京都バイオ計測プロジェクト 第１回講演会 ＳＰＲイメージングによるアレイ解析 -バイオ計測技術の展開- ２００６．２．１０ 京都リサーチパーク 東洋紡績株式会社 敦賀ﾊﾞｲｵ研究所 ﾊﾞｲｵﾌﾛﾝﾃｨｱﾌﾟﾛｼﾞｪｸﾄ推進室 稲森 和紀 SPRイメージング技術のご紹介 MultiSPRinter R Surface Plasmon Resonance Imaging System Multiple spots Surface Plasmon Resonance Interaction SPRイメージング 解析装置 自動スポッター 2006/2/10 Kyoto 2 SPRイメージング技術の原理 金属膜表面近傍の屈折率に依存 白色光源 CCDカメラ →金属膜厚み（質量）変化 →シグナル変化 プリズム SPRイメージ θ Ligand 金チップ 分子を固定化したスポット Analyte 定常流 サンプルの流れ Label-Free, Real-Time and Multiple Interaction Analysis 2006/2/10 Kyoto 測定対象物質を流した際の、 スポットの明るさの変化を測定 最大96点の同時解析を実現 3 SPRイメージング装置の内部構造 CCD カメラ 白色光源 プリズムとサンプルホルダー 2006/2/10 Kyoto 4 生体分子固定用チップ NH2 NH2 NH2 NH2 構成 NH2 NH2 NH2 NH2 品名 MultiSPRinter® NH2 チップ PEG COOH COOH COOH COOH MultiSPRinter® COOH チップ COOH COOH COOH COOH Au PEG Au 1)架橋剤反応 架橋剤反応による表面官能基の活性化 250-300μlの架橋剤溶液をチップ上に滴下 して反応させる アレイ 2)自動スポッター PEG Au 2006/2/10 Kyoto 5 アプリケーション例のご紹介 解析目的 チップ表面 ①抗体アレイ 抗原蛋白質との相 COOH基 互作用解析 ②DNAアレイ 転写因子との相互 NH2基 作用解析 →マレイミド基 NH2基 ③ペプチドア On-chipリン酸化 レイ 検出 →マレイミド基 リガンド官能基 NH2基 SH基 （末端SH修飾） SH基 （末端Cys残基） 官能基を利用してリガンドを固定化することによりアレイ化 ⇒ 官能基に非依存的な固定化様式によるアレイ化も開発 ④フォトリンカーチップ（上市準備中） 2006/2/10 Kyoto 6 ①抗体アレイによる細胞ライゼート中 の蛋白質との相互作用解析 平成１６年度 経済産業省 地域新生コンソーシアム研究開発事業 「ポストゲノム解析を簡便にする生体試料精密分画キットの開発」の 成果 2006/2/10 Kyoto 7 UV OH OH Cr Mask OH OH OH OH OH OH (a) OH COOH COOH COOH COOH OH 抗体アレイの表面化学の検討 Scheme B Scheme C 0.1 mM HS-PEG-COOH 1 mM : 0.9 mM HS-PEG-OH HS-PEG-COOH S S S S S S 2006/2/10 Kyoto CONH H2N-PEG-OH CONH CONH O O O Antibody COO N EDC/ NHS COO N COOH O (b) OO Au COO N Au COOH OH S S S S S S OH OH COOH OH S S S S S S OH OH Au COOH COOH COOH COOH Au COOH Au 1 mM 11-CDT S S S S S S S S Scheme A 8 lysate (a) 30 KIAA202 KIAA531 25 KIAA656 SPR signal COOH CONH COOH COOH 20 KIAA675 KIAA769 15 KIAA988 Actin 10 Tublin Vimentin 5 SA 0 BLK BGD -5 0 400 800 1200 Time (sec) (b) ブランクスポット(11 -CDT)への非特異 ブランクスポット(11CDT)への非特異 的吸着が極めて多い。バックグラウンド (PEG)への吸着はほとんどみられない (PEG)への吸着はほとんどみられない S S S S (c) 10 KIAA675 KIAA769 KIAA988 Actin 5 Tublin Vimentin 0 SA BLK 0 10 KIAA0769 KIAA0988 Actin Tublin 5 Vimentin SA BLK BGD 0 400 800 1200 -5 1600 0 Time (sec) 400 800 1200 1600 Time (sec) HSHS-PEGPEG-COOHの使用により、非 COOHの使用により、非 特異的吸着を改善。 S S S S S S S S KIAA0202 KIAA0531 KIAA0656 KIAA0675 BGD -5 Au 15 SPR signal KIAA656 OH 15 lysate COOH KIAA202 KIAA531 OH SPR signal 20 CONH lysate COOH COOH COOH CONH Au Au 2006/2/10 Kyoto HSHS-PEGPEG-COOHと COOHとHOHO-PEGPEG-COOHを COOHを 混合して使用し、表面のCOOH 基を減 混合して使用し、表面のCOOH基を減 少させることで、非特異的吸着を低減。 