松仁会医学誌46 （1） ：12∼17，2007 2型糖尿病におけるSmall-dense LDL定量法の臨床的意義 村上由美，江後京子，中島康仁，吉岡敬治* 松下記念病院 中央臨床検査部 *松下記念病院 糖尿病・内分泌科 要旨：2型糖尿病を合併した高コレステロール血症患者における粒子サイズの小さな 比重の重いLDL（Small-dense LDL：以下sd-LDL）の測定意義を検討した．2005年11 月∼2006年9月に当院外来加療中の2型糖尿病を合併した高コレステロール血症患者 36名（男性14名，女性22名，平均年齢58.2±6.9歳）を対象に，sd-LDLを含む脂質濃 度や血糖などの生化学的指標を測定した．sd-LDL は2型糖尿病を合併した高コレス テロール血症患者では健常人の2倍以上の高値を示し，TC，TG，sd-LDL /LDL比， RLP，ALTが正の，HDLが負の相関を示した．sd-LDL 測定値の中央値未満群（以下 低値群）と中央値以上群（以下高値群）での比較では，高値群が低値群に比しTG， sd-LDL /LDL比，RLPが有意に高値であり，HDLが有意に低値であった．この結果 は動脈硬化惹起性リポ蛋白と一致し，sd-LDLも冠動脈疾患のリスクファクターの1つ であることが示唆された． キーワード：small-dense LDL，2型糖尿病，定量法 はじめに に測定結果が定量値でない欠点があった．最近， 新たに自動分析装置を用いた簡便に測定できる定 近年，粒子サイズの小さな比重の重いLDL 量法が開発された７）．今回，このsd-LDL 直接測定 （Small-dense LDL以下sd-LDL）は，冠動脈疾患の キット（研究用試薬）を用いて高コレステロール 発症と関連することが多くの報告により明らかに されており 血症を伴う2型糖尿病での測定意義を検討した． ，冠動脈疾患の新しいリスクファ １−４） クターとして注目されている． 対象および方法 従来のsd-LDL 測定法には超遠心法や電気泳動 法がある．超遠心法は最もスタンダードな方法で， 2005年11月∼2006年9月に当院外来加療中の2型 超遠心機を用いて血清中のsd-LDLにあたる比重分 糖尿病を合併した高コレステロール血症患者のう 画を分取し，分画中のコレステロールを測定する ち，書面にて本研究に対する同意を得た36名（男 方法である５）．しかしこの方法では少数の検体し 性14名，女性22名，平均年齢58.2±6.9歳）を対象 か処理できず，測定に長時間を要する．電気泳動 とした．被験者の採血は空腹時に肘静脈より真空 法はグラディエントゲルを用いて電気泳動，染色 採血管を用いて行った．Small-dense LDLコレス を行いLDL粒子サイズを測定する方法である ６）． テロール（sd-LDL）：［sd-LDL-C「生研」試験研 この方法も超遠心法と同様に長時間を要し，さら 究用試薬，デンカ生研株式会社，東京］を測定し， 2007年1月17日受付 連絡先：〒570-8540 守口市外島町5-55 松下記念病院中央臨床検査部（村上由美） コレステロール（TC），中性脂肪（TG），HDLコ 空腹時血糖（FPG），空腹時インスリン（IRI），総 レステロール（HDL），レムナントコレステロー 13 Small-dense LDL定量法 ル（RLP），高分子アディポネクチン（高分子）： ［高分子量アディポネクチンELISAキット，富士レ ビ オ 株 式 会 社 ， 東 京 ］， 総 ア デ ィ ポ ネ ク チ ン （37℃10分間）後に，遠心分離する．この操作よ り，VLDL，L - LDLなどは凝集物となって沈殿し， 反応系より除去される（分離処理：用手法）． （Adipo）：［ヒトアディポネクチンELISAキット， ステップ②ではVLDL，L - LDL除去後のsd - LDL 大塚製薬株式会社，東京］， AST，ALT，γGT， とHDLを含む検体液（上清）に，専用の測定試薬 CK，UA，CRP，HbA1cとの関連を検討した．な を作用させる．検体中のHDLコレステロールは， お，LDLコレステロール（LDL）はFriedewaldの 酵素液 - 1中の界面活性剤とコレステロールエステ 式（Ｆ式）を用いて［TC（mg/dL）］−［HDL ラーゼ，コレステロールオキシダーゼ，カタラー （mg/dL）］−［TG（mg/dL）］÷5より算出し， ゼの酵素作用により水に分解される．次に酵素 homeostasis model assessment指数（HOMA-R） 液 - 2を作用させると，sd - LDL 中のコレステロー は［FPG（mg/dL）］×［ I R I（μU/mL）］÷405よ ルは第一反応と異なる界面活性剤とコレステロー り算出，高分子アディポネクチン/総アディポネ ルエステラーゼ，コレステロールオキシダーゼの クチン比（高分子/Ad比）は［高分子アディポネ 酵素作用を受けて過酸化水素を生じる．