セロデキストリンホスホリラーゼを用いた新規オリゴ糖の - 大阪府立大学

大阪府立大学
セロデキストリンホスホリラーゼを用いた
新規オリゴ糖の合成
Osaka Prefecture University
大阪府立大学大学院生命環境科学研究科応用生命科学専攻
炭谷順一/准教授、片山貴之/院生
谷修治/助教、川口剛司/教授
E-mail：[email protected]
TEL：072-254-9466 FAX：072-254-9921
■ 技術の概要
セロデキストリンホスホリラーゼはセロオリゴ糖の加リン酸分解とその逆反応を触媒する酵素
である。この逆反応を利用すればセロオリゴ糖の合成が可能となるが、最近アクセプターとし
てβ-1,4グルカン以外の糖でも伸長反応が進むことがわかってきた。さまざまな糖をプライ
マーとすることで
マ
とすることで、これまで自然界に存在しないようなオリゴ糖を合成できる可能性が期待さ
これまで自然界に存在しないようなオリゴ糖を合成できる可能性が期待さ
れる。
■ 従来技術・競合技術との比較
従来、オリゴ糖の製造は加水分解酵素による限定的な分解や転移反応を利用して製造され
てきた。本技術はホスホリラーゼを用いた合成反応であり、プライマーに対する基質特異性の
甘さを利すると
甘さを利用することでヘテロオリゴ糖の製造が可能となる。
オゴ糖製造が能となる
■ 技術の特徴
・酵素の知られていない反応特異性を利用
・反応系を改善することで生産コスト低減可能
反応系を改善することで生産コスト低減可能
・新規物質を合成することができ，その機能性が大いに期待される．
■ 想定される用途
・機能性オリゴ糖の製造
・酵素阻害剤の合成
・医薬品の製造
特許
共同研究先
出願済
無
技術段階
研究段階
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TEL：072-254-9872
FAX：072-254-9874
〒599-8570
E-mail：[email protected]
大阪府堺市中区学園町1番2号
オリゴ糖について
オリゴ糖とは‥‥
単糖類同士がグリコシド結合によって結合した化合
物の中で，３∼数十の糖から構成されるもの
オリゴ糖
原料
CBPase と CDPase の諸性質
CBPase
CDPase
分子量
92,878
111,182
酵素
フラクトオリゴ糖
ショ糖
フラクトース転移酵素
キシロオリゴ糖
キシラン
キシラナーゼ
最適温度
60˚C
60˚C
β-ガラクトシダーゼ
最適 pH
6-8
6-9
ガラクトオリゴ糖
乳糖
イソマルトオリゴ糖デンプン
アミラーゼ
温度安定性
60˚C
60˚C
ニゲロオリゴ糖
α-グルコシダーゼ
pH 安定性
3 - 10
3 - 11
デンプン
CBPase, CDPase とも安定性に優れている！
オリゴ糖の生理作用
甘味料，う蝕予防，整腸作用，ビフィズス増殖因子，
免疫賦活作用，アレルギー抑制効果，
No.1
No.1
細菌・ウイルス接着阻害
No.3
No.3
CBPase と CDPase によるセロオリゴ糖の代謝
CBPase（セロビオースホスホリラーゼ）
Glucose-1-P
Pi
CH 2OH
O
CH 2OH
O
OH
CH OH
2
O
O
OH
HO
OH
OH
HO
OH
OH
OH
Glucose
OH
Cellobiose
CBPase
CDPase（セロデキストリンホスホリラーゼ）
Glucose-1-P
CH 2OH
O
OH
CH OH
2
O
O
O
OH
OH
CH 2OH
O
OH
OH
HO
OH
Pi
CH 2OH
O
O
CH 2OH
O
O
OH
HO
OH
n-1
CH OH
2
O
OH
OH
OH
Celloligosaccharide (n+1)mer
CDPase
β-アミラーゼ
Glc-DNJ
α-アミラーゼ
OH
HO
OH
1-Deoxynojirimycin
(DNJ)
G3 生成アミラーゼ
α-アミラーゼ
CH 2OH
O
Glc-Glc-Glc-DNJ G4 生成アミラーゼ
Glc-Glc-Glc-Glc-DNJ G5 生成アミラーゼ
Glc-Glc-Glc-Glc-Glc-DNJ G6 生成アミラーゼ
No.2
No.2
CH OH
2
NH
阻害される酵素
トレハラーゼ,
DNJ グルコアミラーゼ,
α-, β-グルコシダーゼ
Glc-Glc-DNJ
OH
OH
n
Celloligosaccharide (n+2)mer
Deoxynojirimycin (DNJ) の阻害作用
DNJ 誘導体（α-1,4）
OH
OH
HO
OH
OH
Glucose (Glc)
DNJ 誘導体阻害剤の標的酵素は生成糖の重合度に対応する
No.4
No.4
CDPase を用いた DNJ 誘導体 (β-1,4) の合成
Glucose-1-P
CH 2OH
O
OH
O
CH 2OH
O
OH
CH OH
2
O
OH
HO
O
CH 2OH
NH
O
OH
HO
OH
DNJ 誘導体の各種酵素に対する阻害
Pi
CH OH
2
NH
OH
OH
n
4-O-β-D-glucopyranosyl-DNJ
OH
n
OH
Ki (M)
Inhibitors
Aspergillus aculeatus β-1,4-glucanase 1
G2(β-1,4)DNJ
6.9 × 10-6
G3(β-1,4)DNJ
1.9 × 10-7
G4(β-1,4)DNJ
3.8 × 10-8
G5(β-1,4)DNJ
2.8 × 10-7
G6(β-1,4)DNJ
3.3 × 10-7
OH
4-O-β-D-cellooligosyl-DNJ
CDPase
Condition for Synthesis of Cellulase Inhibitors.
