Title ノックアウトマウスを用いたDrs誘導アポトーシスと発癌抑制機構の

Title
Author(s)
ノックアウトマウスを用いたDrs誘導アポトーシスと発癌
抑制機構の解析
井上, 寛一
Citation
Issue Date
2007-06
URL
http://hdl.handle.net/10422/6419
Type
研究報告書
Rights
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版社（学協会）などが有します。
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権法に規定されている私的使用や引用などの範囲内で行ってください。
Shiga University of Medical Science
ノックアウトマウスを用いた
Drs誘導アボ卜ーシスと発癌抑制機構の解析
課題番号
17590341
平成， 7年度平成， 8年度
科学研究費補助金(基盤研究 (
C
))
研究成果報告書
平成， 9年 6月
研究代表者井上寛一
滋賀医科大学
医学部助教授
1
1
1
1
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1
1
1
我々は細胞癌化の分子機構を明かにするために、癌の発生に関わっている新しい癌抑制
遺伝子をクローニングし、その機能解析をおこなっている。現在までに癌化形質抑制活性
を指標にした発現クローニング法やcDNAサブトラクション法などを用いて D
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解析を行っているのがS
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sである。 D
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sは大腸癌、肺癌、前立腺癌、 ATLリンパ腫など種々の
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ヒト癌細胞株や悪性癌組織でその mRNA
発現が消失している。また、これらヒ卜癌細胞
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遺伝子を導入し発現させるとその悪性化形質が抑制されることから、 D
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癌の発生に癌抑制遺伝子として重要な働きをしていると考えられる。 D
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てアポトーシス制御因子ASY
する新規の経路で種々のヒト癌細胞株にアポトーシスを誘導することも明らかにしてき
た。さらに、我々が作製に成功した D
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sノックアウト (KO)マウスではその約 30%にリンパ
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くOマウスおよび D
rsKO
細胞
腫、肺癌，肝癌などの悪性腫蕩が発生した。本研究では D
を用いて、アポトーシス制御なと、の D
r
sの生理機能と発癌抑制との関連を明らかにする。
研究組織
研究代表者: 井上寛一
(滋賀医科大学医学部助教授)
交付決定額(配分額)
(金額単位:円)
直接経費
平成 17年度
乙000，
000
平成 18年度
1，
600，
000
総計
3，
600，
000
。
。
。
間接経費
合計
2，
000，
000
1，
600，
000
3，
600，
000
研究発表
(
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2006
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475-483，
2007
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2007.
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1481-1485，
2007.
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(
2
)口頭発表
1
.金哲勝、犠野高敬、旦部幸博、岡田裕作、井上寛一
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第 64回日本癌学会総会
2005年
2
.犠野高敬、旦部幸博、井上貫一
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cによるトランスフォーメーションにおける mTOR
経路の関与の解析」
第 64回日本癌学会総会
2005年
3
.茶野徳宏、犠野高敬、井上貫一、阿部英俊
rRB1CC1とh5NF5の介在がもたらす RB1経路への影響と抗腫蕩効果」