生成した クチン（μg/mL）］÷［総アディポネクチン（μ 過酸化水素はPODの作用により，定量的に4 - AA g/mL）］×100より算出，sd-LDL/LDL比（sd-LDL とTOOSとを酸化縮合させ，キノン色素となる． 比）は［sd-LDL（mg/dL）］÷［LDL（mg/dL）］× このキノン色素を吸光度測定することによりsd- 100より算出した． LDLコレステロール濃度を求める．この反応は汎 用の自動分析装置での対応が可能である． Small-dense LDL定量法 統計解析 sd-LDL 測定には，sd-LDL-C「生研」試験研究 用試薬（デンカ生研株式会社，東京）および測定 統計解析はWindows日本語版 SPSS （SPSS 装置日立7700形自動分析装置（株式会社日立ハイ Japan Inc，東京）を用いた．数値は平均値±標準 テクノロジーズ，東京）を用いた．本手法の反応 偏差で示し，2群間の差はMann-Whitney検定を用 原理は，分離剤を用いてsd-LDLとLDL性状サイズ いた．いずれもP<0.05をもって有意水準とした． 以上（L - LDL）の分離操作を行った後，sd - LDL 結果 中のコレステロール量を測定する2ステップから なる（図1）． ステップ①ではポリアニオンと2価の陽イオン からなる分離液と検体を混合し，一定時間反応 ステップ−1 常人ボランティア13人（平均年齢：37.54±8.36歳） ステップ−2 sd - LDLコレステロールの測定 R- 1反応 HDL中のコレステロールの消去 ポリアニオンと2価陽イオン分離剤による L - LDLとsd-LDLの分離 上清部分 sd-LDL, HDL 検体 分離剤 まず，本法における糖尿病，高脂血症のない健 コレステロールエステラーゼ コレステリン+H2 O2 コレステロールオキシダーゼ 37℃ 遠心分離 H2 O2 カタラーゼ 2H2 O+O2 10分 沈殿部分 L-LDL他 R-2反応 sd - LDLコレステロールの測定 コレステロールエステラーゼ コレステロールオキシダーゼ H2O2 図1 sd-LDL定量法の測定原理 ペルオキシダーゼ コレステリン+H2 O2 キノン色素 14 村 上 由 美 ほか 表1 患者背景およびsd-LDLと生化学的指標の相関関係 検査項目 男性 年齢(years) N=14 55.9±6.7 γ −0.316 p value 0.271 N=22 59.6±6.9 TC(mg/dL) 243.1±33.9 0.548 0.042 TG(mg/dL) 160.0±177.6 0.454 0.103 HDL(mg/dL) 60.4±19.7 −0.528 LDL(mg/dL) 146.4±50.9 sd-LDL比(%) 女性 γ −0.092 p value 0.683 258.7±49.7 0.403 0.063 124.5±59.9 0.671 0.001 0.052 61.3±16.7 −0.203 0.365 0.255 0.401 172.5±33.9 0.395 0.069 34.4±10.6 0.855 ＜0.001 31.6±13.1 0.859 ＜0.001 RLP(mg/dL) 8.29±9.84 0.407 0.168 6.37±3.01 0.553 0.009 CRP(mg/dL) 0.078±0.078 0.295 0.327 0.075±0.080 −0.006 0.983 FPG(mg/dL) 136.4±41.0 0.483 0.095 128.1±34.3 0.033 0.884 HbAlc(%) 6.9±1.0 0.270 0.350 7.0±1.0 0.024 0.919 IRI(μU/mL) 6.6±4.0 0.751 0.032 5.6±3.3 −0.131 0.642 2.26±1.41 0.498 0.209 1.79±1.36 −0.266 0.338 0.146 0.618 90.4±51.2 −0.292 0.187 HOMA-R CK(IU/L) 140.5±50.2 ＊ AST(IU/L) 25.1±6.6 0.127 0.666 22.7±5.9 −0.004 0.986 ALT(IU/L) 29.5±13.2 0.507 0.064 23.8±9.7 0.215 0.337 γGT(IU/L) 51.4±42.6 0.412 0.143 31.2±22.1 −0.203 0.365 UA(mg/dL) BMI(kg/g) 