616.36-003. 826: 577.158 肝 疾 患 に お け る 肝Glucose-6-phosphate 6-Phosphogluconate cleavage dehydrogenase, dehydrogenaseお enzyme活 よ びCitrate 性 と肝 の 脂 肪 沈 着 に つ い て 第1編 岡山大学医学部 第一内科教室(主 任:小 坂淳夫教授) 大学院学生 古 元 〔昭 和42年3月29日 裕 受稿〕 成 し,脂 肪 酸 合 成 の亢 進 を 反 映 して 増 加 す る と い わ 緒 言 れ て い る5)6)7)Citrate cleavage enzyme(以 肝疾 患 時 に 現 わ れ る肝 の脂 肪 沈 着 の 問 題 は,脂 質 下CCE) を ヒ トの肝 組 織 で 測 定 し,肝 に お け る脂 肪 沈 着 との 代謝に 関 す る知 識 の 増 大 と共 に 次 第 に 解 明 され て来 関連 に お い て 検 討 を 加 え た. てい るが,尚 不 明 の 分 野 を 残 して い る.現 在 一 般 的 研 究 対 象 およ び 方 法 1) 研 究 対 象 な 脂肪肝 の発 生 機 序 と して, 1) 血中 非 エ ス テ ル型 脂肪 酸(non-esterified fatty acid)の 肝 へ の 流 入 の増 加 当 内 科 入 院 の 肝 疾 患 患 者52例 で あ る.こ れ らの 対 象 例 に つ い て は,各 種 肝 機 能 検 査,腹 腔鏡検査 およ 2) 肝 内 で の 内 因 性 の脂 肪 酸 合 成 の 亢 進 び病 理 組 織 学 的 検 索 を 行 な つ て 診 断 を 確 定8)し た急 3) 肝 の 脂 肪 酸 酸 化 能 の低 下 性 肝 炎(恢 復 期)6名,活 4) リポ蛋 白 と して 肝 よ り中 性 脂 肪 を 分 泌 す る 機 動性 慢 性 肝 炎11名,肝 動 性 慢 性 肝 炎18名,非 硬 変14名,ア 2名 お よ び原 因不 明 の 脂 肪 肝1名 構の障 害 が考 え られ て い る. 正 常 対 照 例 は,肝,胆 これ らの うち,中 性 脂 肪 分 泌 機 構 の 障害 が 脂 肪 肝 活 ル コ ール 性 脂肝 を 対 象 と した. 道 疾 患 を 除 外 した 当大 学 病 院 入 院 患 者 で,十 二 指 腸 潰 瘍2例,胃 癌3例 で あ る. 発生 の最 も基 本 的 な要 因 と され,四 塩 化 炭 素 障 害 ラ 2) 研 究 方 法 ッ ト肝 の 脂肪 沈 着 を 説 明 す る上 に も重 要 な 部 分 を 占 a) 肝 上 清 液 の 作 成 め る1).一 方,脂 肪 酸 合 成 の亢 進 が 脂 肪 肝 の 発 生 に 肝 諸 酵 素 活 性 の測 定 は,当 内 科 入 院 患 者 に つ い て 関与 して い る可 能 性 も,高 橋 らの オ ロ ッ ト酸 脂 肝 に は腹 腔 鏡 検 査 時 に直 視 下 生 検 に よつ て 得 られ た 肝組 お け る脂 肪 酸 合成 に 関 連 した肝 酵 素 の 活 性 上 昇 か ら 織30∼50mgに 示 され て い る2).ヒ は,手 術 時 に 得 られ た肝 組 織 の 一 部(30∼50mg)に トの肝 疾 患 経 過 時 に 現 わ れ る肝 つ い て,ま の脂 肪 沈 着 に も3),上 記 の4つ の 要 因 が 関 与 す る と つ い て行 な つ た.即 考 え られ るが,肝 病 態 の 多 様 性 か らみ て も 明 らか な ア ル カ リ性KCl溶 よ うに,ど の 要 因 が よ り重 要 で あ る か を 知 りそ の 障 え, Potter-Elvehjem型teflon 害 の機 序 を 解 明 す るに は な お多 くの 困 難 を 伴 つ て い 分600回 転 の 速 度 で1分 る. genizeし た.上 記 の操 作 は す べ て 氷 冷 下 で 行 な つ た. 