厚生労働科学研究費補助金（健康安全・危機管理対策総合研究事業）レジオネラ検査の標準化及び消毒等に係る公衆浴場等における衛生管理手法に関する研究新しい"euAルプライマーを利用したLegionellapneumop"肱臨床分離株の SBT法による遺伝子型別研究代表者倉文明国立感染症研究所細菌第一部研究分担者前川純子国立感染症研究所細菌第一部研究要旨：レジオネラ症患者に由来する臨床分離株を収集して、SBT(sequence-based typing)法を用いて遺伝子型別を行った。2012年度に収集された臨床分離株は55株（うち2株は同一の集団感染事例に由来する）で､血清群の内訳は血清群lが50株、血清群2，3，5，9，10が各1株だった。臨床分離株55株は41種類の遺伝子型に分けられ、そのうち新規遺伝子型は15種類だった。当初は散発事例と見られていた2 事例の遺伝子型が一致したことから、2事例の関連性が確認できた。 A.研究目的イマーを評価するために、これまで型別不能であった臨床分離株について型別を公衆浴場等の入浴施設において衛生管理が不適切な場合、レジオネラ症例が発行った。生することがある。その際、感染源を確定するにはレジオネラ症患者からの分離 B.研究方法昨年度(2012年度）にレジオネラ・レ株と環境からの分離株の遺伝子型を比較し、同一菌株であるかどうかを確認しなファレンスセンターで収集したL、ければならない。レジオネラ症の起因菌 p"eumop吻加臨床分離株55株(さかのぼっとして最も多いLegionellapne""topﾙ肋のて収集された2010年分離の2株、2011 遺伝子型別法として世界的に普及してい年分離の4株以外は2012年∼2013年に分るSBT法を用いて、収集されたL、離された)、およびそれ以前に収集された p"“"”〃池臨床分離株について、遺伝子型別不能株であったL､p"eumop〃池臨床型別を行った。また、これまで主として分離株10株について、EWGLI(European 血清群I以外の一部の株が型別不能で WorkingGroupforLegionellaInfections)のあったが、それを解消するための新しい方法(http://www.ewgli.org/)に従って、プライマーが提案されたので、そのプラ JlaA、PiﾉE､asd､、わ、耐ompS､proA、〃euA 165 遺伝子の一部の領域の塩基配列に基づくて温泉関連事例であった｡次いで多いST1、型別(SBT)を行い、遺伝子型を決定した ST23(各3株）は国内外で従来からよく 1.2)。今までに収集された臨床分離株のう分離されるSTで、ST1の1例が自宅風呂ち、〃euA遺伝子が従来のプライマーで増と推定されている以外、感染源は不明で幅できない菌株10株（血清群5が7株、ある。ST89も3株分離されたが、国内で血清群2，4，10が各1株）および昨年度は今まで1株しか分離されておらず、地収集分で"euA遺伝子が従来のプライマー域も異なっており、増加した理由は不明で増幅できなかった菌株2株（血清群5，である。他に2株分離されたSTは5種類 10が各1株）については新しく提案されあり、1株ずつのSTは32種類だった。た〃euAh(neuAホモログ）プライマー3) 新規STは15種類あり、EWGLIのデータを用いて、遺伝子座を決定した。7遺伝子ベースに登録され、ST番号が付与されたの遺伝子型が決まった分離株をEWGLI （表1)。のデータベース3)に登録すると､新しい遺 neuA遺伝子が従来のプライマーで増幅伝子型の組み合わせについてはST できない血清群1以外の株(血清群5が8 (sequencetype)番号が付与される。株、血清群10が2株、血清群2，4が各1 株）について、〃euAルプライマーを用いた c.研究結果ところすべて増幅でき、STを得ることが臨床分離株55株は1つの集団感染事例できた（表lのNIIB2915、NIIB2961およ（患者数3名）の2人の患者からの分離び表2)。株を含むため、54事例に由来している。血清群1が50株で､血清群は2，3，5，9、 D.考察 10が各1株ずつだった。感染源が温泉・血清群1のSTは、minimumspanning 公衆浴場などの浴槽水と推定・確定され tree解析により、Bl、B2、B3、CI、C2、ている例が21例(39%)、田・畑作業と SI、S2，S3、Uの9つのグループに大き推定されている例がl例、使用しているく分けられる。