5.7±1.0 −0.041 0.888 5.0±0.9 −0.012 0.957 23.2±3.6 0.360 0.250 23.4±2.3 0.145 0.531 Adipo(μg/mL) 6.45±3.32 ＊ −0.221 0.447 9.79±5.13 −0.140 0.534 高分子(μg/mL) 3.21±2.062 −0.331 0.248 5.7±3.8 −0.147 0.515 高分子/Ad比(%) 46.4±14.1 −0.378 0.183 53.8±12.9 −0.114 0.613 sd-LDL(mg/dL) 57.0±21.6 54.0±23.5 ＊Mann– Whitney検定，ｐ＜0.05 sd-LDL比=sd-LDL/LDL（%）；Adipo=総アディポネクチン；高分子=高分子アディポネクチン； 高分子/Ad比=高分子アディポネクチン/総アディポネクチン （%） のsd - LDLの平均値は16.8 ±8.45mg/dLであった． 患者背景を表1に示す．男性14名，女性22名， 高値群と低値群の間には有意差は認めなかった． さらに低値群と高値群を従属変数とした多重ロジ 平均年齢58.2±6.9歳，sd-LDL は55.2±22.5 mg/ スティック回帰分析では有意な独立変数は採択さ dLであり，性差を認めた項目は，CK，Adipoであっ れなかったがHDLはP=0.051と独立してsd-LDLに た．sd - LDLはTC，TG，sd - LDL比，RLP，ALTと 関連している傾向が示された（表3）． 正の，HDLと負の相関を示した．また男女別では， 男女ともsd-LDL比はsd-LDLと有意な正相関を認 考察 め，男性ではTC，IRIが女性ではTG，RLPが有意 な正相関を認めた（表1）．またsd - LDLを従属変 sd - LDLは①平均粒子径は255Å（25.5 nm以下） 数とした重回帰分析では，TC，TG，HDL，sd - で比重は1.044∼1.063である．②生体内の生成機 LDL比，ALTが有意な独立変数として採択された 序は明確にされていないが，TGの上昇がLDLの小 （表2）． この集団のsd-LDL測定値の中央値（55 mg/dL） 粒子化に最も密接に関連している．③sd - LDLは アポBに構造的な変化があり，LDL受容体との結 で2群に分けると，sd - LDL中央値未満群（以下低 合親和性が低い．そのため血中停滞時間が長い． 値群）は20名（男性7名，女性13名），sd - LDL中 ④酸化変性を防止するビタミンEやユビキノール 央値以上群（以下高値群）は16名（男性7名，女 10に乏しく酸化を受けやすい．⑤小型であるため 性9名）となった．高値群が低値群に比しTG，sd - 物理的に血管内皮下に潜り込みマクロファージに LDL比，RLP，ALTが有意に高値であり，HDLが 貧食されやすい３,８）．このように，sd - LDLはプラー 有意に低値であった（図2）．その他の測定項目は ク形成の材料そのもので，超悪玉コレステロール 15 Small-dense LDL定量法 P＜0.001 P＜0.001 P＝0.02 400 100 300 75 H D L T G 200 60 s d 40 │ L D L 20 比 50 100 25 0 0 0 低値群 高値群 低値群 高値群 低値群 高値群 P＝0.049 P＜0.001 20 50 15 R L 10 P A 30 L T 20 5 10 40 0 0 低値群 低値群 高値群 高値群 図2 sd-LDL低値群と高値群の比較 低値群=sd-LDL中央値未満群（55mg/dL未満）；高値群=sd-LDL中央値以上群（55mg/dL以上） 高値群が低値群に比しTG（mg/dL）， sd-LDL比（%） ， RLP（mg/dL）， ALT（IU/L）が高値 を示し， HDL（mg/dL）が低値を示した． である．今回，検討した2型糖尿病患者において 因果関係が明らかなLDLが高値を呈しなくても心 sd - LDLの平均値は55 mg/dLと健常人の2倍以上の 筋梗塞の発症が見られ，LDLの評価は量（定量） 高値を示し，TC，TG，sd - LDL比，RLP，ALTが のみでなく質（サイズ）での評価が重要である８） 正の，HDLが負の相関を示した．この結果は従来 ことと一致する結果となった． から報告されている LDLサイズと血中TGレベル 今回，検討した2型糖尿病患者においてsd - LDL との強い相関と同様，sd - LDLもTGレベルとの間 測定値の中央値（55 mg/dL）で2群に分けた低値 には極めて強い相関が認められることが確認でき 群と高値群の関係は，高値群が低値群に比しTG， た．