著者 は肝 疾 患 時 に 現 われ る肝 の 脂 肪 沈 着 の機 序 を 次 い で,得 加 し,脂 肪 酸 合 成 にTPNH2供 測 定 を 行 な つ た. PDH)お dehydrogenaee(以 よ び6-phosphogluconate 下6-PGDH)更 下G6- dehydrogenase(以 ドリア外 で そ の合 成 に 用 い られ るAcetyl-CoAを 生 homogenizerを 用 い毎 間(途 中15秒 間休 止)homo で60分 間30, 遠 沈 後上 清 液 を 分 離 し,直 ち に酵 素 活 性 の b) 肝 酵 素 活性 の 測 定 肝G6-PDH, に,脂 肪 酸 合 成 の 場 で あ る ミ トコ ン 稀 釈 に な る よ うに加 られ たhomogenateを0∼4℃ 000gで い る4)Glucose-6-phosphate られ た肝 組 織 に 氷 冷 等 張 液9)を40倍 解 明 す る一 段 階 と して,脂 肪 酸 合 成 の 亢 進 と共 に増 給 の面 で も関 与 して ち,得 た外 科 入 院 患 者 に つ い て 6-PGDH活 応 液 を 用 い, 37℃ でTPNの 性 の 測 定 は表1に 示す反 還 元 をspectrophotometric に 経 時 的 に測 定 し.最 初 の5分 以 内 の 直 線 部 分 か ら 348 古 Table Assay System 裕 め る方 法 が あ る が,著 者 の成 績 で は,彼 等 の記 すそ 1 of Liver. G6-PDH 6-PGDH 元 れ ぞ れ の 基 質 濃 度5mMあ and Activities るい は そ れ 以 上 に おいて, 両基質 を混合 した際の活性 が6-PG単 独の場合の活 性 に近 い か む しろ低 くな る結 果 を 得 て い る.著 者の 用 い た2.5mMの 基 質 濃 度 で はG6-P単 た 活性 の80∼90%が,そ 独 で 得 られ れ ぞ れ の 基 質 濃 度2.5mM に お い て 差 で 求 め たG6-PDH活 性 に 相 当 し, G6-P 単 独 で 得 られ た 値 をG6-PDH活 性 と して取 扱 うこ と は妥 当 と考 え られ た11). 酵 素 活 性 は 肝 上 清 蛋 白mg当 TPNH2のmμmoleで 肝CCE活 性 の 測定 はSrere12)の い て 検 討 し表2の *: Glucose-6-phosphate•@ **: photometricに 行 な つ た.酵 (注1)肝G6-PDH活 性 の 測 定 に は, Glockお 下6-PG)の 系 でG6-PDHお 6-PGDH活 素 活 性 は12分 間 の吸光 度 の 変 化 か ら求 め,肝 上 清 蛋 白mg当 Glucose-6-phosphate(以 phosphogluconate(以 方 法 を人肝 につ 反 応 組 成 で37℃ に お いてspectro 6-Phosphogluconate 反応速度 を求 めた(注1). Mcleanの10) りの1分 間 に生 じた 表 わ し た. よび 下G6-P)と6両基質 を含む反 応 よ び6-PGDH活 性 の 和 を 求 め た 後, 性 と の 差 を 求 め 真 のG6-PDH活 性 を求 に減 少 したDPNH2のmμmoleで 肝 上 清GPT活 従 つ て37℃ Karmen単 た りの1分 間 表 わ し た. 性 の 測 定 はReitman-Frankel法13)に で 行 な い,肝 上 清 蛋 白mg当 た りの 位 で 表 わ し た, 肝 上 清 の蛋 白量 測 定 に は, Lowry等14)の 方法 を用 い た. Table Assay System 2 測 定 に 用 い たG6-P(Na塩), of Liver CCE Activity (注2), TPN(Na塩), (Na塩)お 6-PG(Ba塩) Co-enzyweA, 製 品 で あ る.又, malic dehydrogenaseは Boehringerの 製 品 を 用 い た. (注2)Na塩 に 変 え て 使 用. 成 績 1) 正 常 者 の肝G6-PDH, びCCE活 DPNH2 よ びATP(Na塩)はSigmaの 6-PGDHお よ 性 肝 機 能 検 査 で 異 常 を 示 さず,且 つ病理組 織 学 的 に も異 常 を 認 め ず 健 常 とみ な され る 5名 の 平 均 値 お よ び 標 準 偏 差 は 表3の 通 り で あ る. *: malic dehydrogenase Water is used Table Activities Human of G6-PDH, Liver as a blank. よ び6-PGDH活 性 に関 して た値 と ほぼ 一 値 して い る15)16)17).人肝CCE 3 6-PGDH G6-PDHお は,人 肝 で 測 定 され た 報 告 が あ り著者の得 and CCE of Normal 活 性 は 食 餌 摂 取 ラ ッ ト肝 の約1/10で 野本等 も同 様 な 値 を 得 て い る18). 