環境分離株で見ると、Bl-3 給水タンクの疑い例が1例、旅行後に発のほとんどが浴槽水分離株で、冷却塔水症している例が2例で、29例（54％）は分離株あるいは土壌分離株のほとんどが感染源不明だった。別々の自治体から届それぞれ､Cl-2あるいはSl-3に所属してけられた2株は同時期に同一の公衆浴場いる4)｡今回調べられた血清群lの臨床分を利用しており、同じST(新規ST)で、離株は、集団感染事例の重複を除くと、B 集団感染事例の可能性が示唆された。55 グループ(候補を含む)が18例､Sグルー株は41種類のSTに分けられた。日本固プが19例、Cグループが4例であった。有のSTであるSTBSが4株(集団感染事感染源について、浴槽水（あるいは温泉）例を含むため3事例）と最も多く、すべと推定（あるいは確定）されるのはBグ 166 ループに属する18例中12例であるのにれているものの職業が建設業でそれがリ対し、sグループでは19例中2例に過ぎスクファクターと考えられる例が2例ず有意な差があった(p<0.001)。遺伝子型あった。により、大まかな感染源が推定可能であこれまで血清群5の臨床分離株の多くると考えられた｡Sグループに属する臨床が〃euAが増幅しないために型別不能で分離株で、実際に田・畑作業が感染源とあったが、それは"euAh220を有するため推定されている例や、感染源は不明とさであったことが分かった。〃euAﾙ220は国表12012年度に収集した臨床分離株(55株）血 S T 理境分瞳株との溝（巽甲罰“ 2 醜 4 2 0 1 2 男不明 & . 〃施四竹 … 1 29252012男不明(運転手）L…m…1 2 蛇 8 2 0 1 2 男浴楢水 ( 推定） L … 師 … 2 2 ” 7 を 0 1 2 男不明 L … … 池 1 2 鋤麺 1 2 男不明 L 犀 … 1 2 ” 1 ” 1 2 男浴掻水 ( 推定） L α … 池 1 2 鍾麺 1 2 男謹泉 ( 推定） L 犀 … 1 2 “ 麺 1 2 男田･倒作藁 ( 推定） L … … 1 2 郡 3 和 1 Z 男不明 L … 1 約 “ 麺 1 2 男不明 L 室哩 " 函ﾏ凸も 1 浬5麺12男不明(碑円四座-涜樺型侭の仕事）L癖…1 麺 6 釣 1 3 男不明 ( 運転手） L … … 匙 1 津 7 m 1 2 男不明睡行後） L 犀 … 1 麺 8 範 1 3 男不用 L … 、 … 9 2 9 5 1 m 1 0 男不明 L ” & … 迄 1 2 9 5 2 釣 1 0 男温泉 ( 推定〉 L α 画四 … 池 1 2 9 5 3 2 0 1 2 男温泉 ( 推定） L … … 鞄 1 29542012男浴箇水〈推定.自宅の共問浴唱》L〆晒醗…必1 2 蝿 5 ” 1 2 女不明 L … … 池 1 29562012女湿泉(推定、自宅が迅泉）L卸時凶…必1 2957”12男不調《建般解体痕）L…叩…ぬ1 2 鯛 8 ” 1 2 男不明 L 脚芭 … 池 1 羽592012女自宅、具(推定）Lα睡凶…池1 2 鋤 O m 1 2 男不明 L … … 鞠 1 2 ” 1 鋤 1 3 女不明 L 癖 ” … 5 錘 2 麺 1 3 男不明 L 酎哩 … 迦 1 麺3m11男不明(技術工）L〆噂叩…わI … 鋤 1 1 男不頃 L … " … 当 I 麹 5 麺 1 1 男不甲 f 商選宜》 L … 1 認 7 詞 1 1 男温泉 ( 推定） L … 狸 … I 認9麺12男不明(海外出強.その後ゴルフ）L…均1 2 9 加調 1 2 男不明 L 犀塑 … 幻 1 28鱒麺13男入濡瞳哩(椎皇室2回利用）Lp…一山1 2 9 鴎調 1 2 男不明 L p 何 e 凹嘩 h 均 1 2997麺12男浬泉(鎖団感築.鋤98と同一事例）一敗Lp分e””h均1 2”a”12男塑皇q算穐唾肇.鋤97と同一事例）一致Lp“…h比1 3 噸麺 1 2 男不明 L p “ … h 恥 1 3㈹4麺13男ス鈴ツジム(推定､主ル旗企1才型皇）Lp“”“J1妬1 ” 1 2 麺 1 3 男不明 L p 癖唖 … T 必 I ６６６６９ｍ６１画麺６６６和１池８幅Ⅶ９９６Ⅶ６６６６２６Ⅷ６Ｍ６Ⅱ８２１９麺２２６泊６３１１６２６６川川９郡２ 2 麹を 0 1 2 男不明 ( 醒管王》 L α 輯 … 1 2魂12012男逼果(浴掘水からは検出されず､ろ材からの因とpF唾一致)L……1 2蛇22012男理泉(推定.