 投与に起因する神経学的な影響,すなわち活 動性,興奮性,神経筋機能,知覚運動性機能,自律神経機能あるいは生理学的状態に変化は認め られなかった。 2.6.2.4.1.2 MDV3100 及び代謝物 M2 の痙攣誘発作用の検討 添付資料 4.2.3.7.6-4, 4.2.3.1-1(参), 4.2.3.2-1(参), 4.2.1.3-5(参), 4.2.3.2-8, 4.2.2.3-3, 4.2.2.3-2, 4.2.3.2-3(参), 4.2.3.2-9(参) 副次的薬理試験において,MDV3100 及び代謝物 M2 が in vitro において GABA 開口性クロライ ドチャネルに結合し,その機能を阻害することが確認された(2.6.2.3.1 及び 2.6.2.3.2) 。GABA 開 口性クロライドチャネルを阻害する化合物と痙攣誘発との関連性が報告されている(Treiman, 2001)ことから,MDV3100 の痙攣誘発性に関して,マウス,ラットあるいはイヌを用いて in vivo における検討を行った(表 2.6.2.4.1.2-1) 。 表 2.6.2.4.1.2-1 試験 ラットの 2 週間反復 経口投与毒性試験 マウスの単回経口投 与毒性試験 マウスの 1 週間反復 経口投与毒性試験 マウスの痙攣に関 する検討試験 ビーグル犬の 4 週間 反復経口投与毒性 試験 MDV3100 の痙攣誘発性に関する in vivo 非臨床試験 結果 試験番号 100 mg/day/kg をラットに反復経口投与した際痙攣が 誘発された。30 mg/kg/day 以下では痙攣は認められな PRO3100NC31 かった。 400 mg/kg 以上をマウスに単回投与した際,痙攣が誘 9785-TX-0002 発された。200 mg/kg 以下では痙攣は認められなかっ (参) た。 300 mg/kg/day 投与群で投与 2 日に痙攣が認められた。 9785-TX-0007 (参) 100 mg/kg/day 以下では痙攣は認められなかった。 MDV3100 は 200 mg/day/kg 以上の投与量で用量依存 9785-PT-0005 的に痙攣を誘発した。60 mg/day/kg では痙攣は認め (参) られなかった。 MDV3100 は 60 mg/kg/day の投与量で痙攣を誘発し PRO3100NC18 た。30 mg/kg/day 以下では痙攣は認められなかった。 36 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 ラット及びマウスを用いて MDV3100 及び M2 の脳内移行性を検討した(PRO3100NC84 及び 9785-ME-5016)。その結果,MDV3100 及び M2 はラット及びマウスのいずれにおいても血液脳関 門を通過することが認められた。マウスにおいては,MDV3100 及び M2 の脳内濃度はそれぞれの 血漿中濃度とおおむね同程度であった。このことから,MDV3100 を経口投与した際に脳内の GABA 開口性クロライドチャネルを阻害することが可能であると考えられた。 雌雄マウスを用いた単回投与毒性試験において,MDV3100 を 50,100,200,400,800 及び 1600 mg/kg の投与量で経口投与したところ,400 mg/kg 以上を投与した雌雄で間代性痙攣が認めら れた(n=24/性/群,9785-TX-0002(参)) 。投与後に経時的に採血を行い,MDV3100 及び M2 の血漿中薬物濃度を測定した。MDV3100 及び M2 の Cmax 及び AUC24h をそれぞれ表 2.6.2.4.1.2-2 と表 2.6.2.4.1.2-3 に示す。MDV3100 及び M2 の Cmax 値を各群各性ごとに比較すると,M2 は MDV3100 のおおむね 2~40 分の 1 程度であった。 表 2.6.2.4.1.2-2 マウス単回投与時 a の MDV3100 の Cmax 及び AUC24h 投与量及び投与期間 ヒト b 160 mg/day,1 日 1 回×49 日間 50 mg/kg 単回投与 100 mg/kg 単回投与 200 mg/kg 単回投与 マウス 400 mg/kg 単回投与 800 mg/kg 単回投与 1600 mg/kg 単回投与 性 男性 雄 雌 雄 雌 雄 雌 雄 雌 雄 雌 雄 雌 血漿中 MDV3100 濃度 Cmax AUC24h ヒトに対 ヒトに対 AUC24h Cmax (μg/mL) する比 c (μg·h/mL) する比 c 16.6 NA 322 NA 34.6 2.1 620 1.9 40.8 2.5 698 2.2 42.3 2.5 743 2.3 54.6 3.3 885 2.7 56.5 3.4 1047 3.3 66.0 4.0 1121 3.5 71.0 4.3 1630 5.1 113.9 6.9 2240 7.0 95.2 5.7 NC NC 92.1 5.5 NC NC 73.6 4.4 1134 3.5 56.1 3.4 1151 3.6 a 試験番号:9785-TX-0002(参) b 49 日間投与後の定常状態における Cmax と AUC24h(表 2.7.2-5 [9785-CL-0007]) c 表中に示した代表的なヒトでの値に対するマウス単回投与時の Cmax あるいは AUC24h 値の比 NA, 該当値なし; NC, 未計算 37 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2.4.1.2-3 マウス単回投与時 a の M2 の Cmax 及び AUC24h 投与量及び投与期間 ヒト b 160 mg/day,1 日 1 回×49 日間 50 mg/kg 単回投与 100 mg/kg 単回投与 200 mg/kg 単回投与 マウス 400 mg/kg 単回投与 800 mg/kg 単回投与 1600 mg/kg 単回投与 性 男性 雄 雌 雄 雌 雄 雌 雄 雌 雄 雌 雄 雌 血漿中 M2 濃度 Cmax AUC24h ヒトに対 ヒトに対 Cmax AUC24h (μg/mL) する比 c (μg·h/mL) する比 c 12.7 NA 278 NA 2.0 0.16 40 0.14 4.2 0.33 62 0.22 4.0 0.31 58 0.21 4.7 0.37 80 0.29 9.2 0.72 129 0.46 6.2 0.49 114 0.41 28.6 2.25 136 0.49 27.1 2.13 125 0.45 3.3 0.26 NC NC 2.3 0.18 NC NC 16.2 1.28 115 0.41 14.9 1.17 144 0.52 a 試験番号:9785-TX-0002(参) b 49 日間投与後の定常状態の Cmax 及び AUC24h(表 2.7.2-5 [9785-CL-0007]) c 表中に示した代表的なヒトでの値に対するマウス単回投与時の Cmax あるいは AUC24h 値の比 NA, 該当値無し; NC, 未計算 マウスでの 1 週間反復投与毒性試験において,ICR マウス(n=5/性/群)に MDV3100 を 30, 100 及び 300 mg/kg/day の投与量で経口投与した(9785-TX-0007(参)) 。その結果,300 mg/kg/day 投 与群の投与 2 日に雌で間代性痙攣が認められた。 1 群 10 例の雄性マウスに溶媒あるいは MDV3100 の 60 あるいは 200 mg/kg/day を 1 日 1 回 7 日 間あるいは MDV3100 の 400 mg/kg を単回経口投与し,ビデオでモニタリングして痙攣の発生を調 べた(9785-PT-0005(参)) 。その結果,200 mg/kg/day 投与群では投与開始日の投与後 9 から 23 時間に,投与 2 及び 3 日の投与後 1 から 22 時間に強直性あるいは間代性痙攣が認められた。 400 mg/kg 投与群では単回投与後 4 から 24 時間に強直性あるいは間代性痙攣が認められた。 38 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 表 2.6.2.4.1.2-4 用量 雄性マウスの痙攣に関する用量依存性 a 投与期間 痙攣の発生率 0.5%メチルセルロース水溶液 7日 0/10 溶媒( 7日 0/10 7日 0/10 7日 9/10 b 1日 7/10 c ) 60 mg/kg/day 200 mg/kg/day b 400 mg/kg c a b c 試験番号:9785-PT-0005(参) 200 mg/kg/day 投与群では投与 1 日から投与 3 日までに 10 例中 9 例で痙攣が認められた。 400 mg/kg 投与群では単回投与後 24 時間までに 10 例中 7 例で痙攣が認められた。 Foster らは,MDV3100 がマウスに 200 mg/kg/day を投与した際に痙攣を惹起し,また,GABA 開口性クロライドチャネルを阻害することを報告しており(Foster, 2011) ,これは我々と同様の結 果であった。 ラットの 2 週間反復投与毒性試験において,雌雄 SD ラットに溶媒( )あるいは MDV3100 を 10,30 及び 100 mg/kg/day の投与量で経口投与した(n=10/性/群(主試験)及び n=9/性/ 群(血漿中薬物濃度測定試験) ,PRO3100NC31) 。その結果,高用量(100 mg/kg/day)の血漿中薬 物濃度測定群の雌 1 例で投与 9 日に痙攣が認められ,その後死亡した。本動物では死亡前に呼吸 音及び剖検時に肺の赤色が認められたため,これらの変化は投与液の誤嚥に起因するものと考え られた。しかし,誤嚥が痙攣に関与したかどうかは明らかではなかった。なお,100 mg/kg/day 投 与時の MDV3100 の雌の Cmax と AUC24h はそれぞれ 70.8 μmol/L(32.9 μg/mL)及び 349 μg·h/mL で あった。ラット 1 週間反復投与毒性試験において MDV3100 及び M2 を測定した。その結果,そ れぞれの Cmax 値を各群各性ごとに比較すると M2 は MDV3100 のおおむね 10~100 分の 1 程度で 。 あった(9785-TX-0011(参)) 雌雄ビーグル犬を用いた 4 週間反復投与毒性試験(PRO3100NC18)では,高用量群(60 mg/kg/day, n=6/性)の雌 1 例で最終投与翌日,計画屠殺直前に痙攣が認められた。ほかに痙攣は認められな かった。この雌 1 例では痙攣が認められた週までに体重が約 20%減少しており一般状態が悪化し ていたため,痙攣と被験物質との直接的な関連は明確ではなかった。痙攣の認められた動物の曝 露量(Cmax; 73.0 μg/mL 及び AUC24h; 1280 μg·h/mL)は同群の雌の他例に比べ明らかな差異は認め られなかった(Cmax; 59.6 ± 10.5 μg/mL 及び AUC24h; 1180 ± 155 μg·h/mL; 同群の平均±標準偏差) 。 現在実施中であるビーグル犬を用いた 39 週間反復投与毒性試験[n=4/性/群(主群)+ 3/性 ]では,最高投与量である 45 mg/kg/day 投与群の雄 1 例で投与 13 日の投与前に 3 /群(休薬群) 回痙攣が認められた(9785-TX-0013(参))。そのため,当日の投与は中止し,投与 12 日の投与 後 25 時間(初回の痙攣の約 2.5 時間後)及び投与 12 日の投与後 31.5 時間(3 回目の痙攣の 0.5 時 間後)に MDV3100,M1 及び M2 の血漿中濃度を測定した。1 回目の MDV3100,M1 及び M2 の 血漿中濃度はそれぞれ 26.7,7.82 及び 1.73 μg/mL,2 回目はそれぞれ 26.3,5.52 及び 1.89 μg/mL であった。本動物は投与 13 日から 16 日まで休薬したのち 17 日より投与を再開したが,その後投 39 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 与期間を通じて最終投与日まで痙攣は再現しなかった。 また, MDV3100 及び M2 を測定した結果, それぞれの Cmax 値を各群各性ごとに比較すると,M2 は MDV3100 のおおむね 20~50 分の 1 程度 であった(9785-TX-0013(参)) 。 In vivo 非臨床試験における痙攣誘発性に関するまとめ マウスへの MDV3100 の投与により用量依存的な痙攣の発現が認められたが,ラット及びイヌ の反復投与毒性試験では,ラットで 1 例,イヌで 2 例のみに痙攣が認められたにすぎない。しか しながら,いずれの動物とも痙攣を誘発した投与量における MDV3100 の Cmax は同等であった(表 2.6.2.4.1.2-5) 。各試験において MDV3100 と M2 の Cmax 値を動物種毎に比較すると,M2 は MDV3100 に対してマウスではおおむね 2~40 分の 1,ラットでは 10~100 分の 1,イヌでは 20~50 分の 1 程度であり,M2 の血漿中濃度の痙攣発現に対する寄与は MDV3100 に比べ少ないものと考えられ た。それに対して,臨床で 160 mg/day 服用時の定常状態においては,M2 と MDV3100 の Cmax は ほぼ同等であったことから,臨床においては痙攣発作に対する M2 の寄与は非臨床と比較して相 対的に高いと考えられた(表 2.4-2) 。 表 2.6.2.4.1.2-5 a b c d MDV3100 投与により痙攣の認められた最低投与量での MDV3100 の 血漿中薬物濃度(各群各性の平均値) 動物種 投与期間 痙攣の認められた最低用量 性 Cmax (μg/mL) AUC24h (μg·h/mL) マウス a 1週 200 mg/kg 雄 56.5 1047 ラット b 2週 100 mg/kg 雌 32.9 349 イヌ c 4週 60 mg/kg 雌 59.6 1180 イヌ d 39 週 45 mg/kg 雄 23.1 358 試験番号:9785-PT-0005(参), 血漿中薬物濃度データ:9785-TX-0002(参) 試験番号:PRO3100NC31 試験番号:PRO3100NC18 試験番号:9785-TX-0013(参) 2.6.2.4.2 呼吸系に及ぼす影響 添付資料 4.2.1.3-7 雄性ラット(n=8/群)に MDV3100 の 30,100 及び 200 mg/kg を単回経口投与し,プレチスモ グラフ法により呼吸パラメータ(呼吸数,一回換気量,分時換気量)を測定した(PRO3100NC95)。 溶媒( )対照群として投与容量に応じて 2 群を設定した。投与容量は 0,30 及び 100 mg/kg 投与群については 2.2 mL/kg,0 及び 200 mg/kg 投与群については 4.4 mL/kg とした。なお,投与は 1 時間以上プレスチモチャンバーに順化させベースラインのデータを測定したのちに行い,その 後 8 時間以上データを収集した。 40 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 その結果,MDV3100 は 200 mg/kg 投与群まで呼吸パラメータ及び一般症状に影響を及ぼさな かった。 2.6.2.4.3 心血管系に及ぼす影響 2.6.2.4.3.1 MDV3100 及び M2 の hERG チャネルに対する作用 添付資料 4.2.1.3-4 hERG チャネルを介するカリウム電流(hERG 電流)に及ぼす影響を,hERG チャネルを発現さ せたヒト胎児腎臓由来細胞(HEK293 細胞)を用いてパッチクランプ法により評価した。 その結果,MDV3100(3~60.5 μmol/L)及び M2(3~60 μmol/L)は hERG 電流を抑制し,IC50 はそれぞれ 15.7 μmol/L(7.29 μg/mL)及び 18.6 μmol/L(8.38 μg/mL)であった(PRO3100NC104 及び PRO3100NC107) 。 一般的に,hERG チャネルの阻害は薬物がチャネル内腔に取り込まれることによって生じるた め,血漿中の非蛋白結合型の薬物が関与すると考えられる。去勢抵抗性前立腺癌患者に 160 mg/day の用量を反復投与した場合の定常状態における,MDV3100 及び M2 の最高血漿中非蛋白結合型濃 度はそれぞれ 0.460 μg/mL 及び 0.613 μg/mL であり,hERG 電流抑制作用の IC50 と比較して,それ ぞれ 16 倍及び 14 倍低かった(表 2.4-2)。 2.6.2.4.3.2 無麻酔イヌの心血管系に対する作用 添付資料 4.2.1.3-8 テレメトリー送信器を埋め込んだ無麻酔無拘束下の雄性ビーグル犬(n=4)に,溶媒( ) ならびに MDV3100 の 5,15 及び 30 mg/kg を,ラテン方格法にて 14 日間隔で強制経口投与して心 血管系に対する作用を検討した(PRO3100NC94) 。また,上記の最終投与後に 14 日間の休薬期間 を設け,同じ個体を用いて血漿中薬物濃度の測定を行った。動物は 2 群 (n=2/群) に分け, MDV3100 の 15 あるいは 30 mg/kg を投与し,投与前と投与後 2,4,8,12,24,48,72,120 及び 168 時間 に採血を行い血漿中薬物濃度を測定した。 その結果,いずれの用量においても血行動態パラメータ(血圧及び心拍数)に MDV3100 投与 に起因すると思われる変化は認められなかった。