2) 肝 疾 患時 の 肝 酵 素 活 性 の変 化 各 病 態 時 酵 素 活 性 の 測定 値 は 図1,お び2に 示 す通 りで,こ 意 水 準 α=0.05に よ れ らの値 につ いて有 お い て 検 定 を 行なつた結 果,急 性 肝 炎(恢復 期)で はG6-PDH, 6-PGDH 肝 疾 患 に お け る 肝Glucose-6-phosphate お よびCCEの dehydrogenase, 有 意 の 活 性 上 昇 を 認 め た.対 て用 い たGPT活 照 とし 性 に は 有 意 の 上 昇 を認 め な か つ た. 他 の 病 態時 で は,い ず れ の 酵 素 に つ い て有 意 の 差 が 6-phosphogluconate 肝 炎(活 動性)γ=0.09,慢 =0 .43,肝 硬 変 γ=0.23で dehydrogenase 性 肝 炎(非 活 動 性)γ あ つ た が,こ れ らの 相 関 係 数 に は有 意 性 は み られ な かつ た. 5) 肝 の 脂 肪 沈 着 の程 度 とG6-PDHお 認 め られ な か つ た. 349 よ びCCE活 性, Fig. Liver Fatty Infiltration 1 肝 の 各 病 態 時 に お け る脂 肪 沈 着 の 程 度 と 肝G6-P and G6-PDH Activity. DHお よ びCCE活 性 の 分 布 を み る と 図1,お よび図 2の 如 くで,い ず れ の酵 素 活 性 と の 間 に も一 定 の傾 向 を 認 め な か つ た. 考 按 肝 は 脂 質 代 謝 の 中 心 的 役 割 を 果 して お り,肝 を 中 心 とす る脂 質 代 謝異 常 は 各 方 面 よ り追求 され て 来 た. 特 に 脂 肪 肝 に お い て そ の 機 序 が あ る程 度 明 らか に さ れ て 来 たが19),ヒ トの 肝 疾 患 経 過 中 に 現 わ れ る肝 の 脂 肪 沈 着3)に つ い て の 機 序 の分 析 に つ い て は か な り The extent of fatty infiltration, microscopic examination, as revealed is divided into the by follo wing four groups. ○: No ◎: Slight ◎: Moderate ●: Marked そ の解 明 に は 非 常 な 困 難 に 遭 遇 して い る. そ こで 著 者 は こ の 問題 の 解 決 の 一 助 と して,肝 の fatty infiltration fatty 脂 酸合 成 を と り あ げ,脂 酸 合 成 亢 進 を 反 映 して 増 加 infiltration fatty す ると い わ れ て い る肝 の 諸 酵 素 活 性 を 測 定 し,病 理 infltration fatty 組 織 学 的 所 見 と の 関連 に お い て 検 討 を 行 な つ た. infiltration Fig. Liver Fatty の 業 積 が あ るに して も,実 際 の 因 果 関 係 は複 雑 で, まず 肝 疾 患 時 の肝G6-PDHお よ び6-PGDH活 性 2 の 動態 は 既 に 報 告 され て い る如 く20),急 性肝 炎 で は and CCE Activity 有 意 の 活 性 上 昇 を 示 した が,活 動 性 慢 性 肝 炎 で は, Infiltration 活 性 の上 昇 が 窺 え る が 有 意 の 上 昇 は み られ な か つ た. ま た,非 活 動 性 慢 性 肝 炎,肝 硬 変,脂 肪 肝 で は,有 意 の 活 性 上 昇 あ る い は 低 下 を 認 め な か つ た. 肝CCE活 性 は 急 性 肝 炎(恢 を 示 して い るが,他 復 期)に 有意の上昇 の 病 態 時 に お い て は 有 意 の活 性 上 昇 も低 下 も認 め な か つ た. 更 に,こ れ らの肝 酵 素 活 性 と各 病 態 時 の 脂 肪 沈 着 の程 度 と の関 係 を検 討 した が,一 定 の 傾 向 は み と め な か つ た.こ ○,◎,◎and●: See 3) 肝G6-PDHと6-PGDH活 the legend to Fig. 1 PDHお 性 の 関連 性 各 病 態時 に お け るG6-PDHと6-PGDHと の相関 係 数 を 求 め ると,急 性 肝 炎(恢 復 期)γ=0.63,慢 性 肝 炎(活 動 性)γ=0.66,慢 γ=0.53,肝 硬 変 γ=0.47で 性 肝 炎(非 の こ とは,各 病 態 時 に お け る高 度 の脂 肪 沈 着 例 の頻 度 は ほ ぼ 同 程 度 で あ るの に反 し, G6よ びCCE活 示 して い る こ と か ら も明 ら かで あ る. 