第 64回日本癌学会総会ワークショップ
2005年
4
..e.部幸博、向所賢一、茶野徳宏、犠野高敬、九嶋亮治、服部隆則、井上寛一
アポトーシス誘導能を持つ癌抑制遺伝子 D
rsによる腫蕩抑制効果の解析
第 64回日本癌学会総会ワークショップ
2005年
5
.旦部幸博、向所賢一、茶野徳宏、犠野高敬、九嶋亮治、服部隆則、井上寛一
r
D
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sによるアポトーシス誘導と腫蕩抑制 J
第 28回日本分子生物学会年会 2005年
6
.議野高敬、金哲将、 E部幸博、井上寛一
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遺伝子による癌の浸潤・転移抑制機構の解析 j
第 28回日本分子生物学会年会 2005年
7
.南佳ほり、川上亨弘、茶野徳宏、井上寛一、寺下隆夫、岡部英俊、岡田裕作、岡本圭
生
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第 14
番染色体長腕上の刷り込み遺伝子 DLK1はヒト賢細胞癌の癌抑制遺伝子である J
第 28回日本分子生物学会年会 2005年
8
.茶野徳宏、佐治雅史、南佳ほり、井上寛一、岡部英俊
rRB1CC1:
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B
1，
mTOR両経路への貢献と細胞増殖、サイズの調整、そして、その生理的
意義J
第 28回日本分子生物学会年会ワークショップ 2005年
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.茶野徳宏、犠野高敬、井上寛一、阿部英俊
rRB1CC1はhSNF5/INI1と介在し、 p53を安定化させることによって抗腫蕩効果を発揮
する J
第 65回日本癌学会総会ワークショップ
2006年
1
4
. 旦部幸博、犠野高敬、茶野徳宏、井上寛一
r
sによるオートファジー制御」
「癌抑制遺伝子d
第 65回日本癌学会総会ワークショップ
2006年
1
5
.金哲勝、犠野高敬、茶野徳宏、旦部幸博、岡田裕作、井上貰r
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sと悪性化および浸潤・転移との関連」
第 65回日本癌学会総会
2006年
1
6
.井上寛一
経路抑制を介したウイルス増殖抑制機構」
「ストレス応答遺伝子GADD34から mTOR
第 54回日本ウイルス学会学術集会
2006年
1
7
.南佳ほり、 E部幸博、渡部亮介、犠野高敬、磯辺健一、茶野徳宏、井上寛f
ストレス応答遺伝子GADD34から mTOR
経路を介したウイルス増殖抑制機構J
日本分子生物学会2006フォーラム
2006年
1
8
.青木健、議野高敬、旦部幸博、井上寛一
r
v
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r
cによるトランスフォーメーションにおける mTOR
経路の役割と mTOR
経路と MAPI
く
経路のクロストーク」
日本分子生物学会2006フォーラム
2006年
(
3
)出版物
井上寛一: r
腫蕩ウイルスによる癌化に関する変異株」生物薬科学実験講座 6、細胞の
増殖と成長因子、 1
1培養細胞の利用
p533-543，広川書庖(共著) 2005年
研究成果
[要約]
DrsKOマウス、およびDrsKO
細胞を用いて、アポトーシスやオートファジー制御など
のDrsの生理機能と発癌抑制との関連を解析し、以下のことを明らかにした。
1
.DrsKOマウスに生じた肺癌から樹立した癌細胞株LC-T1にレトロウイルスベクターに
よって Drsを再導入すると、ヌードマウスでの造腫蕩能が顕著に抑制され、この腫蕩組織
ではcaspase-3，
9の活性化を伴うアポトーシスが完進していた。また、 Drs導入 LC-T1
細胞を低血清条件下で培養すると caspase-12，
-9，
3の活性化を伴うアポトーシスが誘
導された。
2
.DrsKO胎児繊維芽 (MEF)
細胞と w
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dtype(WT)MEF
細胞に SV40-LargeTやv
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と
、
のウイルス癌遺伝子を導入したところ、 DrsKOMEF細胞はWTMEF細胞に比べて癌遺伝
子による細胞癌化に高い感受性を示した。
3
.DrsKOMEF
細胞では低血清条件下で誘導されるオートファジーがWTMEF細胞に比べ
て顕著に抑制された。また、この抑制は Drs遺伝子を DrsKO細胞にウイルスベクターに
よって再導入することによって解除された。 DrsKO細胞におけるオートファジー抑制の
作用点は autophagosomeから autolysosomef
こ移行する後期成熟過程であった。また、
Drsはオートファジー後期進行に関わると考えられている Rab24