また,心電図パラメータ(PR,RR,QRS,QT 及び QTc 間隔)も定性的及び定量的に正常範囲内であった。1 例では溶媒投与後に散発的な第二 度房室ブロックがみられたが,正常範囲内の変化と考えられた。心電図波形の異常や不整脈も認 められず,死亡例もなかった。 MDV3100 の血漿中曝露の増加は,15 及び 30 mg/kg 投与群の間で用量比より小さく,Cmax では 15 mg/kg と比較して 30 mg/kg の方がわずかに低かった。15 及び 30 mg/kg 投与時の平均 Cmax はそ れぞれ 11.5 及び 8.07 μg/mL,tmax は 10 及び 24 時間,AUC168h は 448 及び 582 μg·h/mL,t1/2 は 32.7 及び 42.9 時間であった。また,投与後 2 及び 24 時間の間における MDV3100 の血漿中濃度の変動 は 2 倍未満であった。4 例のイヌすべてにおいて,最終採血時点である投与後 168 時間において 41 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 も MDV3100 が検出された(> 0.0100 μg/mL) 。15 mg/kg 投与時の Cmax(11.5 μg/mL)は 160 mg/day を投与された去勢抵抗性前立腺癌患者での定常状態での Cmax(14.5 μg/mL)とほぼ同等であった。 以上の in vitro 及び in vivo での心血管系に関する安全性評価の結果より,去勢抵抗性前立腺癌患 者に 160 mg/day を投与した際に心血管系に影響を及ぼす可能性は少ないものと考えられた。 2.6.2.5 薬力学的薬物相互作用試験 薬力学的薬物相互作用に関する試験は実施しなかった。 2.6.2.6 考察及び結論 非臨床薬効薬理試験において,MDV3100 は AR シグナル伝達阻害薬であることが示された。 MDV3100 は,アンドロゲンの AR に対する結合を阻害し,アンドロゲン存在下で AR の核内移行 を阻害し, AR とその下流遺伝子との結合を阻害した。 去勢抵抗性前立腺癌細胞(LNCaP/AR, VCaP, W741C-LNCaP)において,MDV3100 は,AR 依存性遺伝子転写活性の阻害作用,細胞増殖抑制作 用,アポトーシスによる細胞死の誘導作用を示した。AR を過剰発現させた前立腺癌細胞 (LNCaP/AR)をマウスに移植した去勢抵抗性前立腺癌担癌モデルにおいて,MDV3100 は腫瘍退 縮作用を示した。MDV3100 が去勢抵抗性前立腺癌モデルにおいて,臨床推奨用量である 160 mg/day に相当する投与量(50 mg/kg)で腫瘍退縮作用を示したことから,MDV3100 の去勢抵 抗性前立腺癌患者に対する効果が期待できる。また,ビカルタミドなどの抗アンドロゲン薬は長 期投与により,AR に対するアゴニスト活性を示すようになることから,抗腫瘍効果が減弱すると 考えられている。これら抗アンドロゲン薬がアゴニスト作用を示す複数の評価系において, MDV3100 は AR に対するアゴニスト作用を示さないことが確認された。これらの結果から, MDV3100 は既存の抗アンドロゲン薬とは異なり,前立腺癌患者に対して,長期投与による薬効減 弱や癌細胞に対する増殖促進を誘導しないと推察される。 ヒト血漿中に認められる主要代謝物 M1 及び M2 に関して,M2 は MDV3100 と同等の AR シグ ナル伝達阻害作用を有していることが確認されたが,M1 にはそのような作用は認められなかった。 更に,M2 はプロゲステロン受容体並びに GABA 開口性クロライドチャネルに対して,MDV3100 と同等の阻害活性を有することが確認された。 各種受容体及び酵素に対する薬理学的試験において MDV3100 は GABA 開口性クロライドチャ ネルに対する阻害活性を示し,マウスでは 200 mg/kg/day 以上の投与量で用量依存的に痙攣が発現 した。また,ラット及びイヌの反復投与毒性試験で低頻度ではあるが痙攣が認められた。以上の データより MDV3100 は用量依存的に痙攣を誘発する可能性が示唆された。MDV3100 の痙攣誘発 作用は臨床での安全性評価(2.5.1.4.2)における成績との関連が疑われる。対照群を設定しないオー プンラベル試験(第 I 相試験[S-3100-1-01])においても 360 mg/day 以上の用量において痙攣発作 が認められており,臨床での投与量の上限を規定する毒性であった。そのため,痙攣発作の既往 42 2.6.2 薬理試験の概要文 MDV3100 や素因を有する患者ならびに痙攣発作に対する閾値を低下させる懸念のある薬剤を処方されてい る患者への MDV3100 の使用にはより注意が必要と考えられた。非臨床試験において MDV3100 と M2 の Cmax 値を比較すると,M2 は MDV3100 のおおむね 2~100 分の 1 程度であったが,臨床 では 160 mg/day 服用時の定常状態において,M2 と MDV3100 の Cmax はほぼ同等であり,臨床に おいては非臨床に比べ痙攣発作に対する M2 の寄与が相対的に高いと思われた。 更に,MDV3100 の中枢神経系,呼吸系及び心血管系に対する作用を評価した。MDV3100 をラッ トに 200 mg/kg まで単回経口投与した結果,神経行動学的な急性作用あるいは呼吸系に対する影 響を示さなかった。心血管系機能の評価では,MDV3100 及び M2 は in vitro において hERG 電流 を阻害することが示されたが,IC50 は 160 mg/day を服用する患者で予想される血漿中非蛋白結合 型濃度よりもいずれも 10 倍以上高かった。ビーグル犬に MDV3100 を 30 mg/kg まで単回経口投与 しテレメトリーシステムを用いて検討した結果,心血管系に対する影響は認められなかった。 2.6.2.7 図表 図表は各項の本文中の適切な場所に挿入した。 2.6.2.8 参考文献 Chen CD, Welsbie DS, Tran C et al. 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Epilepsia 2001;42(Suppl 3):8-12. 44 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 目次 2.6.3 薬理試験概要表.............................................................................................................2 2.6.3.1 薬理試験:一覧表.......................................................................................................2 2.6.3.2 効力を裏付ける試験.................................................................................................11 2.6.3.3 副次的薬理試験 ........................................................................................................21 2.6.3.4 安全性薬理試験 ........................................................................................................31 2.6.3.5 薬力学的薬物相互作用試験 ......................................................................................39 / アステラス製薬 1 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3 2.6.3.1 薬理試験概要表 薬理試験:一覧表 2.6.3.1.1 薬理試験:一覧表(その 1) 被験物質:MDV3100 CTD No. (Study Number) Test System Method of Administration GLP Study Binding of MDV3100 and bicalutamide to human AR In vitro binding to AR in LNCaP cytosolic extract In vitro No 4.2.1.1-1 (PRO3100NC44) Binding of MDV3100 to human AR In vitro binding to AR in LNCaP cytosolic extract In vitro No 4.2.1.1-2 (PRO3100NC66) Binding of MDV3100, bicalutamide, nilutamide and hydroxyflutamide to human AR In vitro binding to AR in LNCaP cytosolic extract In vitro No 4.2.1.1-3 (PRO3100NC132) Binding of MDV3100, bicalutamide, hydroxyflutamide and nilutamide to human AR In vitro binding to AR in LNCaP cytosolic extract In vitro No 4.2.1.1-4 (PRO3100NC134) Determination of binding (orthosteric, allosteric) of MDV3100 to human AR In vitro binding to AR in LNCaP cytosolic extract In vitro No 4.2.1.1-5 (PRO3100NC81) Type of Study Testing Facility Primary Pharmacodynamics Effects of MDV3100 on AR nuclear translocation, cell viability and apoptotic markers Nuclear localization with AR-YFP in HEK293 cells; Growth and apoptosis of LNCaP/AR cells In vitro No Medivation Chile Laboratory Fundación Ciencias Para la Vida, Avda. Zañartu 1482 Ñuñoa. Santiago. Chile 4.2.1.1-6 (PRO3100NC155) Table continued on next page 2 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.1.1 薬理試験:一覧表(その 2) 被験物質:MDV3100 CTD No. (Study Number) Test System Method of Administration GLP Study AR nuclear translocation agonist and antagonist activity of MDV3100 and bicalutamide Cell-based assay for receptor nuclear translocation activities In vitro No 4.2.1.1-7 (PRO3100NC43) AR nuclear translocation agonist and antagonist activity of MDV3100 and bicalutamide Cell-based assays for receptor nuclear translocation protein interaction and androgen response element activities In vitro No 4.2.1.1-8 (PRO3100NC57) AR nuclear translocation agonist and antagonist activity of MDV3100 Cell-based assay for receptor nuclear translocation activity In vitro No 4.2.1.1-9 (PRO3100NC78) AR nuclear translocation agonist and antagonist activity of MDV3100, bicalutamide, nilutamide and hydroxyflutamide Cell-based assay for receptor nuclear translocation activity In vitro No 4.2.1.1-10 (PRO3100NC127) AR nuclear translocation agonist activity of MDV3100, bicalutamide, nilutamide and hydroxyflutamide Cell-based assay for AR receptor nuclear translocation activity In vitro No 4.2.1.1-11 (PRO3100NC138) Type of Study Testing Facility Primary Pharmacodynamics (continued) Table continued on next page 3 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.1.1 薬理試験:一覧表(その 3) 被験物質:MDV3100, M1, M2, M3, M4, M5, M6 CTD No. (Study Number) Test System Method of Administration GLP Study Binding of MDV3100 metabolites M1, M2, M3 and M4 to human AR In vitro binding to AR in LNCaP cytosolic extract In vitro No 4.2.1.1-12 (PRO3100NC65) Binding of MDV3100 and metabolites M1, M2, M3 and M4 to human AR In vitro binding to AR in LNCaP cytosolic extract In vitro No 4.2.1.1-13 (PRO3100NC73) Binding of MDV3100 metabolites M5 and M6 to human AR In vitro binding to AR in LNCaP cytosolic extract In vitro No 4.2.1.1-14 (PRO3100NC116) Binding of MDV3100 metabolites M1, M2, M3 and M4 to human AR In vitro binding to AR in LNCaP cytosolic extract In vitro No 4.2.1.1-15 (PRO3100NC59) AR nuclear translocation agonist and antagonist activity of MDV3100 metabolites M1, M2, M3 and M4 Cell-based assay for receptor nuclear translocation activity In vitro No 4.2.1.1-16 (PRO3100NC70) Binding affinity of MDV3100 on human and rat androgen receptor In vitro binding to AR in cytosolic extract from human wild type AR-transfected COS-1 cells Type of Study Testing Facility Primary Pharmacodynamics (continued) In vitro No Pharmacology Research Laboratories Astellas Pharma Inc., 21, Miyukigaoka, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8585, Japan 4.2.1.1-17 (9785-PH-0002) Table continued on next page 4 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.1.1 薬理試験:一覧表(その 4) 被験物質:MDV3100 Type of Study Test System Method of Administration GLP Study Testing Facility CTD No. (Study