4th JBF Symposium http://bioanalysisforum.jp/ バイオアナリシス分析法（リガンド結合法） バリデーションに関するガイドラインJBF案の概要 Outline of the JBF draft BMV Guideline for Ligand Binding Assay 谷口 佳隆1，今里 真実2，掛樋 真彰3，久世 洋司3， 中村 隆広4，細木 淳5，南出 善幸6，宮 和弘7 （東レリサーチセンター 1，ノバルティス ファーマ2，武田薬品工業3，新日本科学4 ，協和発酵キリン5，島津テクノリサーチ6，中外製薬7） http://bioanalysisforum.jp/ 内容 1. ガイドライン作成の過程 2. ガイドラインの「適用」「項目」 3. ガイドラインの概要 4. 今後の議論のポイント 5. 今後の予定 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 2 http://bioanalysisforum.jp/ JBF案作成の過程（１） 2011 10月 BMV研究班からJBFに指針素案の作成依頼 BMV研究班 医薬品の品質、有効性及び安全性確保のための規制の国際調 和の推進に係わる研究（厚労科学研究、研究代表者：大野泰雄） 分担研究：バイオアナリシス(生体試料分析) バリデーションに関 する研究（研究分担者：香取典子） 依頼内容 まず、低分子のバイオアナリシスに対するバリデーションを基本とす る。可能ならば、低分子終了後に高分子、バイオマーカー等のバイ オアナリシスに対するバリデーションも視野に入れる。 リガンド結合法-ワーキンググループ（LBA-WG） 座長：石井 明子（国立医薬品食品衛生研究所 生物薬品部） 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 3 http://bioanalysisforum.jp/ JBF案作成の過程（２） BMV研究班 班会議 JBF LBA-WG 2012年3月 日本版BMVガイドラインJBF案（低分子LC）が拠出 2012年9月 WG会議 LBAガイドライン作成方針 2012年8月 タスクフォース発足 2012年11月 WG会議 LBAガイドライン LBAガイドライン 適用案・項目案 適用案・項目案 2013年1月 班会議 2013年3月 WG会議 2013年5月 班会議 2013年4月 LBAガイドライン WG会議 本文案 本文・解説案 JBF案（本文・解説） 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 4 http://bioanalysisforum.jp/ 適用 本ガイドラインは，トキシコキネティクス試験及び臨床試 験における生体試料中薬物濃度分析法としてリガンド 結合法（ligand binding assay: LBA）を用いる際の分析 法バリデーション並びに当該分析法を用いた実試料分 析に適用するものとする．対象薬物はぺプチド及びタン パク質が中心となるが，リガンド結合法を用いて分析す る薬物であれば低分子化合物も対象とする．リガンド結 合法の代表的な例としては，酵素免疫測定法（enzyme immunoassay: EIA）等の抗原抗体反応に基づく免疫 学的測定法が挙げられる． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 5 http://bioanalysisforum.jp/ LBAガイドライン JBF案項目 4. 実試料分析 4.1 実試料分析における分析法の妥当 性と再現性 2. 標準物質 （標準品） 4.1.1 検量線 3. 分析法バリデーション 4.1.2 QC試料 3.1 フルバリデーション 4.1.3 ISR 3.1.1 特異性 4.2 注意事項 3.1.2 選択性 4.2.1 定量範囲 3.1.3 検量線 4.2.2 再分析 3.1.4 真度および精度 4.2.3 キャリーオーバー 3.1.5 希釈直線性 4.2.4 クロストーク 3.1.6 安定性 3.2 パーシャルバリデーション 4.2.5 重要試薬 3.3 クロスバリデーション 4.2.6 平行性 4.2.7 干渉物質 1. 適用 5. 報告書の作成と記録等の保存 用語解説 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 6 http://bioanalysisforum.jp/ 項目-低分子・LC案*とLBA案の比較（１） *パブコメ案 •数値的基準を除き，全くあるいはほぼ同じ項目 •LBAと低分子・LCと考え方は同じだが， 評価方法が異なる項目 検量線，真度及び精度，QC試料など •LBAのみの項目，低分子・LCと考え方が違う項目 特異性，選択性，希釈直線性など 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 7 http://bioanalysisforum.jp/ 項目-低分子・LC案とLBA案の比較（２） 低分子・LCパブコメ案 3.標準物質（標準品） 4. 分析法バリデーション 4.1. フルバリデーション 4.1.1. 選択性 4.1.2. 定量下限 4.1.3. 検量線 4.1.4. 真度及び精度 4.1.5. マトリックス効果 4.1.6. 回収率 4.1.7. キャリーオーバー 4.1.8. 希釈妥当性 4.1.9. 安定性 4.2. パーシャルバリデーション 4.3. クロスバリデーション 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 LBA JBF案 2. 標準物質（標準品） 3. 分析法バリデーション 3.1. フルバリデーション 3.1.1. 特異性 3.1.2. 選択性 3.1.3. 検量線 3.1.4. 真度及び精度 3.1.5. 希釈直線性 3.1.6. 安定性 3.2. パーシャルバリデーション 3.3. クロスバリデーション 8 http://bioanalysisforum.jp/ 項目-低分子・LC案とLBA案の比較（３） 低分子・LCパブコメ案 LBA JBF案 5. 