分子と相互作用し、オー
トファジー誘導時に、共局在化した。
4
. Drsに結合する分子としてストレス応答蛋白 GADD34を新たに同定した。 GADD34は
経路を抑制することを見出し
癌抑制蛋白 TSCと相互作用し、蛋自合成制御に関わる mTOR
た
。
S.DrsKOおよび GADD34KOMEF
細胞ではVSV
感染によるウイルス増殖の顕著な冗進が
認められた。またGADD34KO細胞ではグルコース飢餓条件下でアポトーシスが誘導さ
れ、このアポ卜ーシスはラパマイシンによって阻害された。
これらの結果から Drsがアポトーシスだけでなくオートファジー制御にも関わっている
ことが明らかになった。また DrsとGADD34が蛋白合成や細胞成長を制御する mTOR経路
を抑制することによってウイルス感染防御やストレス環境化での生存にも関与しているこ
とが示唆された。
[研究目的]
DrsはSushiモチーフと呼ばれる構造と膜貫通ドメインを持つ新しいタイプの癌抑制遺
伝子である。 Drsは大腸癌、肺癌、前立腺癌、 ATLリンパ腫など種々のヒト癌細胞株や悪
性癌組織でその mRNA
発現が消失している。これらヒト癌細胞株!こ Drs遺伝子を導入し発
現させるとその悪性化形質が抑制されることから、 Drsはヒト癌の発生においても癌抑制
遺伝子として働いていると考えられる。また、 Drsは小胞体においてアポトーシス制御因
-9，
-3を活性化する新規の経路で種々
子ASY/Nogo-B/RTNと相互作用し、 caspase-12，
のヒト癌細胞株にアポトーシスを誘導する。さらに、我々が作製に成功した Drsノックア
ウト (KO)マウスではその約30%にリンパ腫、肺癌，肝癌などの悪性腫蕩が発生した。本
研究ではDrsI
くOマウスおよびDrsKO
細胞を用いて、アポトーシス制御なと、のDrsの生理機
能と発癌抑制との関連を明らかにする。
[方法と結果]
(
1
)D
r
s
l
く
Oマウス由来癌細胞株へのDrs
再導入による造腫蕩性抑制とアポトーシス
くOマウスで発生した転移をともなう肺腺癌から癌細胞株(
LCT1)を樹立した。この
D
r
s
l
くO肺癌細胞株にレトロウイルスベクターを用いてD
rs
遺伝子を再導入した細胞株
D
r
s
l
(LCT1-Drs)を作製し、ベクター導入細胞株(LCT1-pCX)とその悪性化形質とアポトーシス
感受性について比較検討した。 LCT1-Drs細胞株ではi
nv
i
t
r
oでの細胞増殖能はLCT1-pCX
細胞株と変化はなかったが、ヌードマウスの皮下に注射し、その造腫蕩能を調べたとこ
ろ
、 LCT1-Drs
細胞株ではLCT1-pCX細胞株に比べて顕著に造腫蕩能が抑制された。この
時
、 Drs
導入癌細胞の腫霧組織では活性化caspase3、caspase-9陽性のアポトーシス細
田
胞の数が有意に増加していた。また、 i
nv
i
t
r
o
でも培地中の血清濃度を下げると (0.2%)
、Drs
導入癌細胞株でのみcaspase-3，caspase-9，caspase12の活性化を伴うアポトー
回
シスが誘導された。導入したD
r
s蛋白の細胞内局在を蛍光抗体法で調べたところ Drsは小
胞体に局在することを確認した。
(
2
) DrsKO
胎児繊維芽細胞(MEF)の癌化能の解析
D
r
sの生理機能と癌化抑制の分子機構を細胞レベルで解析するために、 wild-type(WT)
およびDrsKOマウスの腔からそれぞれ胎児繊維芽細胞(MEF)を調製し、ウイルス癌遺伝子
に対する感受性を軟寒天培地中でのコロニー形成(anchorage-independentgrowth)を指
o
標に調べた。その結果、 D
r
s
l
く MEF
細胞はSV40-LargeT
ゃいsrcなと、のウイルス癌遺伝
子による細胞癌化!こWTMEF
細胞に比べて高い感受性を示した。
o
(
3
)D
r
s
l
く MEF
細胞におけるオートファジーの抑制
くOMEF
細胞では低血清(
0
.
1%)によって誘導されるオートファジーが、 WTMEF
細
D
r
s
l
胞に比べて顕著に抑制されることを見出した。 KO
細胞におけるこの抑制はレトロウイル
スベクターによってDrs遺伝子を再導入することによって回復した。電子顕微鏡とGFPくO細胞ではオートファゴソームからオートリソソームに移行す
LC3による解析から、 D
r
s
l
る後期成熟過程が抑制されていることがわかった。また、プロテオミクスの手法を用いた
Drs
結合蛋白の探索から、オートファジー進行に関わることが示唆されている s
m
a
l
lG蛋
白のRab24
がDrsと結合しうることを見出した。蛍光顕微鏡による解析では、 Drsと
Rab24は低血清によるオートファジー誘導の際に共局在した。
(
4
)ストレス応答蛋白 GADD34とDrsの相互作用とエネルギー枯渇下における細胞生存
Drs
結合蛋白として新たにストレス応答蛋白 GADD34を同定した。それぞれの遺伝子の
d
e
l
e
t
i
o
nmutantsを用いた免疫沈降実験から、 Drsの 3つのs
u
s
h
im
o
t
i
f
を含む領域と
GADD34のC末端領域 (
p
r
o
t