Number) No Applied Pharmacology Research Laboratories Astellas Pharma Inc., 21, Miyukigaoka, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8585, Japan 4.2.1.1-18 (9785-PH-0003) No Applied Pharmacology Research Laboratories Astellas Pharma Inc., 21, Miyukigaoka, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8585, Japan 4.2.1.1-19 (9785-PH-0004) Pharmacology Research Laboratories Astellas Pharma Inc., 21, Miyukigaoka, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8585, Japan 4.2.1.1-20 (9785-PH-0005) Primary Pharmacodynamics (continued) Effects of MDV3100, bicalutamide and hydroxyflutamide on cell growth of LNCaP and W741C-LNCaP, human prostate cancer cells LNCaP and W741C mutated AR-transfected LNCaP human prostate cancer cells In vitro Inhibitory effects of MDV3100, bicalutamide and hydroxyflutamide on DHT-induced cell growth of LNCaP and W741C-LNCaP, human prostate cancer cells LNCaP and W741C mutated AR-transfected LNCaP human prostate cancer cells Effects of MDV3100 and bicalutamide on binding of AR to PSA and TMPRSS2 enhancer regions Cell-based chromatin immunoprecipitation assay using LNCaP cells which overexpress human wild type-AR In vitro No Antitumor effects of MDV3100 on LNCaP AR Lux human prostate cancer xenografts in castrated SCID mice LNCaP AR Lux cells implanted in 5-9-week old castrated male CB17SCID mice Oral gavage No 4.2.1.1-21 (PRO3100NC48) Histopathological and IHC comparison in small or large tumors treated with MDV3100 or vehicle LNCaP AR cells implanted in castrated male SCID mice Oral gavage No 4.2.1.1-22(参) (PRO3100NC48 Study 11) In vitro Table continued on next page 5 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.1.1 薬理試験:一覧表(その 5) 被験物質:MDV3100, M1, M2, M3, M4, M5, M6 CTD No. (Study Number) Test System Method of Administration GLP Study Binding and effects of MDV3100 on various receptors and enzymes Receptor binding and enzyme assays using scintillation counting, HTRF, RIA, photometry and fluorimetry In vitro No 4.2.1.2-1 (PRO3100NC49) Effects of MDV3100 on PR, AR and chloride channel PR, AR and chloride channel binding assay In vitro No 4.2.1.2-2 (PRO3100NC50) Effects of MDV3100 and its metabolites M1, M2, M3 and M4 at GABAA Receptors Human ionotropic GABAA receptors α1β3 and α1β3γ2 In vitro No 4.2.1.2-3 (PRO3100NC72) Screening of MDV3100 for agonist effect on progesterone receptor β Cell-based assay for receptor protein interaction activity In vitro No 4.2.1.2-4 (PRO3100NC131) Screening of MDV3100 and its metabolites M5 and M6, and other metabolites, for estrogen receptor binding In vitro human estrogen receptor binding assay In vitro No 4.2.1.2-5 (PRO3100NC68) Cell-based assay for receptor protein interaction activity In vitro No 4.2.1.2-6 (PRO3100NC129) Type of Study Testing Facility Secondary Pharmacodynamics Screening of MDV3100 for agonist and antagonist effect on estrogen receptor α Table continued on next page 6 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.1.1 薬理試験:一覧表(その 6) 被験物質:MDV3100, M1, M2, M3, M4 CTD No. (Study Number) Test System Method of Administration GLP Study In Vitro Pharmacology: Kinase Assays Receptor kinase assays using HTRF In vitro No 4.2.1.2-7 (PRO3100NC58) In Vitro Pharmacology: Comprehensive Kinase Profile Study of MDV3100 Human kinase assays using LANCE® or HTRF In vitro No 4.2.1.2-8 (PRO3100NC136) Effect of MDV3100 on various kinases and other enzymes Enzyme assays In vitro No 4.2.1.2-9 (PRO3100NC137) Receptor binding and enzyme assays using scintillation counting, HTRF, photometry and fluorimetry In vitro No 4.2.1.2-10 (PRO3100NC63) Effect of M1 and M2 on various kinases Enzyme assays In vitro No 4.2.1.2-11 (PRO3100NC141) Effect of M1 and M2 on various kinases Kinase assays using LANCE and HTRF In vitro No 4.2.1.2-12 (PRO3100NC142) Type of Study Testing Facility Secondary Pharmacodynamics (continued) Receptor binding and enzyme inhibition by MDV3100 metabolites M1, M2, M3 and M4 Table continued on next page 7 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.1.1 薬理試験:一覧表(その 7) 被験物質:MDV3100, M1, M2 CTD No. (Study Number) Test System Method of Administration GLP Study Effect of M2 on progesterone receptor and GABA-gated chloride channel assays Protein binding inhibition assays In vitro No 4.2.1.2-13 (PRO3100NC154) Binding of MDV3100 to progesterone receptor In vitro progesterone receptor binding assay In vitro No 4.2.1.2-14 (PRO3100NC130) Progesterone receptors α and β protein interaction antagonist activity of MDV3100 Cell-based assay for receptor protein interaction activity In vitro No 4.2.1.2-15 (PRO3100NC145) MDCK cells In vitro No 4.2.1.2-16 (PRO3100NC159) In Vitro Pharmacology: Human Receptor Binding Assays MDV3100_M1 Binding assays for adenosine A3, CCK1 receptor and norepinephrine transporter In vitro No 4.2.1.2-17 (PRO3100NC158) In Vitro Pharmacology: Human Receptor Functional Assays MDV3100_M1 Cell based activity assays for Adenosine A3 receptor and the CCK1 receptor In vitro No 4.2.1.2-18 (PRO3100NC160) Type of Study Testing Facility Secondary Pharmacodynamics (continued) Effect of M1 on cellular uptake of norepinephrine Table continued on next page 8 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.1.1 薬理試験:一覧表(その 8) 被験物質:MDV3100, M2 CTD No. (Study Number) Test System Method of Administration GLP Study Effects of MDV3100 on cloned hERG potassium channels expressed in human embryonic kidney cells hERG potassium channels stably expressed in HEK293 cells In vitro No 4.2.1.3-1(参) (PRO3100NC91) Effects of M2 on cloned hERG potassium channels expressed in human embryonic kidney cells hERG potassium channels stably expressed in HEK293 cells In vitro No 4.2.1.3-2(参) (PRO3100NC92) Effects of MDV3100 on cloned hERG potassium channels expressed in mammalian cells hERG potassium channels stably expressed in HEK293 cells In vitro Yes 4.2.1.3-3 (PRO3100NC104) Effects of M2 on cloned hERG potassium channels expressed in mammalian cells hERG potassium channels stably expressed in HEK293 cells In vitro Yes 4.2.1.3-4 (PRO3100NC107) Type of Study Testing Facility Safety Pharmacology Table continued on next page 9 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.1.1 薬理試験:一覧表(その 9) 被験物質:MDV3100 CTD No. (Study Number) Test System Method of Administration GLP Study Male mice, Crlj:CD1 (ICR), SPF Oral gavage No 4.2.1.3-5(参) (9785-PT-0005) Neurobehavioral evaluation of orally administered MDV3100 in rats Male rats (Sprague Dawley) Oral gavage Yes 4.2.1.3-6 (PRO3100NC96) Respiratory evaluation of orally administered MDV3100 in male rats Male rats (Sprague Dawley) Oral gavage Yes 4.2.1.3-7 (PRO3100NC95) Cardiovascular Safety Pharmacology Evaluation of MDV3100 administered by oral gavage to naive telemetry-instrumented conscious male beagle dogs with a toxicokinetic arm Male beagle dogs Oral gavage Yes 4.2.1.3-8 (PRO3100NC94) Type of Study Testing Facility Safety Pharmacology (continued) Evaluation of convulsive effects of MDV3100 in mice AR:アンドロゲン受容体,CCK1:コレシストキニン 1 受容体,COS-1:アフリカミドリザル腎臓由来細胞,GABA:ガンマアミノ酪酸,GLP:医薬品の安全性に関 する非臨床試験の実施基準,HEK293:ヒト胎児腎臓由来細胞株,hERG:ヒト ether-à-go-go-関連遺伝子,HTRF:均一系時間分解蛍光法,LANCE:ランタニドキレー ト励起法(測定法),LNCaP:ヒト前立腺癌細胞株,M1:MDV3100 代謝物 1(MDPC0001),M2:MDV3100 代謝物 2(MDPC0002),M3:MDV3100 代謝物 3(MDPC0003), M4:MDV3100 代謝物 4(MDPC0004),M5:MDV3100 代謝物 5(MDV3105),M6:MDV3100 代謝物 6(MDV3106),PR:プロゲステロン受容体,RIA:ラジオ イムノアッセイ,SCID:複合免疫不全 10 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.2 効力を裏付ける試験 2.6.3.2.1 効力を裏付ける試験(In vitro, その 1) 被験物質:MDV3100 Objective Species/Test System Determine binding affinity of MDV3100 and bicalutamide for human AR In vitro competitive binding of MDV3100 or bicalutamide with [3H]methyltrienolone in a LNCaP cell cytosolic extract