実試料分析 4. 実試料分析 5.1. 実試料分析における分析法の妥当 4.1. 実試料分析における分析法の妥 性と再現性 当性と再現性 5.1.1. 検量線 4.1.1. 検量線 5.1.2. QC試料 4.1.2. QC試料 5.1.3. ISR 4.1.3. ISR 5.1.4. キャリーオーバー 4.2. 注意事項 5.2. 注意事項 4.2.1. 定量範囲 5.2.1. 定量範囲 4.2.2. 再分析 5.2.2. 再分析 4.2.3. キャリーオーバー 5.2.3. クロマトグラムの波形処理 4.2.4. クロストーク 5.2.4. システム適合性 4.2.5. 重要試薬 4.2.6. 平行性 4.2.7. 干渉物質 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 9 http://bioanalysisforum.jp/ LBAガイドライン JBF案の特徴 ①リガンド結合法を用いて分析する薬物であれば低分子 化合物も対象とする。 ②バリデーションの実施前に最小希釈倍率（minimum required dilution: MRD）の設定が必要。 ③特異性の評価が必要。 ④選択性の評価方法が低分子ガイドライン案とは異なる。 ⑤真度及び精度の評価は検量線の上限濃度についても 必要。 ⑥高濃度のQC試料の濃度を定量上限の1/3以上とした。 ⑦希釈直線性の評価が必要。 ⑧重要試薬のロットや希釈倍率変更時にパーシャルバリ デーションが必要。 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 10 http://bioanalysisforum.jp/ 標準物質（標準品） 使用する標準物質については，入手先が明らかにされ，か つその特性が精査されている必要がある．ロット番号，有 効期限又はリテスト日，含量（物質量，純度又は力価），並 びに保存条件等を明らかにした分析証明書が必要である． ＜解説＞ バイオテクノロジー応用医薬品の用量は，生物活性を表 す「力価（単位は「単位」）」又は主にタンパク量を表す物 質量で表示される．標準物質は溶液であることが多いた め，力価や物質量は濃度表示で示すことが一般的である 特性が精査：構造・物理化学的性質，生物活性，免疫化 学的性質及び純度等が明らかになっており，かつ，品質 規格がある場合には規格に適合していること． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 11 http://bioanalysisforum.jp/ フルバリデーション リガンド結合法では，分析法を確立する過程において試 料の最小希釈倍率（minimum required dilution: MRD） を設定し，設定した最小希釈倍率を用いてフルバリデー ションを実施する．プレートを用いるリガンド結合法では， 1試料あたり少なくとも2穴（2 wells）で測定し，平均値を 試料の値とする． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 12 http://bioanalysisforum.jp/ 特異性（１） 特異性とは，用いる分析法において分析対象物質を特異 的に検出する能力のことである．リガンド結合法の場合， 結合試薬（binding reagent）が分析対象物質と特異的に 結合し，試料中に共存する類似物質（分析対象物質と構 造的に類似した物質）と交差反応性（cross-reactivity）を 示さないことが重要である．類似物質が利用可能な場合 には評価する．分析法を確立する過程や初期の分析法バ リデーション終了後に評価することもある． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 13 http://bioanalysisforum.jp/ 特異性（２） 特異性は，ブランク試料（分析対象物質を添加しないマト リックス試料），並びに低濃度及び高濃度付近のQC試 料に想定される濃度の類似物質を添加した試料を用い て評価する． ブランク試料が定量下限未満を示し，QC試料の定量値 の真度が真の値（理論値）のそれぞれ±20%以内（定量 下限及び定量上限の場合は±25%以内）であることが 望ましい． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 14 http://bioanalysisforum.jp/ 選択性（１） 選択性とは，試料中の他の成分の存在下で，分析対象 物質を区別して検出することができる能力のことである． 選択性は，少なくとも10個体から得られた個別のブラン ク試料及び個別の定量下限のQC試料を用いて評価す る．希少なマトリックスを使用する場合には，10個体より も少ない個体から得られたマトリックスを使用することも 許容される． ブランク試料の80%以上が定量下限未満を示し，定量下 限のQC試料の80%以上において定量値の真度が理論 値の±25%以内であることが望ましい． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 15 http://bioanalysisforum.jp/ 選択性（２） 2 レスポンス レ ス ポ ン ス 定量下限 定量下限 1 0 1 低分子・LC 低分子・LC ブランク レスポンス （濃度） 2 2 3 4 5 6 ブランク試料が定量下限（1.0）の20％未満 ブランク試料が定量下限（1.0）の20%未満 ±25% ±25% 添加試料 定量下限 定量下限 レスポ ンス 1 (濃度） 0 1 LBA LBA 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ブランク試料の80%以上が定量下限（1.0）未満 ブランク試料の80%以上が定量下限（1.0）未満 LLOQ添加試料の80%以上の真度が25%以内 LLOQ添加試料の80%以上の真度が±25%以内 16 http://bioanalysisforum.jp/ 検量線（１） 検量線の作成には，・・・．