発生システムモデル化研究チーム Developmental Systems Modeling Team チームリーダー 大浪 修一（博士（理学）） ONAMI, Shuichi (Ph.D) キーセンテンス： 1. 細胞や発生の数理モデルの構築 2. 細胞や発生の計算機シミュレーション 3. 細胞や発生の動態を定量化する技術の開発 4. 遺伝子ノックアウト胚の発生ダイナミクスに関する定量情報データベースの構築 キーワード： システム生物学、計算細胞生物学、定量細胞生物学、計算発生生物学、定量発生生物学、バイオイメージ・ インフォマティクス、細胞シミュレーション、画像処理、線虫、初期胚、データベース 研究概要 多細胞生物の発生は時間的空間的に動的な過程です。受精卵と呼ばれる一つの細胞は細胞分裂を繰り返し て様々な機能を持つ細胞を作り、それらが特定の位置に配置されることにより、複雑な構造を持つ器官や 個体が作られます。このような時間的空間的に動的な過程のメカニズムを理解するためには、現象の定量 化と数理モデル化、計算機シミュレーションを組み合わせた定量・計算解析が必要です。当チームは、分 子細胞生物学、生物物理学、ゲノム科学、計算科学、数理科学等の研究技術を統合的に活用して発生を定 量・計算解析する技法を開発して、多細胞生物の発生のメカニズムを解明しようとしています。 細胞分裂ダイナミクスの 4 次元測定装置 4 次元微分干渉顕微鏡とコンピュータ画像処理技術を利用して開発した。当装置を利用して遺伝子ノックダ ウン線虫 C. elegans 胚の細胞分裂ダイナミクスの大規模解析を行っている。 研究年報 1. 線虫 C. elegans 胚の 4 次元定量的細胞分裂ダイナミクス解析（京田、足立、島田、倉持、藤田、大浪） (1)遺伝子ノックダウン胚の細胞分裂ダイナミクスについての定量情報の収集 4 次元顕微鏡画像と画像処理を利用して独自に開発した初期胚の細胞分裂ダイナミクスを定量的に測 定する装置を使い、RNAi を使って遺伝子機能を阻害した線虫胚の細胞分裂ダイナミクスについての定量 情報の収集を行っている。線虫の胚発生必須遺伝子（全 351 遺伝子）の 91％（320 遺伝子）について、 遺伝子機能を阻害した線虫胚の細胞分裂ダイナミクスの測定を完了した。 (2)遺伝子ノックダウン胚の計算表現型解析 第 III 染色体の胚発生必須遺伝子（全 97 遺伝子）を対象に、細胞分裂ダイナミクスの定量情報を利用 した表現型解析を行った。数学的に定義した 365 種の表現型指標に対して 6958 種の表現型異常を検出し た。他グループが行った目視による大規模表現型解析の結果と比較し、計算表現型解析は目視による表現 型解析に比べて、感度と客観性が高いことを示した。 (3)発生フローチャート解析 細胞分裂ダイナミクスの定量情報を利用して胚の形態形成のプログラムを推定する手法（発生フローチ ャート解析）を開発した。野生型胚 50 個体の表現型指標間のペア相関を計算し、発生プログラムの素過 程であることが推定される 1659 関係（329 指標間）を導出した。さらに、これらの関係が破壊された 8349 種の RNAi 胚を同定し、対応する発生プログラムの素過程で機能する遺伝子を推定した。 2. 公共の動画像データを利用した線虫胚の定量的細胞分裂ダイナミクス解析（前田、京田、高山、青柳、 大浪） (1)公共の動画像データに適用可能な細胞分裂ダイナミクス測定装置の開発 公共データベースから公開されている顕微鏡動画像は、撮影条件が標準化されていないため、動画像の 間で画質に大きなばらつきがある。我々は、幅広い範囲の画質の動画像に適用することが可能な細胞分裂 ダイナミクス測定装置を開発した。Watson’s method と Dynamic threshold binarization method を組 み合わせることにより、本装置は公共動画像データベース Phenobank の約 8 割の動画像について細胞分 裂ダイナミクスの定量情報の自動的な取得が可能な性能を示した。 (2)Phenobank の動画像データを利用した RNAi 胚の細胞分裂ダイナミクス定量情報の収集 Phenobank は線虫の全ての胚発生関連遺伝子（全 1259 遺伝子）についての RNAi 胚の 2+1 次元（2 次元+時間）顕微鏡動画像を公開する公共データベースである。我々は、独自に開発した公共データベー ス動画像用の測定装置を Phenobank より取得した動画像に適用し、RNAi 胚の細胞分裂ダイナミクスの 定量情報の取得を行っている。全ての胚発生関連遺伝子について RNAi 胚の細胞分裂ダイナミクスについ ての 2+1 次元の定量情報を取得した。 (3)細胞分裂ダイナミクスについての 2+1 次元の定量情報から生物学的知識を抽出する手法の開発 Phenobank の動画像から取得した RNAi 胚の細胞分裂ダイナミクスについての 2+1 次元定量情報から 生物学的知識を抽出する目的で、Quality Threshold Clustering を利用して細胞分裂ダイナミクスのクラ スタ解析を試みた。野生型と大きく異なる特徴的な細胞分裂ダイナミクスを小さなクラスタとして検出す ることに成功した。 3. 細胞の形態制御についての数理モデルの構築（藤田、大浪） (1)細胞の形態制御の機構の解明 2 細胞期の線虫胚では、AB 細胞と P1 細胞の境界は、最初は平面であるが、その後 P1 細胞に向かって 凸な形状に変化する。我々はこの現象をモデル系として、細胞の形態変化についての物理モデルの構築を 行っている。レーザーを利用して 2 細胞期胚に細胞骨格阻害剤を作用させる実験系を確立し、細胞境界の 凸化にはアクチンが必要であることを発見した。また、温度感受性変異体を用いてミオシンの必要性も発 見した。更に、UV を使った細胞障害実験により、凸化の原動力は AB 細胞が発揮していることを発見し た。また、GFP:PHPLC1δ1 発現株と画像処理を利用して凸化の前後での AB 細胞の体積、表面を測定し、 凸化の主要な要因は細胞表面積の減少であることを明らかにした。 (2)細胞を球形化する物理モデルの検討 凸化の主要な要因である細胞表面積の減少のメカニズムを検討した。細胞表面積減少のメカニズムとし ては cortex の張力およびエンドサイトーシスによる細胞膜の取り込みが知られている。我々は cortex の 平成 21 年度 曲げ弾性も細胞表面積を減少させ細胞を球形化することができることを、コンピュータ・シミュレーショ ンを利用して発見した。 4. 組織の形態形成を支配する機構の解明（前田、大浪） 組織の 3 次元の形態を形成する機構の解明を目指し、組織形態形成過程での個々の細胞の動態の定量情 報を取得するツールを開発した。GFP 標識タンパク質を使って細胞境界を可視化したショウジョウバエ 気管原基の陥入期の動画像から細胞境界を自動検出する画像処理アルゴリズムを Canny filter と Hybrid 3D Watershed Algorithm を組み合わせて開発し、更に検出結果を編集する GUI を開発した。これらの アルゴリズムと GUI を用いて、気管原基組織の陥入期の各細胞の動態の定量情報を取得した。（CDB 形 態形成シグナル研究グループとの共同研究） 5. 発生過程における細胞内カルシウム動態の定量解析（高山、大浪） 初期発生における細胞内カルシウム伝達の分子機構を解明し、数理モデルを構築する目的で、線虫胚の 細胞内カルシウム動態を遺伝学的観点および数理生物学的観点から研究している。線虫の生殖腺にカルシ ウム指示薬を微量注入し細胞内カルシウムの可視化を試みたところ、受精時にカルシウムの細胞内動態を 示す蛍光の変動が観察された。 ------------------Key Sentence : 1. Mathematical modeling of cell and development 2. Computer simulation of cell and development 3. Development of technologies for obtaining quantitative information about cell and developmental dynamics 4. Development of databases for quantitative information about developmental dynamics of gene-knockdown embryos Key Word : systems biology, computational cell biology, quantitative cell biology, computational developmental biology, quantitative developmental biology, bioImage informatics, cell simulation, image processing, C. elegans, embryo, database Outline Development of multicellular organisms is a spatially and temporally dynamic process. A single cell, the fertilized egg, divides many times to generate many functionally different cells, each of which is brought to a specific position to produce complex multicellular structures, i.e. organs and the body. Quantitative and computational analysis, which combines quantification, mathematical modeling and computer simulation, is necessary to understand such spatially and temporally dynamic processes. To understand the mechanism of development, we are developing technologies for quantitative and computational analysis by combining molecular cell biology, biophysics, genome science, computational science and mathematical science. 研究年報 4D cell division dynamics measurement system We developed the system by combining 4D DIC microscope and computer image-processing. We are conducting a large-scale analysis of cell division dynamics in RNAi-treated C. elegans embryos by using this system. 1. 4D quantitative cell division dynamics (CDD) analysis on C. elegans embryos (Kyoda, Adachi, Shimada, Kuramochi, Fujita, Onami) (1) Collection of quantitative information about CDD in gene knockdown embryos We developed a system that measures cell division dynamics in embryo by combining 4D microscope and image-processing. Using this system, we are collecting quantitative information about CDD in C. elegans embryos when genes are silenced by RNAi. We obtained CDD information from RNAi-treated embryos for 91% (320/351) of all essential embryonic genes of C. elegans. (2) Computational phenotype analysis of gene knockdown embryos We conducted RNAi phenotype analysis by using quantitative CDD information for all essential embryonic genes on chromosome III (97 genes). We identified 6958 RNAi phenotypes of CDD by mathematically defining 365 phenotypic characters. We found that our computational phenotype analysis identifies phenotypic alterations much more sensitively and objectively than a previous large-scale manual analysis. (3) Developmental flowchart analysis We developed a method that infers program of embryogenesis by using quantitative CDD information. We named the method ‘developmental flowchart analysis’. The method computed correlations between each possible pair of phenotypic characters by using our wild-type CDD information, and deduced 1659 relationships among 329 phenotypic characters; these relationships most likely correspond to elementary processes in the program of development. The method also identified 8349 RNAi embryos in which each of these relationships were disrupted; the silenced genes are most likely involved in the corresponding elementary processes in the program of development. 平成 21 年度 2. Quantitative CDD analysis on C. elegans embryos by using microscope movies in public database (Maeda, Kyoda, Takayama, Aoyagi, Onami) (1) Development of a CDD measurement system applicable to microscope images in public database Image quality of microscope movies in public database varies greatly because these movies were not recorded under a well-controlled condition. We developed a CDD measurement system that is applicable to movies of a wide range of image quality. The systems implemented Watson’s method and dynamic threshold binarization method, so that it can automatically obtain quantitative CDD information from 80% of movies in Phenobank, a public database for microscope movies of C. elegans embryos. (2) Collection of quantitative information about CDD in RNAi embryos by using movies in Phenobank Phenobank is a public database