9 抗体固定化条件の検討 40 SPR signal 1.0 mg/ml 0.5 mg/ml 30 0.2 mg/ml 0.1 mg/ml 20 10 0 1 10 100 1000 10000 Concentration (ng/ml) 抗体固定化における抗体溶液の濃度を最適化。ストレプトアビジン(SA)をモデル 蛋白質とした、SA濃度とSPRシグナルの関係。抗体濃度は0.2mg/mlが好ましく、 検出限界は30ng/ml程度だった。 Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H., Anal. Chem., 77, 7115-7121 (2005) 2006/2/10 Kyoto 10 ②DNAアレイによる転写因子解析 MafG 遺伝子配列 平成１６年度 経済産業省 地域新生コンソーシアム研究開発事業 「ポストゲノム解析を簡便にする生体試料精密分画キットの開発」の 成果 2006/2/10 Kyoto 11 DNAアレイ作製の表面化学 PEG surface Bare gold PEG-thiol introduction Photopatterning Step 1 Step 2 SS S S S S S S S Au Step 3 NHS SS S S S S S S S SSS Au MAL MAL MAL Maleimido group introduction 2 NH NH 2 NH 2 NH2 SS S Au Amino group introduction HS UV Photo masking DNA immobilization MAL HS Step 4 SS S S S S S S S DNA Step 5 SS S S S S S S S Au Au Au SSMCC O O N O C R CH2 N R’ O O 2006/2/10 O Kyoto R= , R’= S3O- NHS-PEG-MAL R= (CH2 CH2 O)12 , R’= H 12 リンカーサイズによる固定化DNA-転写因子相互作用解析への影響 ① ss DNA MARE23 12 MARE23：非認識配列 MARE25：認識配列 12 8 MARE23 ② ③ ③ 10 MARE25 MARE25 6 MARE23 4 blank 2 0 (B)NHS-PEG-MAL MafG SPR Signal ① Complement MARE25 MARE25 ③ MafG homodimer (A)SSMCC 10 SPR Signal Complement MARE23 ② ds DNA background ① 8 MARE23 ② MafG MARE25 MARE23 6 4 blank 2 background 0 -2 MARE25 -2 0 1200 2400 3600 4800 6000 0 Time (sec) 1200 2400 3600 4800 6000 Time (sec) シクロヘキサン環を介して固定化されたDNAに、 MafGは非特異的に弱く結合するのみ。 2006/2/10 PEGを介して固定化したMARE25にMafGは強く結 合した。PEGによって固定化した分子にモビリティ を付与できたためと推察。 Kyoto 13 ６種類の遺伝子配列と転写因子(蛋白)の相互作用を評価 5' 3' MARE25 T G C T G A C T C A G C A hOPSIN T G C T G A T T C A G C C hNQO1m A G T T G A C T C A G C A MARE23 C A A T G A C T C A T T G hBglHS4 G G C T G A C T C A C T C mGSTY T G G T G A C A A A G C A 5’-HS-(T)15-CGGAAT(N)13TTACTC-3’ の配列で合成し、相補鎖とアニールした 後、表面に固定化 SPR signal 20 MARE25 hOPSIN hNQO1m MARE23 hBglHS4 mGSTY blank background 15 10 5 0 ６種類のアフィニティカーブが 一度に得られる -5 0 600 1200 1800 2400 3000 Time (sec) Kyo, M., Yamamoto, T., Motohashi, H., et al., Genes Cells, 9, 153-164 (2004) 2006/2/10 Kyoto 14 ③ペプチドアレイによるOn-chip リン酸化検出 P P P Cys Cys Cys Cys P Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys 平成１４年度新エネルギー・産業技術開発機構「ゲノム研究成果 産業利用のための細胞内シグナル網羅的解析技術」による委託 研究 2006/2/10 Kyoto 15 