イルミナNGSでロングリードを可能にする TruSeq Synthetic Long-Readライブラリー調製キット： ワークフローのご紹介および注意点 November 28, 2014 崎川 真里 イルミナ株式会社 テクニカルアプリケーション サイエンティスト © 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cBot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iSelect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners. 1 本日のOutline はじめに プロトコール Best Practiceとトラブルシューティング HiSeqのランのセットアップとBaseSpaceでの解析 2 はじめに TruSeq Synthetic Long Read のご紹介 1つのキットで複数のアプリケーションに対応 • Long Reads 複数のアプリケーションをサポート （ゲノムフィニッシング、メタゲノミクス、de novo アセンブリ、 ロングリードやショートリードでのメタアセンブリ）. • HiSeqシステムによる、クオリティの高い10Kbのリード • ショートリードをロングリードへと高精度にアセンブルする • Phasing 3 • 多型を見る異なる手法；相同染色体の固有のハプロタイプコンテ ンツを調べる ヘテロザイガスSNP とインデルの94%以上を1回のアッセイで フェージング 試薬キットの内容 Library Prep kit + Barcoding kit TruSeq SYNTH Long-Reads DNA Library Prep Kit (4 samples) FC-126-1001 出荷 は 室温 保管 は 2-8℃ 出荷/保管 -25℃ ~ -15℃ TruSeq SYNTH Long-Reads Barcode Kit (1 samples) - FC-126-1002 or (4 samples) - FC-126-1003 出荷 は 室温 保管 は 2-8℃ 出荷/保管 室温 出荷/保管 -25℃ ~ -15℃ 4 アッセイのワークフロー 3日間のワークフロー 5 プロトコール Best Practicesとトラブルシューティング 6 TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー Part 1- 8-10kbの断片を得る ゲノムDNAを断片化した後、末端修復、アダプター付加を経て 約8-10kbのサイズのDNA分子を回収する。 Part 2 - Long range PCR 約8-10kbのDNA分子を希釈して384ウェルに分注し、各ウェル で少数分子由来のDNA分子を増幅する。 Part 3 –短いDNAライブラリーの作製 Long range PCR産物を利用する。各ウェル固有のインデック ス配列をもち、かつシーケンスに必要なアダプター配列をもつ ライブラリーを作成する。最終的に384ウェル分をプールし、 精製・サイズ選択を行う。 HiSeqでシーケンスを行う 7 TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー Part 1- 8-10kbの断片を得る ゲノムDNAを断片化した後、末端修復、アダプター付加を経て 約8-10kbのサイズのDNA分子を回収する。 8 Part 1- 8-10kbの断片を得る input DNAの品質チェック 8-10kbに断片化 Long range PCR 100~500ngのゲノムDNAを1kbのラダーと共に 0.8%アガロースゲルで泳動する。 Best Practices Input DNAは濃度10ng/ulの状態で50ul用意（total 500ng） フェノールのコンタミがなく、40kb以上のサイズが残ったDNAを使用 9 ライブラリ作成 Part 1- 8-10kbの断片を得る DNAの断片化 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 gDNA 8-10 kbのgDNA g-TUBE™ （引用 http://covarisinc.com/products/g-tube/） Best Practices 弊社ユーザーガイドに記載の設定で遠心を行う 10 Part 1- 8-10kbの断片を得る 8-10kbに断片化 Long range PCR 平滑末端化、3’末端へのA付加、アダプター付加 ライブラリ作成 末端修復 －断片化によって生じた突出末端をEnd Repair Mixで平滑化する 3’末端へのA付加 －平滑化したDNAの3’末端にアデニンを付加する アダプター付加 －Long Range PCRの工程で鋳型増幅に必要なアダプター （11bpのエンドマーカーを含む）を、DNAの両末端に付加する。 Best Practices 使用するバッファーはよく溶かし混合する 特に指定の無い限り、反応は氷上で行う プロトコールに記載の反応時間と温度を守る サンプル精製はkitに付属のSample Purification Beadsを使用する 8-10kbのgDNA 11 エンドマーカーを含むアダプター Part 1- 8-10kbの断片を得る 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 ゲル電気泳動でサイズ選択 8-10kbの断片を選択的に回収する ゲルでのサイズ選択 ・E-Gel SYBR Safe gels 0.8% agarose “for NGS” & QIAQuick Gel Extraction Kit ・Blue Pippen E-Gel CloneWell 0.8% SYBR Safe gelを用いてサイズ選択を行う。 泳動が終了したゲルは、E-Gel OpenerまたはGel Knifeで開封する 泳動像をトランスイルミネーターで可視化し、X-tracta Gel Extraction Toolで目的 のサイズのDNAを切り抜く 切り抜いたゲルから、QIAquick Gel Extraction KitでDNAを抽出する Qubit dsDNA HS Assay kitで定量および、Bioanalyzer High Sensitivity chipでサイズ 分布を確認する。 