Application Note FFPE DNA LIBRARY PREPARATION PreCR Repair Mix を用いた FFPE DNA サンプルの 次世代シーケンシング解析 FFPE DNA サンプル DNA DNA 断片化 修復 ライブラリー 調製 NGS 解析 NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina PreCR Repair Mix NEBNext dsDNA Fragmentase プロトコール Fragmentation analysis FFPE DNA サンプルの断片化を解析 1. FFPE から抽出した DNA の断片化状態を Agilent Bioanalyzer® 等で解析 2. DNA 断片のサイズが比較的大きく、断片化が進行していない場合は、最適な DNA サイズ（200 bp 程度）に断片化してから PreCR 反応 を行う、断片化は NEBNext dsDNA Fragmentase や物理的な方法で行うことが可能 3. DNA 断片のサイズが 200 bp 程度であり、断片化が進行している場合は、断片化処理を行わずにサンプルの PreCR 反応を行う PreCR step PreCR による DNA 修復 1. PreCR 反応をセットアップ 試薬 PreCR Repair Mix End Repair Reaction Buffer（10X） （from NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina） FFPE DNA（5 ng - 1 µg, more is better） NAD+ 容量 1 µl 6.5 µl 54 µl 0.5 µl 2. 20 ℃ で 15 分インキュベート メモ：PreCR 処理後の精製は不要、反応液をそのまま End Prep step に使用 End Prep step End Prep 酵素ミックスによる末端処理 1. End Prep 反応（末端修復と dA テーリング反応）をセットアップ 試薬 PreCR repair reaction End Prep Enzyme Mix （from NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina） 容量 62 µl 3 µl 2. 20 ℃ で 30 分インキュベート、さらに 65 ℃ で 30 分インキュベート（反応液は 4 ℃ で保存可能） 3. NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina キットのプロトコールに従って、アダプターオリゴ・ライゲーション、 PCR を行いライブラリー調製を行う （アダプターオリゴはキットとは別に購入が必要） ILLUMINA® is a registered trademark of Illumina, Inc. BIOANALYZER® is a registered trademark of Agilent Technologies. Inc. FFPE DNA ライブラリー調整試薬 FFPE 由来 DNA サンプル DNA 断片化 DNA 断片化酵素 • 酵素反応により DNA をランダムに断片化 • 高価な機器等は一切不要、安価に DNA を断片化 製品名 NEBNext dsDNA Fragmentase 製品番号 容量 希望小売価格 M0348S M0348L 50 reactions 250 reactions ¥13,500 ¥54,000 製品番号 容量 希望小売価格 M0309S M0309L 30 reactions 150 reactions ¥27,000 ¥108,000 備考 DNA 断片化酵素 DNA 修復 PreCR DNA 修復酵素ミックス • 様々な DNA の損傷を修復する酵素ミックス • FFPE 由来やその他の DNA 損傷を修復 製品名 PreCR Repair Mix 備考 DNA 修復酵素ミックス ライブラリー調製 NEBNext Ultra DNA ライブラリー調製キット • 簡単・迅速：わずか 3 時間のプロトコール • 高感度：5 ng の DNA からライブラリー調製 • ChIP-Seq にも対応 製品名 製品番号 容量 希望小売価格 NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina E7370S E7370L 24 reactions 96 reactions ¥97,300 ¥311,500 製品番号 容量 希望小売価格 E7350S E7350L E7335S E7335L E7500S E7500L 12 reactions 60 reactions 24 reactions 96 reactions 24 reactions 96 reactions E7600S 96 reactions E7535S 24 reactions E7535L 96 reactions 備考 DNA / ChIP ライブラリー調製キット アダプターオリゴ • 最大 96 プレックス解析が可能 • シングル・ペアエンド解析対応 製品名 NEBNext Singleplex Oligos for Illumina NEBNext Multiplex Oligos for Illumina （Index Primers Set 1） NEBNext Multiplex Oligos for Illumina （Index Primers Set 2） NEBNext Multiplex Oligos for Illumina （Dual Index Primers Set 1） NEBNext Multiplex Oligos for Illumina （Methylated Adaptor, Index Primers Set 1） 備考 シングルプレックス解析用 アダプターオリゴ マルチプレックス・アダプターオリゴ 最大 12 プレックス解析 お問合せ マルチプレックス・アダプターオリゴ 最大 12 プレックス解析 デュアルインデックス・アダプターオリゴ 最大 96 プレックス解析 バイサルファイト解析用メチル化 アダプターオリゴ 最大 12 プレックス解析 * NEBNext ライブラリー調製試薬をご使用の方にアダプターオリゴを提供しています。 NGS 解析 詳細は弊社テクニカルサポートにお問い合わせ下さい。 ご質問は弊社テクニカルサポート（Tel：0120-963-650、E-mail：[email protected]）までお問い合わせください。 ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社 〒１ ３０-００２２ 東京都墨田区江東橋２-２-３倉持ビル第２ カスタマーサービス 電話：03-5669-6193 FAX：03-5669-6194 テクニカルサポート 電話：0120-963-650 FAX：03-5669-6194 Email: [email protected] Web-site: www.nebj.jp
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![平成 27 年 5 月 14 日 [神戸大学大学院農学研究科] 李智博准教授が](http://s1.expydoc.com/store/data/006070707_1-3e6fd1585bf925076db6363e411c729d-250x500.png)