20 mM G1(β-1,4)DNJ
80 mM Glucose-1-phosphate
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
1 mM EDTA
10 mM DTT
40 units/ml CDP
Temperature
50˚C
Reaction volume
5.0 ml
G1(β-1,4)DNJ
G2(β-1,4)DNJ
G3(β-1,4)DNJ
G4(β-1,4)DNJ
Yield of Purified Inhibitors Synthesized
by the Reverse Reaction of CDP Phosphorolysis
Inhibitor
G2(β-1,4)DNJ
G3(β-1,4)DNJ
G4(β-1,4)DNJ
G5(β-1,4)DNJ
G6(β-1,4)DNJ
Total
Yield
(mg) (mol%)
10
10.3
9
7.2
11
5.6
18
9.3
38
16.8
49.2
G5(β-1,4)DNJ
G6(β-1,4)DNJ
0
2
4
6
Trichoderma viride β-1,3-glucanase
G1(β-1,3)DNJ
3.8 × 10-5
Aspergillus sp. endo-β-1.6-glucanase
G1(β-1,6)DNJ
9.3 × 10-5
8
Reaction time (hr)
Thin-layer Chromatogram of Cellulase Inhibitors
Synthesized by the Reverse Reaction of CDP.
No.6
No.6
No.5
No.5
CDPase のアクセプター候補
今後の課題
1. 合成されたオリゴ糖の構造決定
2. 反応系の最適化
3. コスト削減のための G1P 生産共役系の検討
4. ランダム変異導入による CDPase 特異性の変換
5. CBPase を用いた新規二糖類の合成
6. 他の糖をドナーとする，または結合特異性の異なる
新規ホスホリラーゼ類の探索 No.9
No.9
No.7
No.7
CDPase を用いた新規オリゴ糖の合成
CH 2OH
O
O
O
OH
OH
HO
OH
キシロース
OH
1-β-D-glucopyranosyl 4-α-L-arabinopyranose
ガラクトース
アラビノース
OH
マンノース
CH 2OH
O
マルトース
O
OH
Glc
Mal
G1P
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
OH
HO
1
1 :: アラビノース
アラビノース
2
2 :: ガラクトース
ガラクトース
3
3 :: キシロース
キシロース
4
4 :: マンノース
マンノース
5
5 :: フルクトース
フルクトース
6
6 :: マンニトール
マンニトール
7
7 :: キシリトール
キシリトール
8
8 :: ソルビトール
ソルビトール
9
9 :: マルトース
マルトース
10
10 :: ラクトース
ラクトース
11
11 :: スクロース
スクロース
OH
OH
OH
1-β-D-glucopyranosyl 4-α-D-garactopyranose
CH 2OH
O
OH
O
O
OH
HO
OH
OH
OH
1-β-D-glucopyranosyl 4-α-D-xylopyranose
CH 2OH
O
OH
CH 2OH
O
O
OH
OH
HO
OH
OH
1-β-D-glucopyranosyl 4-α-D-mannopyranose
CH 2OH
O
OH
新規オリゴ糖の合成に成功？
CH OH
2
O
CH OH
2
O
O
OH
O
HO
OH
CH 2OH
O
OH
OH
OH
OH
1-β-D-cellobiopyranosyl 4-α-D-garactopyranose
No.8
No.8

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