カーブフィッティングを向上させ る目的で，定量下限未満の濃度及び検量線の定量上限 を超える濃度のアンカーポイントを設定しても良い．検量 線の回帰式は，一般的には4又は5-パラメーターロジス ティックモデルであるが，これに限定されない．検量線の 回帰式の算出にはブランク試料を用いない．・・・． ・・・各濃度の真度は，定量下限及び定量上限において 理論値の±25%以内とし，定量下限及び定量上限以外 においては理論値の±20%以内とする．アンカーポイン トには真度の基準を設けない．アンカーポイントを除く検 量線用標準試料の75%以上かつ，定量下限及び定量上 限を含む少なくとも6濃度以上が上記の基準を満たすも のとする． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 17 http://bioanalysisforum.jp/ 検量線（２） Anchor Point No Hook Effect ULOQ Hook Effect LLOQ Anchor Point 4-parameter logistic model AD y D B 1 ( x/C) B. DeSilva et al., Pharmaceutical Research, 20: 1885-1900 18 (2003)より引用・改変 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 18 http://bioanalysisforum.jp/ 真度および精度（１） バリデーション時においては，検量線の定量範囲内で， 最低5濃度（定量下限，低濃度，中濃度，高濃度及び定 量上限）のQC試料を調製する． QC試料の濃度については，低濃度は定量下限の3倍 以内,中濃度は検量線の中間付近，高濃度は検量線の 定量上限の1/3以上であるものとする．分析単位内及び 分析単位間の真度及び精度は，分析単位内では各濃 度あたり少なくとも2回の繰り返し分析をし，少なくとも6 回の分析単位を繰り返し分析することによって評価され る． 19 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 19 http://bioanalysisforum.jp/ 真度および精度（２） 各濃度における平均の真度は，理論値の±20%以内で なければならない．ただし，定量下限及び定量上限では ±25%以内であるものとする．各濃度における定量値 の精度は，20%以下でなければならない．ただし，定量 下限及び定量上限では25%以下とする． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 20 http://bioanalysisforum.jp/ 真度および精度（３） MQC 3倍 LQC LLQC 1/3 HQC ULQC B. DeSilva et al., Pharmaceutical Research, 20: 1885-1900 21 (2003)より引用・改変 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 21 http://bioanalysisforum.jp/ 希釈直線性（１） 希釈直線性は，検量線の定量上限を超える試料の濃度 を適切に分析できることを確認するために実施する．希 釈直線性は，定量上限を超える試料及びこの試料をブラ ンクマトリックスで段階希釈した複数濃度の試料を分析 することによって評価される．上記試料において，レスポ ンス低下（プロゾン，フック効果）の有無を確認し，レスポ ンス低下が認められた場合には実試料分析に影響を及 ぼさないような手段を考慮する必要がある．また，試料 の定量値を希釈倍率で補正した後の真度は理論値の ±20%以内，精度は20%以下でなければならない． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 22 http://bioanalysisforum.jp/ 希釈直線性（２） Data 1 1.5 Hook effect Prozone OD450 1.0 0.5 0.0 0.1 1 10 100 1000 Drug (ng/ml) 23 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 23 http://bioanalysisforum.jp/ 希釈直線性（３） 実施例 Nominal conc. Measured conc. Dilution (ng/mL) (ng/mL) 100000 1 >ULOQ 1000 1 >ULOQ 100 1 >ULOQ 40.0 5000 42.54 20.0 10000 18.51 10.0 20000 9.76 5.00 40000 5.34 2.50 80000 2.48 1.25 160000 1.23 Mean “Reference standard” SD : 200000 ng/mL %CV ULOQ: 50 ng/mL 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 Final conc. (ng/mL) >ULOQ >ULOQ >ULOQ 212700 185100 195200 213600 198400 196800 200300 10987 5.5 Accuracy (%) 106.4 92.6 97.6 106.8 99.2 98.4 24 http://bioanalysisforum.jp/ パーシャルバリデーション パーシャルバリデーションを実施する典型的な事例として， 分析法の他施設への移管，分析機器の変更，重要試薬の ロットの変更，定量範囲の変更，希釈倍率の変更，抗凝固 剤の変更，分析条件の変更，試料の保存条件の変更，併 用薬の分析に与える影響の確認又は希少なマトリックスの 使用等が挙げられる． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 25 http://bioanalysisforum.jp/ 重要試薬（Critical reagent） 重要試薬とは，リガンド結合法による生体試料中薬物濃度 分析において分析結果に直接影響する試薬を指し，主に結 合試薬（抗体及びその標識体等）が該当する． 重要試薬は，分析対象物質に対する特異性に留意して選 択し，品質が維持できる条件で保存する．重要試薬の品質 は，分析法バリデーション並びに実試料分析に使用される 期間を通じて適切に保証される必要がある．使用する期間 中の検量線及びQC試料の分析結果を評価することにより， 重要試薬の品質を確認することが望ましい．また，重要試 薬のロット変更の際にはパーシャルバリデーションが必要で ある． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 26 http://bioanalysisforum.jp/ 平行性（Parallelism）（１） ＜解説＞ 平行性は実試料を用いて評価するが，平行性がみられ ない場合は稀である．ただし，実試料においては，分解 物，代謝物，さらに抗薬物抗体等が存在しており，平行 性に影響を与える可能性は否定できない． EMA Guideline（2011）の「7.1.1.10. Parallelism」には 平行性について記載がある. 稀な現象であることから，本ガイドラインにおいては妥当 性の評価項目とはせず，注意事項に記載するかについ て議論した．現時点では，結論が得られていない． 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 27 http://bioanalysisforum.jp/ 平行性（Parallelism）（２） Non-Parallel Case Parallel Case Standard v Serum Sample 1.56 100 25 6.25 Log (Dilution) Log (OD) Log (OD) Standard v 1.56 Serum Sample 100 25 6.25 Log (Dilution) Plikaytis et al. J. Clin. Microbiol. 32: 2441-2447 (1994)より引用・改変 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 28 http://bioanalysisforum.jp/ バリデーション報告書 低分子・LCパブコメ案 バリデーションの要約 標準物質に関する情報 ブランクマトリックスに関する情報 LBA JBF案 バリデーションの要約 標準物質に関する情報 ブランクマトリックスに関する情報 重要試薬に関する情報 分析方法 分析方法（最小希釈倍率を含めて記載 する．） バリデーションの評価項目と判断基準 バリデーションの評価項目と判断基準 バリデーションの結果及び考察 バリデーションの結果及び考察 分析の棄却及びその理由 分析の棄却及びその理由 再分析に関する情報 再分析に関する情報 計画書及び手順書からの逸脱事項並び 計画書及び手順書からの逸脱事項並 に試験結果に対する影響 びに試験結果に対する影響 参照する別試験，手順書及び参考文献 参照する別試験，手順書及び参考文 の情報 献の情報 代表的なクロマトグラム 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 29 http://bioanalysisforum.jp/ 記載しなかったこと：Total error RE CV Total error はリガンド結合法に限定されず低分子ガイドライン案に も共通する事項である．低分子ガイドライン案ではtotal errorの記 載をしていないことから，リガンド結合法でも記載しないことにした． B. DeSilva et al., Pharmaceutical Research, 20: 1885-1900 (2003)より引用・改変 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 30 http://bioanalysisforum.jp/ 今後の議論のポイント 標準物質と被験物質のロットの異同 標準物質ロット更新の際の生体試料分析での確認 平行性の扱い Total errorについて など ディスカッショングループ（DG）での議論も期待します。 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 31 http://bioanalysisforum.jp/ 今後の予定 BMV研究班 班会議 JBF LBA-WG タスクフォース 関係団体からの コメント募集（6～8月） JBF案 ver.2 及びQ&A案作成 関係団体コメントとりまとめ 2013年9月 2013年11月 WG会議 JBF案 Ver.2 班会議 LBAガイドライン案 Q&A案 Q&A案 2014年3月 パブコメ案 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 WG会議 32 http://bioanalysisforum.jp/ 謝辞 BMV研究班の先生方 LBA-WGの先生方 座長：石井 明子 片島 正貫 前川 浩太郎 光岡 俊成 奥田 晴宏 香取 典子 川崎 ナナ JBF-SC 黒川 達夫 奥田 晴宏 五十嵐 春江 佐々木 和彦 松丸 剛久 荻中 淳 香取 典子 内山 仁 佐野 善寿 八幡 憲治 新見 伸吾 升島 努 大津 善明 大住 孝彦 富樫 一天 工藤 忍 本発表資料に掲載した図表の一部は，石井明子先生よりご 提供いただきました。この場を借りてお礼申し上げます。 4th JBF Symposium, 2nd August 2013 間渕 雅成 河村 正則 中井 恵子 小林 信博 原 久典 敬称，所属略 33
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