Determine binding affinity of MDV3100 for human AR In vitro competitive binding of MDV3100 with [3H]methyltrienolone in a LNCaP cell cytosolic extract Determine binding affinity of MDV3100, bicalutamide, nilutamide and hydroxyflutamide for human AR In vitro competitive binding of MDV3100, bicalutamide, nilutamide and hydroxyflutamide with [3H]methyltrienolone in a LNCaP cell cytosolic extract na 2 2 2 Regimen/Methodology Range of concentrations, 1×10-9 to 1×10-5 mol/L of MDV3100 or bicalutamide Range of concentrations, 3×10-10 to 1×10-5 mol/L of MDV3100 Range of concentrations, 3×10-10 to 1×10-5 mol/L of each test compound Key Results Compound IC50, mol/L Ki, mol/L MDV3100 3.45×10-8 1.30×10-8 MDV3100 (replicate) 5.16×10-8 1.88×10-8 Bicalutamide 8.31×10-8 3.04×10-8 MDV3100: IC50 = 3.59×10-8 mol/L Ki = 1.31×10-8 mol/L Compound IC50, mol/L Ki, mol/L MDV3100 1.08×10-7 3.78×10-8 Hydroxyflutamide 1.09×10-8 3.82×10-9 Bicalutamide 1.61×10-7 5.64×10-8 Nilutamide 2.23×10-8 7.82×10-9 GLP Study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.1-1 (PRO3100NC44) No 4.2.1.1-2 (PRO3100NC66) No 4.2.1.1-3 (PRO3100NC132) Table continued on next page 11 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.2.1 効力を裏付ける試験(In vitro, その 2) 被験物質:MDV3100 Objective Species/Test System Determine binding affinity of MDV3100, bicalutamide, nilutamide and hydroxyflutamide for human AR In vitro competitive binding of MDV3100, bicalutamide, nilutamide and hydroxyflutamide with [3H]methyltrienolone in a LNCaP cell cytosolic extract na 2 Regimen/Methodology Range of concentrations, 3×10-10 to 1×10-5 mol/L of each test compound Key Results Compound IC50, mol/L Ki, mol/L MDV3100 5.22×10-8 2.05×10-8 Hydroxyflutamide 9.37×10-9 3.69×10-9 Bicalutamide 6.64×10-8 2.61×10-8 Nilutamide 1.75×10-8 6.89×10-9 GLP Study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.1-4 (PRO3100NC134) No 4.2.1.1-5 (PRO3100NC81) Inhibition by MDV3100 at radioligand concentrations approximating the Kd seems to be competitive, or orthosteric. Determine whether MDV3100 binding to human AR is orthosteric or allosteric In vitro human AR binding assay with varying radioligand ([3H]-R1881) concentrations 2 In vitro 8-point concentration dose response of MDV3100 binding at each radioligand concentration [3H]-R1881, nmol/L IC50, nmol/L Ki, nmol/L 10 1066 33 3 259 40 1 183 48 0.5 118 52 0.1 77 51 0.05 68 73 Table continued on next page 12 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.2.1 効力を裏付ける試験(In vitro, その 3) 被験物質:MDV3100 Objective Effects of MDV3100 on AR nuclear translocation Effects of MDV3100 on cell viability and induction of apoptotic markers Species/Test System na In vitro AR nuclear translocation: AR nuclear HEK293 cells expressing a fluorescent translocation : n=1 wild type AR-yellow fluorescence protein fusion Viability and apoptosis: LNCaP/AR cells Viability and apoptosis: n=2 Regimen/Methodology Key Results AR nuclear translocation: In vitro 1 μmol/L of MDV3100 or bicalutamide with 1 nmol/L of DHT, and 1 and 10 μmol/L of compounds without DHT AR nuclear translocation: MDV3100 inhibited DHT-induced AR nuclear translocation at 1 μmol/L. MDV3100 did not induce AR nuclear translocation at 1 or 10 μmol/L. Bicalutamide partially inhibited DHT-induced AR nuclear translocation at 1 μmol/L. Bicalutamide induced AR nuclear translocation at 1 or10 μmol/L. Viability: In vitro 1 and 10 μmol/L of MDV3100 with or without 1 nmol/L of DHT for 6 days. Viability measured with MTS assay. Apoptosis: In vitro 1 and 10 μmol/L of MDV3100 with or without 1 nmol/L of DHT for 2 or 4 days. Apoptosis by Western analysis for cleaved caspase 3 Cell Viability: MDV3100 at 1 and 10 μmol/L reduced cell viability. GLP Study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.1-6 (PRO3100NC155) Cell apoptosis: MDV3100 at 1 and 10 μmol/L induced apoptosis (cleaved caspase 3). Table continued on next page 13 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.2.1 効力を裏付ける試験(In vitro, その 4) 被験物質:MDV3100 Objective Determine AR agonist and antagonist dose response curves of MDV3100 and bicalutamide Determine AR agonist and antagonist dose response curves of MDV3100 and bicalutamide and cell toxicity AR agonist and antagonist dose response curves, light scattering spectroscopy to determine compound solubility Species/Test System na Regimen/Methodology Key Results GLP Study CTD No. (Study Number) 2 Range of concentrations, 0 to 16.0 μmol/L of bicalutamide or MDV3100 Norgesterol as a control agonist Bicalutamide induced a weak agonist response. No agonist response was observed with MDV3100. Bicalutamide and MDV3100 inhibited nuclear translocation of AR with IC50 of 0.70 and 0.85 μmol/L, respectively. No 4.2.1.1-7 (PRO3100NC43) 2 Range of concentrations, 0 to 60 μmol/L of MDV3100 or bicalutamide Norgesterol and Geldanamycin as controls Bicalutamide induced a partial agonist response in the Biosensor Androgen nuclear translocation and receptor/co-activator interaction assays. No agonist response was observed with MDV3100. Both compounds acted as inhibitors of AR activity when challenged with EC80 of agonist. Agonist and antagonist activities were observed for both compounds in an Androgen Response Element gene reporter assay demonstrating the AR in CHO-AR cells was able to act as a transcription factor. No conclusive evidence of toxicity was obtained. No 4.2.1.1-8 (PRO3100NC57) 2 Range of concentrations, 0 to 60 μmol/L of MDV3100 Norgesterol and Geldanamycin as controls MDV3100 inhibited AR nuclear translocation with IC50 of 1.5 μmol/L No 4.2.1.1-9 (PRO3100NC78) In vitro protein interaction and nuclear translocation assays In vitro protein interaction, nuclear translocation and Androgen response element assays In vitro protein interaction and nuclear translocation assays Table continued on next page 14 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.2.1 効力を裏付ける試験(In vitro, その 5) 被験物質:MDV3100 Objective Species/Test System na Regimen/ Methodology Key Results Agonist mode Nuclear hormone AR agonist and antagonist activity by four compounds in cells In vitro nuclear translocation assays 2 0 to 3×10-5 mol/L, 6α-fluorotestosterone, MDV3100, bicalutamide, nilutamide or hydroxyflutamide GLP Study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.1-10 (PRO3100NC127) No 4.2.1.1-11 (PRO3100NC138) Antagonist mode Compound EC50, nmol/L 6α-fluorotestosterone 33.83 100% NR NR MDV3100 >30000 1% 5513 83% Bicalutamide 26440 11% 2482 74% Nilutamide 17860 22% 5614 70% Hydroxyflutamide >30000 3% 5645 76% Max. % IC50, Max. % activity nmol/L Inh. MDV3100 had the weakest agonist activity of all four compounds at 1% Nuclear hormone AR agonist activity by four compounds in cells In vitro nuclear translocation assays 2 0 to 3×10-5 mol/L, 6α-fluorotestosterone, MDV3100, bicalutamide, nilutamide or hydroxyflutamide Compound EC50, nmol/L Max % Activity 6α-fluorotestosterone 6.2 100% MDV3100 >30000 1% Bicalutamide 17560 14% Nilutamide >30000 5% Hydroxyflutamide 18880 17% Table continued on next page 15 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.2.1 効力を裏付ける試験(In vitro, その 6) 被験物質:MDV3100, M1, M2, M3, M4, M5, M6 Objective Species/Test System In vitro competitive Determine binding binding of MDV3100 affinity of metabolites M1, M2, M3 MDV3100 or M4 with metabolites M1, [3H]methyltrienolone in a M2, M3 and M4 LNCaP cell cytosolic for human AR extract Determine binding affinity of MDV3100 and metabolites M1, M2, M3 and M4 for human AR Determine binding affinity of MDPC0005 and MDPC0006 for human AR In vitro human AR binding assay In vitro human AR binding assay na Regimen/ Methodology -10 2 2 2 3×10 to 1×10-5 mol/L 1×10-9 to 1×10-5 mol/L each of