またsd - LDLはLDLと相関関係は見られず， sd - LDL比，RLP，ALTが有意に高値であり，HDL sd - LDL比と相関関係が認められた．このことは， が有意に低値であった． ９） sd - LDLを絶対値のみで評価するよりもsd - LDL比 動脈硬化惹起性リポ蛋白は，高トリグリセリド で評価したほうが，臨床的な有用性が高くなると 血症，それに伴い高レムナント蛋白の増加，アポ 考えられる．これは以前から心筋梗塞の発症との Bの増加，小粒子LDL，さらに低HDL血症を示す10，11）． 表2 sd-LDLを目的変数とした重回帰分析結果 表3 sd-LDLの低高値群を目的変数とした 多重ロジスティック回帰分析結果 β ｔ ｐ TC（mg/dL） 17 18.05 ＜0.001 TG（mg/dL） 0.019 -1.339 0.019 HDL（mg/dL） 0.047 -6.42 ＜0.001 sd-LDL比（%） 0.061 26.492 ALT（IU/L） 0.047 RLP（mg/dL） 0.319 sd - LDL比=sd - LDL/LDL（%） β ｔ ｐ TC（mg/dL） 0.063 1.661 0.097 TG（mg/dL） 0.023 0.366 0.715 ＜0.001 HDL（mg/dL） 0.139 1.949 0.051 3.756 0.001 RLP（mg/dL） 0.456 1.102 0.270 -1.813 0.082 ALT（IU/L） 0.166 1.671 0.095 低値群：sd-LDL 55mg/dL未満＝0；高値群：sd-LDL55mg/dL以上＝1 HDLが独立してsd-LDLに関係している傾向が示された． 16 村 上 由 美 ほか sd - LDL高値群はこれら動脈硬化惹起性リポ蛋白 と相関したことは，sd - LDLも冠動脈疾患のリス クファクターの1つであることを示している． human serum. J Clin Invest 1995; 34: 13451353. 06）Nichols AV，Krauss RM，Musliner TA． さらに最近注目されているメタボリックシンド Nondenaturing polyacrylamide gradient gel ロームでは，腹囲が男性で85cm，女性で90cmを electrophoresis．Methods Enzymol 1986; 128: 越えることが必須であり，その他高脂血症（高ト リグリセリド血症，低HDL血症）高血圧，空腹時 417-431. 07）伊 藤 康 樹 ， 平 野 勉 ， 山 崎 純 一 ， 他 ． 高血糖のうち2つ以上該当するもの（2つ以上のリ Small,denseLDL測定法−測定系の開発および スクファクター）と定義されている12）．このメタ 臨床的意義−．臨病理 2004；52：406-413． ボリックシンドロームの日本の診断基準において 08）芳野 原，平野 勉，鹿住 敏．Atherogenic の脂質代謝異常とsd - LDLは相関があり，特にTG lipoproteinの重要性：（3）Small,denseLDL．最 よりもHDLとの関連性が示された．今後，メタボ 新医学別冊．高脂血症 2003；108-119． リックシンドロームとsd - LDL値との関連や，各 09）平野 勉．新しいSmall,denseLDL定量法．日 リスクファクターごとにおけるsd - LDLの関連性 を検討する必要がある． 臨検自動化会誌 2004；29：81-87． 10）山本仁至，泉田太郎，井上郁夫，他．メタボ リックシンドロームにおけるAdiponectin, まとめ ApoB48の臨床的意義−日本のメタボリック シンドローム診断基準を用いた検討−．糖尿 2型糖尿病やインスリン抵抗性ではLDLが小粒 子化することは報告されているが，今回の検討に 病 2006；49：699-706． 11）藤岡由夫．メタボリックシンドロームと高ト よりsd - LDL濃度も増加することが確認された． リグリセリド血症．内分泌糖尿病 2005；21： さらに今回の検査法は簡便に定量でき，冠動脈疾 92-97． 患のリスクファクター評価法の1つとして，臨床 現場で有用となる可能性が期待できる． 12）メタボリックシンドローム診断基準検討委員 会．メタボリックシンドロームの定義と診断 基準．日内会誌 2005；94：794-809. 文献 01）Nakamura T, Tokunaga K, Simomura I, et al． Contribution of visceral fat accumulation to the development of coronary artery disease in nonobese men. Atherosclerosis 1994; 107: 239-246. 