肝G6-PDHお 活 動 性) あ つ た .こ れ らの 相 関 性 は急性期 にのみ有意の上昇 を よ び6-PGDHは 属 し補 酵 素TPNH2を に はTPNH2が 五炭糖 燐酸回路 に 産 生 す る.内 因 性 の脂 肪 合 成 必 要 で あ り,こ れ ら酵 素 と脂 肪 酸 合 係 数 の う ち,活 動性 慢 性 肝 炎 に おい て の み有 意 性 が 成 との 間 に は密 接 な 関 連 が あ る こ とが 報 告 さ れ4), み られ た. 脂 肪 酸 合 成 の亢 進 時 にG6-PDH, 4) 肝G6-PDHとCCE活 性の関連性 各 病 態 時 に お け るG6-PDHとCCE活 性 の相関係 数 を求 め る と,急 性 肝 炎(恢 得 期)γ=0.40,慢 性 6-PGDHの 活性 の 増 加 が み られ る こ と が示 され て い る2).し か し,こ の 回 路 に よ つ て 生 成 され るTPNH2は,量 お よ び生 成 速 度 に お い て 充 分 で は な く21),他 の 酵 素 系(例 え 古 ば, malic enzyme)も 元 関与 して い る もの と も考 え ら れ22),肝 で は む しろ後 者 の 方 炉 重 要 視 さ れ て い る23). 一方 , CCEは 裕 目 的 で,肝 350 の 脂 肪 酸 合 成 を 反 映 して 活 性 変 化 を示す と い わ れ るGlucose-6-phosphate Phosphogluconate ミ トコ ン ドリア外 で のAcetyl-CoA を 生 成 す る こ と に よ り,肝 の 脂 肪 酸 合 成 に 関 与 して avage い る と考 え られ,脂 を 得 た. 肪 酸 合 成 亢 進 と共 に増 加 す る と 1) 報 告 され て い る5)6)7). 著 者 の 成 績 で は,内 因 性 脂 肪 酸 合 成 を 反 映 す る こ dehydrogenase, dehydrogenase,お enzyme活 よ びCitrate 6cle 性を生検肝 組織で測定 し次の成 績 健 常 者 の こ れ ら の 酵 素 活 性 は 次 の 通 り で あ る. G6-PDH: 11.6±3.53 mμmoles/min/mg protein れ らの 肝 酵 素 活 性 は肝 の 脂 肪 沈 着 の程 度 とは 無 関係 6-PGDH: 49.7±7.27 mμmoles/min/mg protein で あ り,肝 疾 患 時 の肝 の 脂 肪 沈 着 に お い て は,肝 CCE: 1.28±0.42 mμmoles/min/mg protein の 脂 肪 酸 合 成 の亢 進 が 主 要 因 を な して い る と は考 え ら れ な い 結 果 を 得 た.或 は,ヒ ト肝 で は これ ら の酵 素 2) 肝G6-PDH, 肝 炎(恢 復 期)に 6-PGDHお と して 用 い たGPT活 の か も知 れず,ま た,急 性 肝 炎(恢 上 昇 を 認 めな か つ た.他 れ た肝G6-PDH, 6-PGDH活 性 の 上 昇 は,他 の 機 序 性 は,急 性 期 に お い て有 意の の病 態時 に お い て は,こ れ らの 酵 素 活性 の 有 意 の変 化 を 認 め な か つ た. 3) 肝 疾 患 時 の 脂 肪 沈 着 の程 度 と,こ れ ら の 酵 素 (例 え ば肝 の再 成 等20))に 関連 して い る の か も しれ な い.こ の点 は 今 後 の解 明 を 必 要 とす る こ とで あ ろ 性 は急 性 お い て 有 意 な上 昇 を 認 め た.対 象 活 性 の 変 動 は,脂 肪 酸 合 成 の状 態 を 反 映 して い な い 復 期)に 認 め ら よ びCCE活 活 性 の 間 に 一 定 の傾 向 を認 め な か つ た. う. 稿 を 終 るに 臨 み,御 指 導 お よび 御 校 閲 を 賜わ つた 武 田和 久 博士 に 深 甚 な る 謝 意 を 表 し ます. 結 語 (本 論 文 の 要 旨は,日 肝疾 患経過 中に現 われ る肝の脂肪沈着 を解明す る 文 1) Recknagel, R. O, Lombardi, 献 In "Methods in Medical Research", Vol. 9, B. and Schotz, Year Book Medical Publishers, Inc. Chicago M. C.: Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med. 104 (1961), p. 35. 