MDV3100, M1, M2, M3 or M4 3×10-10 to 1×10-5 mol/L of MDV3105 (MDPC0005) or MDV3106 (MDPC0006) Key Results Compound IC50, mol/L Ki, mol/L M1 > 1.0×10-5 NA M2 1.76×10-7 5.89×10-8 M3 9.38×10-7 3.14×10-7 M4 1.08×10-6 3.61×10-7 Compound IC50, mol/L Ki, mol/L -7 MDV3100 1.3×10 M1 > 1.0×10-5 CTD No. (Study Number) No 4.2.1.1-12 (PRO3100NC65) No 4.2.1.1-13 (PRO3100NC73) No 4.2.1.1-14 (PRO3100NC116) 5.7×10-8 NA 1.2×10 -7 5.1×10 M3 3.4×10 -6 1.5×10-6 M4 2.2×10-6 9.7×10-7 Compound IC50, mol/L Ki, mol/L MDPC0005 NA NA MDPC0006 1.35×10-7 5.72×10-8 M2 GLP Study -8 Table continued on next page 16 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.2.1 効力を裏付ける試験(In vitro, その 7) 被験物質:M1, M2, M3, M4 Objective Species/Test System Determine human AR binding by M1, M2, M3 and M4 In vitro human AR binding assay na Regimen/Methodology 2 1×10-9 to 1×10-5 mol/L M1, M2, M3 or M4 Key Results IC50 for M1 was not calculable (> 1.0×10-5 mol/L). IC50 for M2, M3 and M4 were 1.7×10-7, 1.9×10-6 and 1.6×10-6 mol/L, respectively. GLP Study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.1-15 (PRO3100NC59) No 4.2.1.1-16 (PRO3100NC70) No agonist response was observed for the test compounds. Varying degrees of AR nuclear translocation inhibition (antagonism) were observed. Human AR agonist and antagonist dose response curves for M1, M2, M3 and M4 In vitro biosensor androgen receptor nuclear translocation and protein interaction assays 2 0.003 to 60 μmol/L of M1, M2, M3 and M4 Norgesterol and Geldanamycin as controls Compound EC50, µmol/L (agonist mode) IC50, μmol/L (antagonist mode) Control b 0.004 0.018 M1 NR > 60 M2 NR 3.2 M3 NR 16.2 M4 NR 11.6 Table continued on next page 17 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.2.1 効力を裏付ける試験(In vitro, その 8) 被験物質:MDV3100 Objective Determine binding affinity of MDV3100, bicalutamide and hydroxyflutamide for human wild type-AR Proliferative effects of MDV3100, bicalutamide and hydroxyflutamide on cell growth of human prostate cancer cells Inhibitory effects of MDV3100, bicalutamide and hydroxyflutamide on DHT-induced cell growth of human prostate cancer cells GLP Study CTD No. (Study Number) Ki values of MDV3100, bicalutamide and hydroxyflutamide for human wild type-AR were 38, 42 and 18 nmol/L, respectively. No 4.2.1.1-17 (9785-PH-0002) 10, 30, 100, 300, 1000 and 3000 nmol/L of MDV3100, bicalutamide and hydroxyflutamide incubated for 6 days MDV3100 did not have any agonistic activities on either T877A mutated AR or W741C mutated AR. No 4.2.1.1-18 (9785-PH-0003) 3 (MDV3100 only), 10, 30, 100, 300, 1000 and 3000 nmol/L (bicalutamide and hydroxyflutamide only) of MDV3100, bicalutamide and hydroxyflutamide incubated for 6 days in the presence of 1 nmol/L of DHT MDV3100 has antagonistic activities on both T877A mutated AR and W741C mutated AR. No 4.2.1.1-19 (9785-PH-0004) Species/Test System na Regimen/Methodology In vitro binding of MDV3100, bicalutamide or hydroxyflutamide with [3H]DHT in cytosolic extract from human wild type AR-transfected COS-1 cells 4 independent experiments performed in triplicate 3 to 3000 nmol/L of each test compound and 3 nmol/L of [3H]DHT incubated for 4 hs In vitro LNCaP and W741C mutated AR-transfected LNCaP human prostate cancer cells 3 independent experiments with 6 wells per dose for each cell line 3 independent experiments with 6 wells per dose for each cell line In vitro LNCaP and W741C mutated AR-transfected LNCaP human prostate cancer cells Key Results Table continued on next page 18 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.2.2 効力を裏付ける試験(In vitro, その 9) 被験物質:MDV3100 Objective Species/Test System Evaluate the effect of MDV3100 and bicalutamide on the binding of AR to PSA and TMPRSS2 enhancer regions in the presence or absence of DHT Cell-based chromatin immunoprecipitation assay using LNCaP cells which overexpress human wild type AR na Regimen/Methodology Key Results GLP Study CTD No. (Study Number) 1 (duplicate) 1 and 10 μmol/L for MDV3100 and bicalutamide in the presence and absence of 1 nmol/L of DHT MDV3100 inhibited DHT-induced AR association with chromatin PSA and TMPRSS2 enhancer regions. MDV3100 did not enhance the binding of AR to chromatin, while bicalutamide induced AR-chromatin association. No 4.2.1.1-20 (9785-PH-0005) a:独立した試行回数,b:アゴニスト活性検討時の対照は norgesterol,アンタゴニスト活性検討時の対照は geldanamycin。 AR:アンドロゲン受容体,CHO-AR:アンドロゲン受容体発現チャイニーズハムスター卵巣細胞,COS-1:アフリカミドリザル腎臓由来細胞,DHT: 5α-ジヒドロテス トステロン,EC50:50%薬効発現濃度,EC80:80%薬効発現濃度,GABA:ガンマアミノ酪酸,GLP:医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施基準,IC50:50%阻害 濃度,Inh.:阻害,Kd:解離定数,K: LNCaP:ヒト前立腺癌細胞株,M1:MDV3100 代謝物 ( 1 MDPC0001/MCPC001),M2:MDV3100 代謝物 2 (MDPC0002/MCPC002) , i 阻害定数, M3:MDV3100 代謝物 3(MDPC0003/MDPC003),M4:MDV3100 代謝物 4(MDPC0004/MDPC004),NA:算出されず,NR:報告なし,PSA:前立腺特異抗原, TMPRSS2:膜貫通プロテアーゼ,セリン 2 型 19 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.2.3 効力を裏付ける試験(In vivo) 被験物質:MDV3100 Objective Species/Test System n Regimen Key Results GLP Study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.1-21 (PRO3100NC48) No 4.2.1.1-22(参) (PRO3100NC48 Study 11) Dose-dependent reduction of tumor growth and significant body weight gain among animals in MDV3100 treatment groups. Antitumor effects of MDV3100 and bicalutamide on LNCaP-AR Lux human prostate cancer xenografts Histophathological and IHC comparison of small or large tumors treated with MDV3100 or vehicle LNCaP-AR Lux cells implanted subcutaneously in 5 - 9 week old castrated male CB17SCID mice Ex vivo tumor tissue 35 (7/ group) Small tumor 7 days = 3/group, 21 days = 4/vehicle 5/MDV3100 1, 10 and 50 mg/kg MDV3100 was administered once-daily by oral gavage for 28 consecutive days; vehicle (1% CMC + 0.1% Tween80) bicalutamide 50 mg/kg Tumors from MDV3100 treated (50 mg/kg) and vehicle treated mice (7 or 21 days of treatment) were sectioned and stained for caspase-3, Ki67 and prostate specific antigen Treatment Group Number of non-measurable tumors/number of mice Tumor volume (SD) at Day 28, mm3 Vehicle 0/7 348 (192) 1 mg/kg MDV3100 1/7 202 (98) 10 mg/kg MDV3100 0/7 133 (93) 50 mg/kg MDV3100 3/7 62 (65) 50 mg/kg Bicalutamide 0/7 330 (198) No significant differences in percent necrosis or caspase-3 and prostate specific antigen staining between vehicle and 50 mg/kg MDV3100 treated tumors. The only significant difference was decreased staining for Ki67 in small tumors treated with 50 mg/kg MDV3100 at 21 days compared with vehicle. Large tumor 7 days = 2/group, 21 days = 2/vehicle 3/MDV3100 AR:アンドロゲン受容体,CMC:カルボキシルメチルセルロース,GLP:医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施基準,IHC:免疫組織化学的,LNCaP:ヒト前 立腺癌細胞株,SCID:複合免疫不全 20 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.3 副次的薬理試験 2.6.3.3.1 副次的薬理試験(その 1) 被験物質:MDV3100 Objective Effect of MDV3100 on 73 unique receptors and 16 unique enzymes Species/Test System Receptors: A1, A2A, A3 (h); α1, α2 (non-selective); β1, β2 (h); AT1, AT2 (h); BZD (central); B1, B2 (h); CB1, CB2 (h); CCKA, CCKB (h); CRF1 (h); D1, D2S, D3, D4.4 (h); ETA, ETB (h); GABA (non-selective); AMPA; kainate; NMDA; ghrelin (h); H1, H2, H3 (h); I1, I2; LTB4 (h); LTD4 (h); LH-RH; MC4 (h); M (non-selective; NK1, NK2, NK3 (h); Y (non-selective); N (neuronal); opioid (non-selective); ORL1 (h); PCP; P2X; P2Y; 5-HT (non-selective); σ (non-selective); sst5 (h); glucocorticoid (h); estrogen (h); progesterone (h); androgen (h); TH; TRH1 (h); Va, V2 (h); Ca2+ channel (L, DHP site, L, diltiazem site, L, verapamil site); K+ATP channel; K+ channel (hERG, h); K+V channel; SK+Ca channel; Na+ channel; Cl- channel; NE transporter (h); DA transporter (h); GABA transporter; choline transporter (h); 5-HT transporter (h) Enzymes: PDE1, PDE2 (h), PDE3 (h), PDE4 (h), PDE5 (h); adenylyl cyclase; guanylyl