e
i
nphosphatase1の結合部位を含む)がこれらの蛋白の相
互作用に重要であることがわかった。また、 GADD34は癌抑制蛋白TSC1/2と相 E作用し
蛋白合成や細腹成長を制御する mTOR
経路を抑制することも明らかにした。 WTMEF
細胞
経路
ではグルコース飢餓条件下で誘導される GADD34はTSC1/2との結合を介して mTOR
を抑制した。一方、 GADD34KOMEF細胞ではグルコース飢餓条件下でアポトーシスが誘
導された。このアポトーシスは mTORの特異的阻害剤ラパマイシンによって阻害された。
このことから、 GADD34はTSCを介して mTOR
経路を抑制することでエネルギー枯渇条件
下における細胞の生存に重要な働き果たしていると考えられる。
(
5
) Drs/GADD34によるウイルス感染防御
GADD34はv
e
s
i
c
u
l
a
rs
t
o
m
a
t
i
t
i
sv
i
r
u
s(VSV)などのウイルス感染によって誘導される
が
、 GADD34KOMEFおよびDrsKOMEF細胞ではWTMEF細胞に比べて顕著にVSVの増
経路が抑制さ
姫が冗進されることを見出した。 VSVを感染させたWTMEF細胞では mTOR
れたが、 GADD34KOMEF
細胞では mTOR
経路の抑制は認められなかった。また GADD34
KOMEF
細胞におけるウイルス増殖はラパマイシンによって顕著に阻害された。これらの
経路の抑制を介してウイルス感染防御にも関わっているこ
結果から Drs/GADD34がmTOR
とが示唆された。
[考察]
DrsKOマウス由来肺癌細胞株 LCTlへの Drs
再導入の実験から、癌細胞の造腫蕩性抑制
とDrsによるアポトーシス誘導には密接な関連があることがわかってきた。我々は以前に
Drs
がヒト癌細胞株 i
こcaspase-12
ー
，9，
3の活性化をともなうアポトーシスを誘導する活
.
lOncogene2004)、Drs導入 LCTl細胞に
性があることを報告していたが (Tambeeta
9，
-3の活性化をともなうアポトーシス
おいても低血清条件下で培養すると caspase-12，
が誘導された。これらの結果から、 Drsは小胞体を介した新規の経路でアポトーシスを誘
導することにより癌化抑制に関わることがKOマウスの実験系でも明らかになった。これ
らの結果から、 Drsは癌の progression過程でおこる栄養や増殖因子の枯渇なと、のストレ
ス環境下でのアポトーシス制御を介して癌化抑制に関わっている可能性が考えられる。
D
r
s
l
くOマウスの怪から調製した胎児繊維芽細胞 (MEF) (およびw
i
l
d
t
y
p
eMEF)のウイル
ス癌遺伝子に対する感受性の実験から、 Drsは個体レベルだけで、なく細胞レベルでも細胞
癌化に対して抑制的に働くことがわかった。これらの MEF細胞を用いて、様々なストレス
に対する DrsKOMEF細胞の応答を WTMEF細胞と比較検討したところ、 Drsがアポトーシ
スだけでなく、オートファジーの制御にも関わっていることがわかってきた。また、新た
に同定した Drs結合蛋白 Rab24を介して Drsがオートファジー後期成熟過程の進行に関わ
ることも明らかにした。オートファジーは栄養枯渇などによって誘導され、細胞内のタン
パク質を一旦分解しアミノ酸源としてリサイクルすることで、基本的にはストレス環境下
での生存に有利に働くが、過度に進行すると細胞死が誘導される。近年、癌細胞でオート
ファジーが抑制されることから癌との関連も示唆されているがその詳細な分子機構はいま
だ明らかではない。 DrsKOマウスおよび DrsKO細胞を用いた遺伝学的解析、およびDrs
結
合蛋白との相互作用の解析によって、 Drsが関与するストレス環境下でのアポトーシス/
オートファジーの制御が、癌の悪性化とどのように関わっているのかを、今後分子レベル
で明らかにしてゆきたい。
r
s
がG
ADD34と結合することを明らかにした。さらに、
我々はまた D
KOMEF
細胞を用
D
r
sとGADD34
がグルコース飢餓での細胞の生存や、ウイルス増殖制御に
ADD34はDNA
傷害、栄養枯渇、エネルギー枯渇、低
も関わることを新たに見出した。 G
酸素なと、によって誘導されるストレス応答蛋白で、 P
r
o
t
e
i
nP
h
o
s
p
h
a
t
a
s
e1と結合し e
l
F
2
α
やp
S
3のリン酸化の制御に関わることが報告されている。我々は、 GADD34
がm
TORを上
流から制御する T
S
C
1
/
2と結合することにより mTOR
経路を抑制することも見出してい
TORはオートファジーを抑制するという報告もなされていることから、 D
r
s
が
る
。 m
mTORを介してオートファジーに関与している可能性も考えられる。今後、 D
r
sと
GADD34によるウイルス感染感染防御の分子機構を解明していくとともに、ストレス環境
いた実験から、
化における細胞応答にどのように役割を担っているかを明らかにしてゆきたい。

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