S On-Chipリン酸化検出のストラテジー O H NH HN O NH Biotinylated Zn2L3+ H O HN Phosphate Binding Site P P PKA Cys N ATP Cys Cys Au Streptavidin(SA) N N Zn 2+ 2+ Zn O N N N リン酸の検出に用いた亜鉛キレート剤 （広島大 小池 透教授より提供） anti-SA antibody P P Cys Cys 2006/2/10 Kyoto 16 架橋剤の種類とOn-chipリン酸化検出結果 PKA 30℃, 4hr SPR Imaging (A) NHS-PEG-MAL 1 2 3 4 (C) Array Pattern (B) SSMCC 1 2 3 4 1 2 3 4 A A A 1 2 3 4 B B B 4 1 2 3 (D) Autoradiography 1 2 3 (E) Amino Acid Sequence of Substrate Peptide 4 Kinase Peptide Sequence Comment A Probe 1 PKA CGGLRRASLG-NH2 B Probe 2 PKA CGGLRRAALG-NH2 Probe 3 PKA CGGLRRAS(PO3)LG-NH2 Ser-Phosphorylated Probe 4 blank 2006/2/10 Kyoto Ala-Substituted 17 A 1 2 3 4 5 6 7 8 C 9 10 11 12 A B C D E F G H Ratio of SPR Signal [%] On-chipリン酸化効率の定量化 100 80 60 40 20 0 B 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0 1 2 5 10 20 30 40 60 80 100 - B - 0 1 2 5 10 20 30 40 60 80 100 C 100 - 0 1 2 5 10 20 30 40 60 80 D 80 100 - 0 1 2 5 10 20 30 40 60 E 60 80 100 - 0 1 2 5 10 20 30 40 F 40 60 80 100 - 0 1 2 5 10 20 30 G 30 40 60 80 100 - 0 1 2 5 10 20 H 20 30 40 60 80 100 - 0 1 2 5 10 D リン酸化ペプチド(リン酸化アミノ酸使用)と非リン酸化ペプチ ドを混合比を変えて固定化し、亜鉛キレート剤で検出。混合 比のまま、固定化されていると仮定。 Phosphorylation Ratio [%] 0 1 溶液中で測定した場合、30分で80%のリン酸化効率であったのに 対し、On-Chipでは120分でリン酸化効率20%にて飽和した。 20 40 60 80 Mixture Ratio [%] 100 30 25 20 15 10 5 0 0 50 100 150 200 250 PKA Reaction Time [min] Inamori, K., Kyo, M., Nishiya, Y., Inoue, Y., Sonoda, T., Kinoshita, E., Koike T., Katayama, Y. Anal. Chem., 77, 3979–3985 (2005) 2006/2/10 Kyoto 18 ④フォトリンカーチップ 理化学研究所との共同研究成果 2006/2/10 Kyoto 19 金表面上の光親和型低分子固定化 HS O O O ・光反応性(365nm) O N H CF3 O Photo-linker O Dummy-linker OH Small molecule Photo-linker Dummy-linker SAM Spotting 365nm Au S S S S S S Au 2006/2/10 Kyoto S S S S S S Formation S S S S S S HS H N O ・官能基非依存性 (C-H, C-C, C-N, O-H, N-H結合に割り込んで反応) ・低分子化合物をランダムな方向で固定 O O N＝N Au = アリールジアジリン基 Au 20 低分子固定化の基礎検討 ∼抗体による検出∼ O 研究に使用した低分子化合物 N Ｎ O − − − − − − − O − Ｈ Ｎ O − Ｈ Ｎ Ｎ O − N O Ｈ Ｎ CH3 H O N O O O O HO O ￨￨￨￨ O O O O￨￨￨￨ H 2006/2/10 H Kyoto H - H -Estradiol (EST) O ￨￨￨￨ H CH3 H O CH3 C−CH2OH HO CH3 -- -- H - H O H --- HO Digitoxin (DTN) OH CH3 O H HO H O O￨￨￨￨ ￨￨￨￨ - --- HO CH3 CH3 OH CH3 H H --- O 3 O HO Digoxin (DIG) CH3 HO CH --- HO H Digoxigenin (DXH) O O ￨￨￨￨ --- --- HO CH3 --- --- HO ￨￨￨￨ O ￨￨￨￨ HO CH3 CH3 