cylase; PKCα (h); acetylcholinesterase (h); catechol-O-methyl transferase; GABA transaminase; MAO-A (h); MAO-B (h); phenylethanolamine-N-methyl transferase; tyrosine hydroxylase; ATPase (Na+/K+) na 2 Regimen/ Methodology Key Results GLP Study CTD No. (Study Number) In vitro MDV3100 1×10-5 mol/L MDV3100 inhibited specific binding affinities to androgen (h) receptor by 86% and to Cl- channel by 82% at a concentration of 1×10-5 mol/L. An inhibition of > 50% was not observed for other receptors, channels or transporters by MDV3100 at a concentration of 1×10-5 mol/L. No 4.2.1.2-1 (PRO3100NC49) % inhibition or stimulation determined by scintillation counting, HTRF, RIA, photometry or fluorimetry. Table continued on next page 21 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.3.1 副次的薬理試験(その 2) 被験物質:MDV3100 Objective Inhibitory effect of MDV3100 on the PR receptor, AR and Clchannel Species/Test System human PR from MCF-7 cell extract; human AR from cytosolic LNCaP extract; rat GABA-gated chloride channel from cerebral cortex extract % inhibition determined by scintillation counting na 2 Regimen/ Methodology In vitro 1.0×10-6, 5.0×10-6, 1.0×10-5, 2.5×10-5 mol/L Key Results GLP study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.2-2 (PRO3100NC50) MDV3100 inhibited PR activity by 55% at a concentration of 2.5×10-5 mol/L. MDV3100 inhibited AR activity and Clchannel activity with IC50 of 3.1×10-7 and 2.6×10-6 mol/L, respectively. % Inhibition MDV3100 concentration (mol/L) Progesterone 1.0×10-6 5.0×10-6 1.0×10-5 2.5×10-5 7% 15% 38% 55% Table continued on next page 22 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.3.1 副次的薬理試験(その 3) 被験物質:MDV3100, M1, M2, M3, M4 Objective Effect of MDV3100 and metabolites M1, M2, M3 and M4 on GABAA receptors Species/Test System α1β3 and α1β3γ2 human GABAA receptors expressed in Xenopus oocytes na 4 Regimen/ Methodology In vitro 0, 1, 3, 10, 30 and 100 μmol/L MDV3100, M1, M2, M3 or M4 Key Results GLP Study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.2-3 (PRO3100NC72) Brief exposure to MDV3100 or its metabolites; M1, M2, M3 or M4 caused no detectable inward currents at either the α1β3 or the α1β3γ2 GABAA receptor indicating that these compounds do not activate either of these two forms of the GABAA receptor. MDV3100 and its 4 metabolites antagonized the α1β3 GABAA receptor with IC50 and % inhibition summarized below. As inhibition was observed in the μmol/L range, these data indicate that MDV3100 and its metabolites are functional antagonists of the GABAA receptor. α1β3 GABAA Compound IC50 (SEM) b, μmol/L % Inhibition (at 100 µmol/L) MDV3100 3.00 (0.8) 70 M1 20.7 (6.03) 90 c M2 2.3 (1.5) 75 (2.1) M3 4.0 (3.15) 57 M4 1.55 (0.19) c 45.0 (4.62) 78 88 Table continued on next page 23 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.3.1 副次的薬理試験(その 4) 被験物質:MDV3100, M5, M6 Objective Determine agonist activity of MDV3100 on the progesterone receptor ββ Binding of MDV3100 and metabolites M5 and M6 to the estrogen receptor Species/Test System In vitro protein interaction assay Estrogen receptor cell extract preparation from MCF-7 cells Regimen/ Methodology Key Results GLP Study CTD No. (Study Number) 2 In vitro 0, 0.37, 1.11, 3.33, 10, 30 μmol/L MDV3100 MDV3100 did not activate the progesterone receptor β at concentrations up to 30 μmol/L and the EC50 of MDV3100 was > 30000 nmol/L suggesting that MDV3100 is not an agonist of the progesterone receptor β. The positive control compound norgesterol at a concentration of 370 nmol/L, activated the progesterone receptor β at a maximum % of activity of 113% with an EC50 of 6.04 nmol/L. No 4.2.1.2-4 (PRO3100NC131) 2 In vitro competitive binding of 0 or 10 μmol/L MDV3100 with [3H]estradiol MDV3100 did not show significant competition with [3H]estradiol binding (2.49% inhibition) No 4.2.1.2-5 (PRO3100NC68) na Table continued on next page 24 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.3.1 副次的薬理試験(その 5) 被験物質:MDV3100 Objective Determine agonist and antagonist activities of MDV3100 on the estrogen receptor Species/Test System In vitro protein interaction assay Regimen/ Methodology Key Results GLP Study CTD No. (Study Number) 2 In vitro MDV3100, 10 μmol/L MDV3100 did not inhibit the estrogen receptor at a concentration of 10 μmol/L (% inhibition was -2.1%). Also, MDV3100 did not stimulate the estrogen receptor at a concentration of 10 μmol/L (% stimulation was -2.9%). These results suggest that MDV3100 is neither an agonist nor antagonist of the estrogen receptor. No 4.2.1.2-6 (PRO3100NC129) na Effect of MDV3100 on various receptor kinases Akt1/PKBα (h) Akt2/PKBβ (h) Akt3/PKBγ (h) 2 In vitro 1.0×10-6 mol/L, 1.0×10-5 mol/L MDV3100 did not result in any noteworthy inhibition (< 7%). No 4.2.1.2-7 (PRO3100NC58) Effect of MDV3100 on various human kinases Human kinases % inhibition determined by LANCE or HTRF. 2 In vitro 3.0×10-6 mol/L MDV3100 did not result in any noteworthy inhibition. No 4.2.1.2-8 (PRO3100NC136) Effect of MDV3100 in various enzyme assays Deacetylases, serine/arginine-rich kinases, serine-threonine kinases and tyrosine kinases 2 In vitro 3 μmol/L MDV3100 did not inhibit any deacetylase, serine/arginine-rich kinase, serine-threonine kinase or tyrosine kinase activity by > 50%. No 4.2.1.2-9 (PRO3100NC137) Table continued on next page 25 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.3.1 副次的薬理試験(その 6) 被験物質:M1, M2, M3, M4 Objective Effect of MDV3100 metabolites M1, M2, M3 and M4 on 73 unique receptors and 16 unique enzymes Species/Test System Receptors: A1, A2A, A3 (h); α1, α2 (non-selective); β1, β2 (h); AT1, AT2 (h); BZD (central); B1, B2 (h); CB1, CB2 (h); CCKA, CCKB (h); CRF1 (h); D1, D2S, D3, D4.4 (h); ETA, ETB (h); GABA (non-selective); AMPA; kainate; NMDA; H1, H2, H3 (h); I2; LTB4 (h); LTD4 (h); LH-RH; MC4 (h); M (non-selective; NK1, NK2, NK3 (h); Y (non-selective); N (neuronal); opioid (non-selective); ORL1 (h); PCP; P2X; P2Y; 5-HT (non-selective); σ (non-selective); sst5 (h); glucocorticoid (h); estrogen (h); progesterone (h); TH; TRH1 (h); V1a, V2 (h); Ca2+ channel (L, DHP site, L, diltiazem site, L, verapamil site); K+ATP channel; K+ channel (hERG, h); K+V channel; SK+Ca channel; Na+ channel; Clchannel; NE transporter (h); DA transporter (h); GABA transporter; choline transporter (h); 5-HT transporter (h) Enzymes: PDE1B (h), PDE2A (h), PDE3A (h), PDE4D (h), PDE5 (h); adenylyl cyclase; guanylyl cylase; PKCα (h); acetylcholinesterase (h); catechol-O-methyl transferase; GABA transaminase; MAO-A (h); MAO-B (h); phenylethanolamine-N-methyl transferase; tyrosine hydroxylase; ATPase (Na+/K+) na 2d Regimen/ Methodology In vitro 1×10-5 mol/L Key Results M1 inhibited specific binding affinities to A3 (h) receptor by 69%, to norepinephrine transporter (h) by 56%, while M2 inhibited specific binding affinities to progesterone (h) receptor by 74% and to Cl- channel by 81%. An inhibition of > 50% was not observed for other receptors, channels or transporters by the four MDV3100 metabolite compounds. GLP Study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.2-10 (PRO3100NC63) M1 inhibited acetylcholinesterase (h) enzyme activity by 51%. All other enzymes tested were not inhibited by > 50% by the four MDV3100 metabolite compounds at a concentration of 1×10-5 mol/L. The MDV3100 compounds tested did not induce stimulation of enzyme activity. % inhibition or stimulation determined by scintillation counting, HTRF, photometry or fluorimetry. Table continued on next page 26 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.3.1 副次的薬理試験(その 7) 被験物質:M1, M2 Objective Species/Test System na Regimen/ Methodology Key Results GLP Study CTD No. (Study Number) Effect