週1日利用）L醒幽…1 2蛇32012男スーパー銭濁利用(2911と岡一事例）4.”鈍…ぬ1 ７１Ⅱ１４Ⅲ１１９９加胞５Ⅷ９１９Ｗ９９４１脚１１１１１１榔哨４５叫１卿１１９吃１１１４帽１９嘘旧也幡潤Ⅷ４４釣 1 4 鋤 1 2 女不明 L − 3 調 1 5 鋤 1 2 男浴櫓水 ( 温泉〉一敗 L … 1 0 訓２洞油肥鍵２１脚ＭⅧ肥２馳川２叫３脚Ⅱ９釦９２２２２２２打的９鉛而鍋晦１馴幡叩馴２釣４蝿１Ｍ蛇帽帽９４Ｈ９Ⅷ ”12範1Z男給水タンク(権窒=望聾堂、L…1 約 1 3 m 1 2 男不明 L 戸誼 … 1 、Ⅶ、幅３２釦１調６３３胸２１，７５１３６泊川⑩⑩的Ⅱ⑩叩脚３個旧胞旧嘘１㈹６ｎ３旭時脚３１Ｍ咽３３咽犯０６３油11麺12男スーパー鉾垂②虜5自前利用(2923と同一事例）L函…1 喝５ＷⅦ岬Ｗ９３１１ｗ７９ｗ１９１２１Ｍ釦６詞９９５５泊９副７釦９剛川幅３６１Ⅶ６９叩狛訓３１叩７７幅旧１３Ⅳ 錘加 1 2 男不明 L … 1 “,蛭“‘”"…SbhjAOZmiIS騨園じsTの“があ6か旧３０⑩ｎ６３４ｍ咽６姻沌６咽３６１池７他３，３３３３３３泊唯ｍ３ｍｍ脚４３吃８３３ｍｍ“４⑬８吃吃仰６６６認群恥●）釦沌釦 1 2 男缶画葬理泉《推定） L … … 1 2 8 鯛調 1 2 男不明 L 〆 … 1 “ 釦 1 2 男錐塵準塙 ( 推定） L … … 1 麺加 1 2 男坐空港増 ( 推定） L 函 ■ … 1 PF唾６２１４６吃２１３３７㈹２吃３２３咽３４６２６２２２２２２６脚６”６４ｍ１２３吃２２４３７１３４ｍ叩６６３２２橿名卿函加的２唖函１脚惣郡幽旧蝿唖郵鋤岬訓岬麺麺蝿鈎詞動画睡羽卸晒岬伽卿鯛岬１蝿岬埋岬坤的岬岬１岬迦“唖姻岬叩北卯１１１１咽B分敵性番号年嗣感母亜 (B1）錘 S1国内16例ロ.四外 B2鐘 S1国内3倒目、囲外 B1国内3例日．国外2例 (“）鰹 S＄国内2例目 C1画内13例日．国外一四外多.鳳内6例目一国内3例日 B2錐印国内19例日 S1国外(欧州)9例 (B2）国内2例目 U国内5例目.国外1 s1四内9例目一国内3例日、四外10例SQ2 N 鮭 u国内3例日･国外4例 N歳日1国内3例B S1国内3例目 B1国内4例目 S1国内13例目，国外 S1国内16例目､国外 S1田内4例日 S1国内17例目．皿外一国外で1例 S1国内17例目.国外 B1国内.例日 B3国内16例目 B1無 S1画内2例目 81国内4例日 S1国内4例ロ､国外 C2無 C1国内14例日．国外 S1餓一田内4例日(1例はSO10） “国内$例日 S1■ S1国内ID例g S1国内5例目､国外 B1銭 (B刀飯 C1画内15例日.国外 U録 S3国内2例ロ．国外 B3国内17例日 B3国内17例ロ B1国内7例日 B1国内2例日、国外 U国内3 国( 内S 3( GS 1G が1 2 が . 2 s . G s8 Gが 8I がI )) ，、国外(SG6）《B1）無無犯 1 3 麺 1 3 男不明 L p 応 c 凹嘩力幽 l N 無鋤14鋤13男公余浴場(推定）LP姥…1 蛎 ●血澗群1のgTは､両営、師如な函gwe解構により.80.82､B3､C1,唾､S1.壁､S3.uの9つのグループに大きく分けられるが.そのいずれに風するかを毎睡I-たこ Nは､いずれのグループにも固さ嘩いもの.かっこ内に配したのは間をつなぐ国株の発見により今後国する訂瞳墜が高いグループ 167 表2neuAhプライマーを用いたこれまで型別不能だった臨床分離株の型別結果 (nel脚hプライマーを用いた場合の遺伝子座番号は200番台となる｡）不明 L……伽51424 浬泉(推定） L…””紬213別不明 Lα"”“蝿5I531 湿泉(推定） L … 蝿 5 1 4 2 7 入浄監岨 Lα”…蝿5I427 湿泉(推定） L … 極 5 1 4 2 4 不明(膝行） L……101425 不明 L……鐘51413 257 6 4 8 6 4 8 2 8 4 6 1 4 6 1 4 6 1 4 6 4 8 2814 9 5 3 麺麺麺諏麺麺麺麺麺麺 Lp碇…他5I424 咽訓訓４８９９訓９８不明肥訓訓型７１１訓１卿血澗ST(Soauoneo nTypo)ftaAp距口sdmわ厩酎”Spr胡、｡｡