OH O Cyclosporin A (CsA) CH3 H H N Ｈ Ｎ Ｎ -- HO --- O O OH CH3 OH H O H -- H Corticosterone (CTS) 21 SPRイメージング法による抗体との相互作用検出 30 HCl Anti-CSA 20 CSA DIG SPR signal 10 DTN 0 DXH EST -10 CTS -20 BGD -30 -40 0 600 1200 1800 Time (sec) アレイ作製条件：10mM低分子（６種）スポッティング 測定条件：流速 100μl/min, 抗体濃度 10μg/ml、 Buffer （10 mM HEPES [pH7.2], 150 mM NaCl） 2006/2/10 Kyoto 22 CSA DIG DTN DXH EST CTS Anti-DIG Anti-EST Cyclophilin A Anti-CTS Anti-CSA 固定化した低分子と、それらの抗体の相互作用の観察を行うことができた。 その結果から、低分子が金基板上に固定化されていることを確認できた。 また、CSAとCyclophilin Aの間の蛋白相互作用も観察できた。 紫外線照射しなかったアレイには全く結合がみられなかった(data not shown)。 2006/2/10 Kyoto 23 内分泌かく乱化学物質とエストロゲンレセプター(ER)の結合解析 研究に使用した低分子化合物 O CH3 OH - HO - H H O -Estradiol (EST) HO O O C−CH2OH CH3 H HO C OH CH3 -- Bisphenol-A (bisA) H Hydrocortisone (HCN) CH2CH3 OH CH3 HO CH3 H - --- CH3 - H CH3 C−CH2OH OH H HO H CH3 C=C OH CH3CH2 -- diethylstilbestrol (DES) H O O Aldosterone (ALD) O Testosterone (TSS) CH3 CH3CH2C=C OCH2CH2NCH3 N O 4H-Tamoxifen (4HTXF) Tamoxifen (TXF) 2006/2/10 Kyoto 24 ８種類の低分子化合物とERの相互作用解析 ER 80 nM 35 30 20 EST HCN bisA ALD TSS DES TXF 4HTXF 15 10 5 0 -5 0 600 1200 30 0 SPR signal Time (sec) 1800 ER 80 nM SPR signal 25 ER結合性として知られている低分子で相互作用がみられる。 2006/2/10 Kyoto 25 ER結合データの再現性 40 ER R2 = 0.97 Array 2 30 20 10 0 0 10 20 30 40 Array 1 二つのアレイ間のシグナルを比較。測定毎に絶対値は異なるものの、 高い相関が得られた。 Kanoh, N., Kyo, M., Inamori, K., Ando, A., Asami, A., Nakao, A., Osada, H. Anal. Chem., in press (2006) 2006/2/10 Kyoto 26 ま と め SPRイメージングはハイスループット性に優れた相互作用 解析技術である。様々な生体分子に関する相互作用のマ ルチ解析に際して、非常に有用なツールである。 SPRイメージングにおいては、用いるアレイの金表面化学 の構築が重要である。分析する対象に応じて、それに適し た表面化学、リガンド化合物の固定化方法の選択がポイン トである。 キーとなる金表面の化学修飾技術のバリエーションを揃え ることにより、今後ますますSPRイメージングが広範に利用 されるものと期待される。 2006/2/10 Kyoto 27 謝 SPRイメージング基本技術 カリフォルニア大学 Irvine 辞 On-chipリン酸化検出 九州大学 園田 達彦 井上 雄介 片山 佳樹 Robert M. Corn GWCテクノロジーズ Timothy G. Burland Stephan C. Weibel 大阪大学 立松 黒田 谷澤 転写因子解析 筑波大学 鈴木(山本) 多恵 本橋 ほづみ 大根田 絹子 田中 俊之 山本 雅之 健司 俊一 克行 広島大学 木下 英司 小池 透 2006/2/10 Kyoto 抗体アレイ かずさDNA研究所 薄井（青木） 一恵 古閑 比佐志 低分子アレイ 理化学研究所 叶 直樹 長田 裕之 弊社SPR関係スタッフ 東洋紡 京 基樹 紙谷 光恵 松川 和樹 28 ご清聴有難うございました。 下記サイトにもアクセスして みて下さい。 MultiSPRinter ® Surface Plasmon Resonance Imaging System http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/product_feature/multisprinter/index.html 2006/2/10 Kyoto 29
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