02）石神眞人，中村 正，松澤佑次．内臓脂肪症候 群における脂質代謝異常．日臨 2002；60： 868-874． 03）中谷矩章．動脈硬化惹起性病態としての高ト リグリセリド血症．日臨 2002；60：860-867． 04）Sniderman AD, Wolfson C, Teng B, et al. Association of hyperapobeta-lipoproteinemia with endogenous hypertriglyceridemia and atherosclerosis．Ann Intern Med 1982; 97: 833-839. 05）Havel RJ， Eder HA， Bragdon JH． The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in Small-dense LDL定量法 17 Clinical Study of the Quantification of Serum Small-Dense LDL in Patients with Type 2 Diabetes Yumi Murakami, Kyoko Ego, Yasuhito Nakajima and Keiji Yoshioka* Central Laboratory, Matsushita Memorial Hospital, Department of Diabetes and Endocrinology, Matsushita Memorial Hospital* We studied the quantification of serum small-dense LDL (sd-LDL) in patients with hypercholesterolemia and type 2 diabetes. A total of 36 patients (male 14 and female 22, mean age 58.2 ± 6.9 years) who attended our outpatient diabetic clinic between November 2005 and September 2006 were enrolled. We quantified serum sd-LDL levels and measured other biochemical parameters including fasting glucose levels and lipids. The results showed that serum sd-LDL levels in patients with hypercholesterolemia and type 2 diabetes were two-fold higher than those in healthy subjects. The sd-LDL levels were positively correlated with total cholesterol, triglyceride, sd-LDL to LDL ratio, remnant lipoprotein and ALT, but negatively with HDL-cholesterol. Patients whose sd-LDL levels were over the median levels had significantly higher levels of triglyceride, sd-LDL to LDL ratio, remnant lipoprotein, but lower levels of HDL-cholesterol than those whose sd-LDL levels were below median levels. These results suggest that sdLDL is one of the risk factors for coronary artery disease as an atherogenic lipoprotein as well as other conventional lipoproteins. Key words: Small-dense LDL, Type 2 diabetes, Quantification
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