of MDV3100 metabolites MDPC1and MDPC2-freebase (M1 and M2, respectively) on various enzymes Serine/arginine-rich kinases, serine-threonine kinases and tyrosine kinases 2 In vitro 3 μmol/L M1 and M2 did not inhibit any serine/arginine-rich kinase, serine-threonine kinase or tyrosine kinase activity by > 50%. No 4.2.1.2-11 (PRO3100NC141) Effect of MDV3100 metabolites M1 and M2 on various kinases Human kinases % inhibition determined by LANCE or HTRF 2 In vitro 3×10-6 mol/L M1 and M2 did not inhibit any kinase tested by > 50%. No 4.2.1.2-12 (PRO3100NC142) 2 M2, 3.0×10-9 to 1.0×10-4 mol/L M2 inhibited binding of radioligand with IC50 of 6.2×10-6 mol/L for progesterone receptors and 7.1×10-6 mol/L for GABA-gated chloride channels No 4.2.1.2-13 (PRO3100NC154) Effect of MDV3100 metabolite M2 on PR and GABA-gated chloride channel assays Protein binding inhibition assays Table continued on next page 27 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.3.1 副次的薬理試験(その 8) 被験物質:MDV3100, M1 Objective Effect of MDV3100 on the PR Determine antagonist activity of MDV3100 on the progesterone receptors α and β Species/Test System Progesterone receptor In vitro protein interaction assay Effect of M1 on uptake of norepinephrine MDCK cells GLP Study CTD No. (Study Number) For MDV3100, an IC50 of 1.61×10-5 mol/L and Ki of 6.08×10-6 mol/L were observed. For promegestone, an IC50 of 2.70×10-8 mol/L and Ki of 1.02×10-8 mol/L were observed. No 4.2.1.2-14 (PRO3100NC130) 2 In vitro MDV3100, 0 (vehicle) to 3.00×10-5 mol/L Norgestrol, 2.05×10-13 to 1.00×10-5 mol/L MDV3100 did not activate progesterone receptors α or β. An IC50 of > 3.00×10-5 mol/L and maximum inhibition of 30.5% were observed for PR α. An IC50 of 1.35×10-5 mol/L and maximum inhibition of 68.6% were observed for PR β. Control agonist norgestrol activated PR α and PR β with EC50 of 2.26×10-9 and 1.78×10-9 mol/L, respectively. No 4.2.1.2-15 (PRO3100NC145) 2 M1, 0.3 to 100 μmol/L M1 did not inhibit norepinephrine transporter in a concentration-dependent manner; however, 48% inhibition was observed at 100 μmol/L (not significant). No 4.2.1.2-16 (PRO3100NC159) na Regimen/ Methodology 2 In vitro MDV3100, 3.0×10-7 to 3.0×10-5 mol/L Promegestone Key Results Table continued on next page 28 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.3.1 副次的薬理試験(その 9) 被験物質:M1 Objective Competitive binding of M1 to adenosine A3 receptor, CCK1 receptor and the norepinephrine transporter Species/Test System na Norepinephrine transporter: Chinese hamster ovary cells expressing recombinant human transporter Key Results GLP Study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.2-17 (PRO3100NC158) In vitro Adenosine A3 receptor: M1 3×10-8 to 1×10-4 mol/L competition with [125I]AB-MECA e Adenosine A3 receptor: human embryonic kidney cells expressing recombinant human receptor CCK1 receptor: Chinese hamster ovary cells expressing recombinant human receptor Regimen/ Methodology 2 CCK1 receptor: M1 3×10-8 to 1×10-4 mol/L competition with [125I]CCK-8s f No significant responses were noted. Norepinephrine transporter: M1 3×10-8 to 1×10-4 mol/L competition with [3H]nisoxetine Table continued on next page 29 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.3.1 副次的薬理試験(その 10) 被験物質:M1 Objective Effect of M1 on adenosine A3 and CCK1 receptors in cell based activity assays Species/Test System Adenosine A3 receptor: human embryonic kidney cells expressing recombinant human receptor CCK1 receptor: Chinese hamster ovary cells expressing recombinant human receptor na Regimen/ Methodology 2 In vitro Adenosine A3 receptor: cAMP formed in response to IB-MECA g (10 nmol/L) with M1 at 3×10-8 to 1×10-4 mol/L Key Results No significant responses were noted. GLP Study CTD No. (Study Number) No 4.2.1.2-18 (PRO3100NC160) CCK1 receptor: cAMP formed in response to CCK8s f (300 nmol/L) with M1 at 3×10-8 to 1×10-4 mol/L a:独立した試行回数,b:平均値(標準誤差)にて表記,c:2 相性(高親和性,低親和性)阻害曲線にて解析,d:クロライドチャネル以外の全ての受容体,酵素に 対する作用の検討は 4 つの MDV3100 代謝物それぞれ 2 回ずつ試行した。クロライドチャネルについては triplicate で 2 回試行した。 e:AB-MECA: N6-(4-Aminobenzyl)-9-[5-(methylcarbonyl)-β-D-ribofuranosyl]adenine, N6-(4-Aminobenzyl)-N-methylcarboxamidoadenosine,f:Sulfated cholecystokinin octapeptide, g:1-Deoxy-1-[6-[[(3-iodophenyl)methyl]amino]-9H-purin-9-yl]-N-methyl-β-D-ribofuranuronamide Akt1/PKB:プロテインキナーゼ B,AR:アンドロゲン受容体,cAMP:サイクリックアデノシン一リン酸,CCK1/8:コレシストキニン,Cl-:クロライドイオン,EC50: 50%薬効発現濃度,GABA:ガンマアミノ酪酸,GLP:医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施基準,(h):ヒトの(受容体/酵素) ,HTRF:均一系時間分解蛍光法, hERG:ヒト ether-à-go-go-関連遺伝子,IC50:50%阻害濃度,LANCE:ランタニドキレート励起法(測定法) ,LNCaP:ヒト前立腺癌細胞株,M1:MDV3100 代謝物 1 (MDPC0001/MDPC1) ,M2:MDV3100 代謝物 2(MDPC0002/MDPC2) ,M3:MDV3100 代謝物 3(MDPC0003) ,M4:MDV3100 代謝物 4(MDPC0004) ,M5:MDV3100 代謝物 5(MDV3105)M6:MDV3100 代謝物 6(MDV3106) ,MDCK:イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞株,PR:プロゲステロン受容体,RIA:ラジオイムノアッセ イ,SEM:平均値の標準誤差 30 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.4 安全性薬理試験 2.6.3.4.1 安全性薬理試験(その 1) 被験物質:MDV3100 Report Title: CTD No.: 4.2.1.3-1(参) Study No.: PRO3100NC91 Effect of MDV3100 on Cloned hERG Potassium Channels Expressed in Mammalian Cells Species/Strain: HEK293 cells Duration of Dosing: NA Initial Age: NA Duration of Postdose: NA Date of First Dose: (Experimental start) Method of Administration: In vitro Vehicle/Formulation: HB-PS + 0.3% DMSO GLP Compliance: No Special Features: Positive control: 90 nmol/L cisapride Organ Systems Evaluated Effects on the hERG potassium channel current in hERG-expressing HEK293 cells Species/ Strain HEK293 cells Method of Admin. In vitro, patch clamp Doses a (mg/kg) MDV3100, 3 to 70 μmol/L Positive Control: Cisapride, 90 nmol/L Sex and No. per Group b n=3 replicates for MDV3100 n=2 replicates for cisapride Noteworthy Findings MDV3100, μmol/L Mean (SEM) % inhibition 3 10.2 (1.9) 10 31.9 (0.8) 30 65.8 (0.9) 70 87.9 (1.6) Cisapride, 90 nmol/L; mean (SD) 87.5 (2.8) IC50, μmol/L 17.6 NR Table continued on next page 31 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.4.1 安全性薬理試験(その 2) 被験物質:M2 CTD No.: 4.2.1.3-2(参) Study No.: PRO3100NC92 Report Title: Effect of M2 on Cloned hERG Potassium Channels Expressed in Mammalian Cells Species/Strain: HEK293 cells Duration of Dosing: NA Initial Age: NA Duration of Postdose: NA Date of First Dose: (Experimental start) Method of Administration: In vitro, patch clamp Vehicle/Formulation: HB-PS + 0.3% DMSO GLP Compliance: No Special Features: Positive control: 90 nmol/L cisapride Organ Systems Evaluated Effects on the hERG potassium channel current in hERG-expressing HEK293 cells Species/ Strain Method of Admin. Doses a (mg/kg) M2, 3 to 60 μmol/L HEK293 cells In vitro, patch clamp Positive Control: Cisapride, 90 nmol/L Sex and No. per Group b n=3 replicates for MDV3100 n=2 replicates for cisapride Noteworthy Findings M2, μmol/L Mean (SEM) % inhibition 3 12.9 (1.8) 10 39.5 (0.9) 30 68.3 (1.8) 60 85.2 (0.2) Cisapride, 90 nmol/L; mean (SD) 87.0 (3.0) IC50, μmol/L 14.8 NR Table continued on next page 32 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.4.1 安全性薬理試験(その 3) 被験物質:MDV3100 CTD No.: 4.2.1.3-3 Study No.: PRO3100NC104 Report Title: Effects of MDV3100 on Cloned hERG Potassium Channels Expressed in Human Embryonic Kidney Cells Species/Strain: HEK293 cells Duration of Dosing: NA Initial Age: NA Duration of Postdose: NA Date of First Dose: (Experimental start) Method of Administration: In vitro Vehicle/Formulation: HB-PS + 0.3% DMSO GLP Compliance: Yes Special Features: Positive control: 60 nmol/L terfenadine Organ Systems Evaluated Species/ Strain Method of Admin. Doses a (mg/kg) Sex and No. per Group b Noteworthy Findings MDV3100 inhibited hERG potassium current. Effects on the hERG potassium