戒h同じSTの紐告があるか L”E…蝿4I377 叫吃吃、謹吃瞳吃４０租名不明２測調２咽３３羽３８女女男女男男男男男男卿卿卿唖唾鋤麺趣岬皿唖唖唖岬岬獅癖麺御趣 NuB分離性番号年別唾縫塞国外1例国内国内国外2例(廻境）儲国内図内国内儀国外2例(理境）内固有の遺伝子座である。それ以外の遺ター)、勝川千尋（大阪府立公衆衛生研究伝子座（血清群2，4，5，10の株に由来所)、金津祐子（和歌山市衛生研究所)、する〃euAh206、〃euAh207,〃euAh209)は金谷潤一（富山県衛生研究所)、北川恵美国外でも見られる遺伝子座であった。子（石川県保健環境センター)、小嶋由香（川崎市衛生研究所)、後藤考市（群馬県 E.結論衛生環境研究所)、佐原啓二（静岡県環境 L､pnei""”〃北臨床床分離株55株につ衛生科学研究所)、鈴木匡弘（愛知県衛生いて遺伝子型別を行った。別々の自治体研究所)、鈴木裕（山形県衛生研究所)、から届けられた2株は同時期に同一の公田中忍（神戸市環境保健研究所)、富田隆衆浴場を利用しており、同じST(新規ST) 弘（千葉県衛生研究所)、中嶋洋（岡山で、集団感染事例の可能性が示唆された。県環境保健センター)、長島史子（宇都宮 55株は41種類のSTに分けられ、SBT法市衛生環境試験所）村上光一（福岡県保の疫学的有用性が確認できた。15種類は健環境研究所)、吉田英弘（福岡市保健環新規STだった｡また〃euAルプライマーが境研究所）（敬称略）の諸氏に感謝いたし導入されたことによりほとんどの分離株ます。の遺伝子型別が可能となった。今後も分離株の遺伝子型を調べ、分離株の動向を F. 明らかにしていく必要がある。 1 ) 参考文献 Gaia,V,Fry,NK,Afshar,B,Lack,PC, Meugnier,H,Etienne,J,Peduzzi,R, 謝辞 andHarrison,TG.2005.Consensus 今回解析した分離株を分与くださった sequence-basedschemefor 緒方喜久代（大分県衛生環境研究セン e p i d e m i o l o g i c a l t y p i n g o f c l i n i c a l a n d 168 ） 2 environmentalisolatesofLeg""e比衆浴場等におけるレジオネラ属菌対 p"“加叫ﾌ〃わ.J.Clin・Microbiol. 策を含めた総合的衛生管理手法に関 43:2047-52. する研究」平成22∼平成24年度総 RatzowS,GaiaV,HelbigJH,FryNK, 合研究報告書.研究代表者：倉文明 LuckPC.2007.AdditionofneuA,the ） 3 ） 4 geneencodingN-acylneuraminate G.研究発表 cytidylyltransferase,increasesthe 学会発表 d i s c r i m i n a t o r y a b i l i t y o f t h e c o n s e n s u s JunkoAmemura-Maekawa,MichikoKoyano, sequence-basedschemefortyping ToshioYamazaki,MiyoMurai,Makoto Legionellapne"腕叩ﾌ〃"serogroup1 Ohnishi,andFumiakiKura・Identificationof strains.J.Clin・Microbiol.45:1965-8. L電""ellapne"腕叩版わsubspeciesin h t t p : / / w w w . h p a b i o i n f o r m a t i c s . o r g . u k / c l i n i c a l e n v i r o n m e n t a l i s o l a t e s i n J a p a n u s i n g l e g i o n e l l a / l e g i o n e l l a s b t / p h p / s b t h o m e themicroplateDNA-DNAhybridization page.php method.The8thinternationalconferenceon 厚生労働科学研究費補助金（健康安 Legione"口,MelbourneAustralia,Oct.-Nov., 全･危機管理対策総合研究事業）「公 2013. 169