12 Part 1- 8-10kbの断片を得る 8-10kbに断片化 Option1: E-Gelを使用したサイズ選択 Long range PCR ライブラリ作成 開封前のプラスチックケース表面・裏面に 線を描く サンプルレーン（レーン2） (A) レーン左端に縦線を引く (B) レーン右端に縦線を引く ラダーレーン（レーン4） (C) 10kbのバンドと水平に横線を引く (D) 8kbのバンドと水平に横線を引く Best Practices E-Gelカセットは室温で保存する（4℃保存はしない） 消費期限切れのE-Gelは使用しない、泳動時間はプロトコール通りに行う DNAの損傷を避けるため、その他の泳動装置や染色剤は利用を避ける 13 Part 1- 8-10kbの断片を得る 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 サンプルの定量とサイズ分布の確認 Qubit dsDNA HS Assay 期待値: > 0.05 ng/ul Bioanalyzer High Sensitivity DNA Chip (Optional) 8 kb 10kbのUpper markerと重複する位置にサイズのピークが現れる Troubleshooting 6 kb 14 小さいサイズに肩がある → 適正にサイズ選択を できていないことが原因 Part 1- 8-10kbの断片を得る qPCRでの定量 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 Long Range PCRで適切なDNA量を使用する為に正確な濃度を知る SYBR Green stock を用意する ・10,000X ストックをDMSOで100Xに希釈する ・Nanodropを使用する（Ideal Abs494±3 nm is 0.5 – 0.6） Long qPCR用にはキットに付属のスタンダードDNA (QST)を使用 オーバーナイトで実施（反応時間は7.5時間以上） 94°Cで1分間、続けて以下の反応を 40サイクル: ・94°Cで30秒間 ・65°Cで30秒間 ・68°Cで 10分間 Best Practices SYBR Green 100X の濃度は正確に計算する 15 Part 1- 8-10kbの断片を得る qPCRでの定量 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 各qPCR装置を使用する（384ウェル対応である必要はない） 検量線を使用して定量する場合 手動で検量線を作成し、近似式に Cq値を代入して濃度を計算する 16 TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー Part 1- 8-10kbの断片を得る ゲノムDNAを断片化した後、末端修復、アダプター付加を経て 約8-10kbのサイズのDNA分子を回収する。 Part 2 - Long range PCR 約8-10kbのDNA分子を希釈して384ウェルに分注し、各ウェル で少数分子由来のDNA分子を増幅する。 17 8-10kbに断片化 Part 2 - Long range PCR Long range PCRとクオリティチェック Long range PCR ライブラリ作成 ライブラリー調製用のプレートとQC用のプレートを用意 384 rxn 5 ul MM per well Workflow Long Reads Phasing DNA Seeding Concentration 3 fg per well Number of Cycles 21 cycles 75 fg per well 15 cycles One QC rxn 50 ul MM Best Practices • Long Read と Phasing でLong range PCRの条件が異なる • ウェルへのDNAのアプライ量が上記と異なると、PCRでの増幅が適正に行われないので注意 →タグメンテーションによる断片化が適正に行われない可能性がある • ユーザーガイドに記載の384 wellプレートを使用すること 18 8-10kbに断片化 Part 2 - Long range PCR Long range PCRとクオリティチェック ライブラリ作成 Long range PCR E-Gel Ex 1%を使用し、Long range PCRのQCを行う E-Gel EX 1% 384-well plate 20 ul QC用に、ランダムに4ウェルを 選び、各ウェルから5uL回収し て混合する(Pooled sample) QC sample in 96 well plate 1 2 3 4 Best practice • • 角や端のサンプルは避ける 回収したウェルを記録しておく スタンダード （GTS） Lane 6: Pooled sample Lane 7: QC sample 19 8-10kbに断片化 Part 2 - Long range PCR Long range PCRとクオリティチェック Long range PCR ライブラリ作成 プールしたサンプル、 QC用のサンプル、スタンダード（GST 1～4 ） の各バンドは同じ大きさにバンドが出る – 10kbのマーカー位置にシングルバンドが見える サンプルのバンドの濃さは、スタンダード（ GST1 ～4）の範囲に入る 範囲外の場合は – 8-10kbに断片化したgDNAのインプット量が正しくない可能性がある – qPCRでの定量とLong range PCRを再度実施する 希釈した GST 1 20 2 3 4 Lane 6: Pooled sample Lane 7: QC Sample TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー Part 1- 8-10kbの断片を得る ゲノムDNAを断片化した後、末端修復、アダプター付加を経て 約8-10kbのサイズのDNA分子を回収する。 