12) Srere. P. A.; : 608, 1960. 2) 高 橋 忠 雄.坪 日 消 誌, 61: 井 栄 一; 437, 本 消 化 器 病 学 会 第52回 総会 に おい て 発表 した.) J. Biol. Chem. 243: 2544, 1959. 1964. 3) Lieber,C. S.; Gastroenterology, 45: 760, 1963. 13) Reitman, S.; and Frankel, S.; Amer. J. Clin. Path. 28: 56, 1957. 4) Tepperman, H. M. and Tepperman, J.; Diabetes, 7: 438, 1958. 14) Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A.L. and Randall, R. J.; J. Biol. Chem. 193: 265, 1951. 5) Bhaduri, A. and Srere, P.A.; Biochim. Biophys. Acta, 70: 221, 1963. 6) Kornacker, M.S. and Lowenstein, J. M.; Science, 144: 1027, 1964. 7) Lardy, H. A., Shrago. E., Young, J.W. and Paetkau, V.; Science, 144: 564, 1964. 8) 小 坂 淳 夫,太 15) Glock, J. E. and Mclean, P.; Biochem. J. 56: 171, 1954. 16) Schmidt, E., Schmidt, F. W. and Wildhirt, E.; Klin. Wschr. 36: 280, 1958. 17) Boxer, G.E. and Shonk, C. 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By Yutaka The lst Department KOMOTO of Internal Medicine Okayama University Medical School (Director: Prof. K. Kosaka) Summary The activities of Glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-Phosphogluconate dehydrogenase and Citrate cleavage enzyme, of which increase is known to be associated with an enhanced lipogenesis in experimental animals, were measured in the liver tissues from the patients with liver diseases. 1) The activities of these enzymes were significantly of acute hepatitis, while no significant inactive), liver cirrhosis increased in the convalescent stage changes were found in chronic hepatitis 2) No apparent correlation was found between the activities degree of hepatic fatty infiltration might not play of these enzymes and the in these liver diseases, suggesting that a majar role in fatty change of liver encountered diseases. Alternatively, (active or and fatty liver. the increased enzyme activities alterations associated with hepatic injury. hepatic lipogenesis in the course of the liver might reflect some other metabolic
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