that contains 2+1D (2D + time) microscope movies of RNAi C. elegans embryos for all embryogenesis-related genes (1259 genes). We are collecting 2+1D quantitative information of CDD in RNAi embryos by applying our CDD measurement system for public movies to movies in Phenobank. We obtained CDD information of RNAi embryos for all the embryogenesis-related genes. (3) Development of methods to extract biological knowledge from 2+1D quantitative CDD information To extract biological knowledge from 2+1D quantitative CDD information of RNAi embryos obtained by using movies in Phenobank, we clustered the CDD by using Quality Threshold Clustering. We found interesting CDDs in small clusters; these CDDs are markedly different from wild-type CDD. 3. Mathematical modeling of the mechanism that controls cell shape (Fujita, Onami) (1) Analysis of the mechanism that controls cell shape In C. elegans embryo, the boundary shape of the AB and P1 cell is flat in the beginning of two-cell stage, but AB gradually bulges toward P1 at the late two-cell stage. We are developing physical model of cell shape change by using this phenomenon as a model system. We introduced cytoskeleton inhibitors to two-cell stage embryo by using laser permeabilization and found that actin is necessary for the bulge formation. We also found that myosin is necessary by using temperature sensitive mutants. UV cell irradiation demonstrated that the bulge formation depends on AB but not on P1. Measurement of the volume and surface area of AB before and after the bulge formation by using GFP:PHPLC1δ1 producing embryo showed that the decrease in surface area plays a major role in the bulge formation. (2) Study on the physical model for cell rounding The decrease in cell surface area plays a major role in the bulge formation. Thus, we are studying mechanisms of decreasing the cell surface area. Cortical tension and the net decrease of lipid bilayer by endocytosis were proposed for the mechanism. We found by using computer simulation that cortical stiffness also can decrease the cell surface area. 4. Analysis of the mechanism that controls tissue morphogenesis (Maeda, Onami) To understand the mechanism that generates 3D tissue morphology, we developed a system that obtains quantitative information about dynamics of cells during tissue morphogenesis. We developed an image-processing algorithm that automatically detects cell boundaries in movies of the Drosophila tracheal placode expressing GFP in cell boundaries; the algorithm combines Canny filter and Hybrid 3D Watershed Algorithm. We also developed a GUI tool that helps users manually edit automatically detected cell boundaries. We obtained quantitative information about dynamics of cells during tracheal invagination by using these algorithm and GUI tool. (collaboration with Laboratory for Morphogenetic Signaling, RIKEN CDB) 5. Quantitative analysis of intercellular calcium dynamics in embryo (Takayama, Onami) To understand molecular mechanism of intercellular calcium signaling during early development and to establish mathematical model of the mechanism, we are studying intercellular calcium dynamics in C. elegans embryo by employing methods of genetics and computational biology. We injected calcium indicator into the gonad and found characteristic dynamics of fluorescent signals at the fertilization, which likely correspond to intercellular calcium dynamics. 研究年報 Principal Investigator 大浪 修一 Shuichi Onami Research Staff 京田 耕司 Koji Kyoda 前田 卓哉 Takuya Maeda 藤田 征志 Masashi Fujita 高山 順 Jun Takayama Students 東 裕介 Yusuke Azuma Assistant and Part-timer 坪谷 麻子 Mako Tsuboya 足立 絵瑠 Eru Adachi 島田 久美子 Kumiko Shimada 倉持 順子 Junko Kuramochi 青柳 美代子 Miyoko Aoyagi
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