Part 2 - Long range PCR 約8-10kbのDNA分子を希釈して384ウェルに分注し、各ウェル で少数分子由来のDNA分子を増幅する。 Part 3 –短いDNAライブラリーの作製 Long range PCR産物を利用する。各ウェル固有のインデック ス配列をもち、かつシーケンスに必要なアダプター配列をもつ ライブラリーを作成する。最終的に384ウェル分をプールし、 精製・サイズ選択を行う。 21 Part 3 – 短いDNAライブラリーの作製 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 酵素反応を利用した断片化 8 - 10 kb のDNA トランスポゾン Tagmentation: FPM+TDE Delivery FRP 断片化 Sample Plate (LAP) FRPプレートをPCRプレート(LAPプレート)の上に重ねて操作を行う。 TDEマスターミックスを作製し、FPRプレート各ウェルに3ul分注する －電動マルチチャンネルピペットを推奨 －3ulの分注ができるマルチチャンネルピペットでも対応可だが、操作中に溶液が蒸発する恐れがある。 酵素プレートを重ねたまま遠心する（プレート遠心機が必要） 22 Part 3 – 短いDNAライブラリーの作製 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 酵素反応による断片化 FPRプレートには穴が開いているので、 遠心すると各ウェルに分注した酵素ミックスが 穴から下（LAPプレート）に落ちる。 →遠心することで全ウェルを同時に分注 Best Practices 型番指定の384ウェルプレートを使用する プロトコールの酵素反応条件に従う（DNAの断片サイズに影響） サーマルサイクラ―の温度を正しく設定し、断片化の効率を一定にする 23 Part 3 – 短いDNAライブラリーの作製 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 各ウェル固有のインデックスプライマーでPCR Indexing PCR: 384ウェル固有のインデックスをつける Alignment Ring IDP (Optional) インデックス配列を含むプライマー を使用しPCRを実施 Sample Plate (LAP) p7 Index 1 Read 2 Sequencing Primer Index 2 Read 1 Sequencing Primer p7 IndexRd2 1 SP Rd1 SP Index 2 p5 シーケンス可能なライブラリー IDPプレートには予めインデックスプライマーが充填されている タグメント化後のDNAをPCRで増幅し、クラスター形成に必要な配列（P5, P7配列） および、各ウェル固有のインデックス配列を付加する 24 p5 Part 3 – 短いDNAライブラリーの作製 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 各ウェル固有のインデックスプライマーでPCR Alignment Ring（Accessory kit） はプレートの位置ずれを防止する 目的で利用する。オプション品な ので必須ではない。 型番指定の384ウェルプレートを使用すること - 指定品以外はうまく重ならず適切に処理できない Best Practices インデックスを正確な位置に移すため、indexing plate (IDP) をしっかりセットする インデックスを移した後は、IDPのウェルが空であることを確認する 25 Part 3 – 短いDNAライブラリーの作製 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 サンプルプーリングと濃縮 底に回収される サンプル溶液をCollection Plateに回収する 型番指定の384ウェルプレートを使用すること －指定品以外はうまく重ならず適切に処理できない原因となる Zymoカラムにサンプル溶液を通し、インデックス が付加したライブラリーを濃縮する バキュームマニフォールドの使用を強く推奨する 26 Part 3 – 短いDNAライブラリーの作製 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 磁気ビーズを用いたサイズ選択 磁気ビーズを用いたサイズ選択 －マグネットスタンドを使用 －精製時はチューブまたは、プレートどちらを用いても可能 Best Practices 使用前に新しいエタノールを調製する SPB は室温に戻し、ビーズをボルテックスでよく撹拌して から使用する プロトコール通りに操作を行う －ビーズの乾燥時間は37℃または、5分以上行わない －ビーズの量は変更しない ピペットチップの側面にビーズが付いていないことを確認する 最終的に回収するサンプル中にビーズが残らないよう行う 27 Part 3 – 短いDNAライブラリーの作製 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 ライブラリーの定量と定性チェック 1. 定量はqPCRを利用する • KAPA Library Quantification Kit（日本ジェネティクス社）を使用 （http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4332） アダプター配列をもち、クラスター形成可能なライブラリーのみを定量する 2. Bioanalyzerでライブラリーのサイズを確認する • High Sensitivity DNA Chipを使用 最終的なライブラリー KAPAキット付属のサイズスタンダードと、実際のライブラリーサイズは大きく異なる →ライブラリーのサイズ分布をBioanalyzerで確認し、定量値の補正に利用する 28 Part 3 – 短いDNAライブラリーの作製 8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成 ライブラリーの定量と定性チェック サイズ選択 前 サイズ選択 後 赤: Long Reads 青: Phasing Troubleshooting サイズ分布が期待値の範囲外の場合（タグメント不良） 期待される範囲: 200 – 2000bp 29 酵素量とサンプルの比率がタグメント化反応で重要なポイント → 384ウェルプレートへのサンプル投入量が原因 （Long range PCR前に各ウェルに規定量を投入しているか確認） TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー Part 1- 8-10kbの断片を得る ゲノムDNAを断片化した後、末端修復、アダプター付加を経て 約8-10kbのサイズのDNA分子を回収する。 