channel current in hERG-expressing HEK293 cells HEK293 cells In vitro, patch clamp MDV3100: 3, 10, 26.1, and 60.5 μmol/L Positive control : Terfenadine 60 nmol/L n=3 cells per dose group (n = 4 cells for the MDV3100 3 µmol/L dose group) Concentration MDV3100, μmol/L Mean (SEM) % inhibition 0 (control) 0.6 (0.1) 3 12.0 (1.0) * 10 33.8 (0.3) * 26.1 65.2 (0.4) * 60.5 88.7 (1.2) * Terfenadine, 60 nmol/L; Mean (SEM) 82.8 (2.9) IC50, μmol/L 15.7 NR Table continued on next page 33 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.4.1 安全性薬理試験(その 4) 被験物質:M2 CTD No.: 4.2.1.3-4 Study No.: PRO3100NC107 Report Title: Effects of M2 on Cloned hERG Potassium Channels Expressed in Human Embryonic Kidney Cells Species/Strain: HEK293 cells Duration of Dosing: NA Initial Age: NA Duration of Postdose: NA Date of First Dose: (Experimental start) Method of Administration: In vitro Vehicle/Formulation: HB-PS + 0.3% DMSO GLP Compliance: Yes Special Features: Positive control: 60 nmol/L terfenadine Organ Systems Evaluated Species/ Strain Method of Admin. Doses a (mg/kg) Sex and No. per Group b Noteworthy Findings M2 inhibited hERG potassium current. Effects on the hERG potassium channel current in hERG-expressing HEK293 cells HEK293 cells In vitro, patch clamp Concentration, M2 (μmol/L) Mean (SEM) % inhibition M2: 3, 10, 30, and 60 μmol/L n=3 cells per dose group 0 (control) 0.6 (0.1) Positive control: terfenadine 60 nmol/L n=2 cells for terfenadine group 3 13.6 (0.8) * 10 33.7 (0.3) * 30 61.1 (1.0) * 60 79.2 (0.4) * Terfenadine, 60 nmol/L; Mean (SD) 85.5 (0.5) IC50 (μmol/L) 18.6 NR Table continued on next page 34 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.4.1 安全性薬理試験(その 5) 被験物質:MDV3100 CTD No.: 4.2.1.3-5(参) Study No.: 9785-PT-0005 Report Title: Convulsive Effects of MDV3100 in Mice Species/Strain: Mouse/Crlj:CD1 (ICR), SPF Duration of Dosing: 7 days (MDV3100: 0, 60, 200 mg/kg); single dose (MDV3100: 400 mg/kg) Initial Age: 7 weeks (at first dose) Duration of Postdose: Observations were made at 1, 2, 4, 6, 8, 10 and 24 hs postdose (repeat-dose groups); Observations were made at 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 32, 48, 56 and 72 hs postdose (single-dose groups) Date of First Dose: (repeat-dose groups); (single-dose group) Method of Administration: Oral gavage Vehicle/Formulation: GLP Compliance: No Special Features: Negative control, 0.5% MC Organ Systems Evaluated Species/ Strain Method of Admin. Doses a (mg/kg) Sex and No. per Group b MDV3100: 0, 60 or 200 mg/kg once daily for 7 days Nervous Mouse/ Crlj:CD1 (ICR), SPF MDV3100: Oral gavage 400 mg/kg, single dose 0.5% MC (negative control) (vehicle) M/10 Noteworthy Findings In the 0.5% MC, , and 60 mg/kg treatment groups, no convulsions were observed in any animals. In the 200 mg/kg group, clonic convulsions (CC) and tonic convulsions (TC) were observed in 9/10 animals within 3 days of dosing. Two animals in the 200 mg/kg group were found dead after CC early in the morning. In the 400 mg/kg single-dose treatment group, CC and TC were observed in 7/10 animals within 24 hs after dosing. One animal in the 400 mg/kg single-dose group was found dead after CC and TC, while the other 3 animals experienced no convulsions. In the 60 mg/kg group, bradypnea was observed in 3 animals. In the 200 mg/kg group, tremor was observed in 2 animals, bradypnea and hypolocomotion were observed in 9 animals, and body weight and food consumption were lower than those in the other groups from Day 1 to Day 3. In the 400 mg/kg single-dose group, tremor, bradypnea and hypolocomotion were observed in 5, 4 and 7 animals, respectively, and food consumption on Day 1 was lower than that in the negative control group (repeated administration). Table continued on next page 35 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.4.1 安全性薬理試験(その 6) 被験物質:MDV3100 CTD No.: 4.2.1.3-6 Study No.: PRO3100NC96 Report Title: Neurobehavioral Evaluation of Orally Administered MDV3100 in Rats Species/Strain: Sprague Dawley rats Duration of Dosing: Single dose Initial Age: Approximately 7 weeks Duration of Postdose: Measurements and observations were made at 2, 6 and 72 hs postdose Date of First Dose: Method of Administration: Oral gavage (Experimental start) † GLP Compliance: Yes Doses a (mg/kg) Sex and No. per Group Noteworthy Findings MDV3100: 0, 30, 100, or 200 mg/kg M/10; 0 mg/kg (2.2 mL/kg) M/10; 30 mg/kg (2.2 mL/kg) M/10; 100 mg/kg (2.2 mL/kg) M/10, 0 mg/kg (4.4 mL/kg) M/10, 200 mg/kg (4.4 mL/kg) Vehicle/Formulation: Special Features: NA Organ Systems Evaluated Nervous system Species/ Strain Sprague Dawley rats Method of Admin. Oral gavage MDV3100 did not affect neurobehavioral or clinical observations. Table continued on next page †: は のことである。以下同様。 36 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.4.1 安全性薬理試験(その 7) 被験物質:MDV3100 CTD No.: 4.2.1.3-7 Study No.: PRO3100NC95 Report Title: Respiratory Evaluation of Orally Administered MDV3100 in Male Rats Species/Strain: Sprague Dawley rats Duration of Dosing: Single dose Initial Age: Approximately 7 weeks Duration of Postdose: Measurements and observations were made at 2, 6 and 72 hs postdose Date of First Dose: Method of Administration: Oral gavage (Experimental start) Vehicle/Formulation: Special Features: Organ Systems Evaluated Respiratory system GLP Compliance: Yes NA Species/ Strain Sprague Dawley rats Method of Admin. Oral gavage Doses a (mg/kg) Sex and No. per Group Noteworthy Findings MDV3100: 0 (vehicle), 30, 100, or 200 mg/kg M/8; 0 mg/kg (2.2 mL/kg) M/8; 30 mg/kg (2.2 mL/kg) M/8; 100 mg/kg (2.2 mL/kg) M/8, 0 mg/kg (4.4 mL/kg) M/8, 200 mg/kg (4.4 mL/kg) MDV3100 did not affect clinical observations or respiratory function (respiratory rate, tidal volume and minute volume). Table continued on next page 37 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.4.1 安全性薬理試験(その 8) 被験物質:MDV3100 Report Title: Cardiovascular Safety Pharmacology Evaluation of MDV3100 Administered by Oral Gavage to Naïve Telemetry-Instrumented Conscious Male Beagle Dogs with a Toxicokinetic Arm CTD No.: 4.2.1.3-8 Study No.: PRO3100NC94 Species/Strain: Beagle dogs Duration of Dosing: Single doses every 14 days (days 1, 15, 29, 43, and 57) Initial Age: Approximately 13 months Duration of Postdose: Telemetry data were collected for 96 hs postdose Date of First Dose: Method of Administration: Oral gavage (Inlife start) Vehicle/Formulation: GLP Compliance: Yes Special Features: Organ Systems Evaluated Cardiovascular system Species/ Strain Beagle dogs Method of Admin. Oral gavage Doses a (mg/kg) MDV3100: 0, 5, 15, or 30 mg/kg Sex and No. per Group b Noteworthy Findings No test article-related changes in body weight, food consumption, body temperature, mortality, hemodynamic parameters (heart rate and body pressure) or ECG parameters (PR, RR, QRS, QT, and QTC) were observed. M/4 The Cmax values for the mid- and high-dose treatments averaged 11.5 and 8.07 μg/mL, respectively. Plasma exposure to MDV3100 was less than dose-proportionate. The high dose (30 mg/kg) was 2-times higher than the mid-dose (15 mg/kg), the mean Cmax in the high-dose group was 0.7-times of that of the low-dose group. a:特に記載がない限り単回投与,in vitro 試験については濃度を記載,b:In vitro 試験の場合,独立した試行回数を記載 *:P < 0.05,一元配置分散分析及び Dunnett の多重比較による溶媒対照群との比較 DMSO:ジメチルスルフォキサイド,ECG:心電図,GLP:医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施基準,HEK293:ヒト胎児腎臓由来細胞株, HB-PS:HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid)-緩衝生理的食塩水,hERG:ヒト ether-à-go-go-関連遺伝子,IC50:50%阻害濃度,MC:メチルセルロー ス,M2:MDV3100 代謝物 2(MDPC0002),NA:該当せず,NR:報告なし,SEM:平均値の標準誤差. 38 2.6.3 薬理試験概要表 MDV3100 2.6.3.5 薬力学的薬物相互作用試験 薬理学的薬物相互作用試験は実施しなかった。 39
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