Part 2 - Long range PCR 約8-10kbのDNA分子を希釈して384ウェルに分注し、各ウェル で少数分子由来のDNA分子を増幅する。 Part 3 –短いDNAライブラリーの作製 Long range PCR産物を利用する。各ウェル固有のインデック ス配列をもち、かつシーケンスに必要なアダプター配列をもつ ライブラリーを作成する。最終的に384ウェル分をプールし、 精製・サイズ選択を行う。 HiSeqでシーケンスを行う 30 HiSeqのランのセットアップと BaseSpaceでの解析 31 サンプルシートの作成 シーケンス結果をBase Space上で解析 するために、ラン前にはIEMでサンプル シートの作成が必須 IEM 1.8を使用する ワークフローと各設定 HiSeq - FASTQ Only TruSeq Synthetic Long-Read DNA I7_index_ID = TSSLRv1 → 各ウェル固有のindexは選択しない 32 HiSeq Control Software(HCS) でランのセットアップ 33 シーケンスの設定と用意するプライマー 各ライブラリーは、下記の通りレーンを使用する v3/v4 Flow cell の場合、フローセルの1レーン Rapid flow cellの場合は、フローセル1枚（2レーン分使用） 推奨の Cluster/SBS 試薬キット Dual Indexing primer box Sequencing Recipe ライブラリーの最終濃度 (based on qPCR) TruSeq Cluster and SBS Kit v3 必要 HP11 + HP12 100 + 8 (Index 1) + 100 12pM 101 + 8 (Index 1) + 101 TruSeq Cluster and SBS Kit v4 不要 TruSeq Rapid Cluster and SBS kit 不要 or 16-18pM 126+ 8 (Index 1) + 126 101 + 8 (Index 1) + 101 8pM 参考資料: TruSeq Synth Long-Read DNA Library Prep Sequencing Insert.pdf http://support.illumina.com/content/dam/illuminasupport/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_truseq/truseqsynthlongreaddna/truseq-synthlong-read-dna-library-prep-sequencing-insert-15047266-a.pdf 解析のため、ラン開始と同時にBase Space上へのデータの転送が必須 34 BaseSpaceでの解析 独自に開発した解析手法 35 TruSeq Long Reads Assembly App 解析サマリーページ リードのヒストグラム 出力ファイル – Long Read FASTQ (>1.5kb) – FASTQ (0.5-1.5kb) – Library Characteristics (.csv) ウェルごとのメトリクスの詳細 – LongRead Summary report (.pdf) 36 TruSeq Phasing Analysis App 解析サマリーページ ヒストグラム 出力ファイル (~500 Mb) – – – – – 37 Phased.vcf.gz Unphased.vcf.gz Stats.xml Library Characteristics (.csv) PhasingSummary report (.pdf) TruSeq Synthetic Long ReadのPublic Data Base Spaceで公開 38 資料/サポートツールのご紹介 Datasheets: http://products.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/documents/products/datasheets/datasheet-truseq-synthetic-kitphasing.pdf http://products.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/documents/products/datasheets/datasheet-truseq-synthetic-kitassembly.pdf http://www.illuminakk.co.jp/documents/pdf/datasheet_long_read_dna_assembly. pdf （日本語版データシート） User guide http://support.illumina.com/downloads/truseq-synth-long-read-dna-library-prepguide-15047264.html Online Trainings: http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq-synth-long-readdna-library-prep-kit/training.html http://www.illuminakk.co.jp/landing/truseq_synthetic_long_read.ilmn 39 Questions? 40
© Copyright 2024 ExpyDoc
