1367 原 著 ビ オ チ ン化 水 痘 ・帯 状 痕 疹 ウイ ル ス(VZV)DNAを In Situ Hybridization法 用いた に よ る帯 状 疱 疹 皮 疹 部 塗 抹 標 本 のVZV DNAの 検出 慶 大皮 膚 科,北 里 研 皮 膚科 高 橋 慎 一 北 里 大検 査 セ ン ター 和 Key words : 山 行 正 (平 成1年12月28日 受 付) (平 成2年4月9日 受 理) in situ hybridization, VZV DNA, biotinylated smear cells, Herpes zoster 要 帯 状 疱 疹 皮 疹 部 塗 抹 標 本 の ピ オ チ ン化DNAプ DNA probe , 旨 ロ ー ブ を 用 い たin situ hybridization(ISH)法 の有 用 性 に つ い て 検 討 し た. ま ず,水 疱 帯 状 疱 疹 ウ イ ル ス(VZV)お よ る染 色 を 行 っ た.VZV感 よ び そ の 他 の ヘ ル ペ ス の 感 染 培 養 細 胞 を 基 質 と し てISH法 に 染 細 胞 の み に 染 色 が 認 め られ,他 の 感 染 細 胞 で は 全 く染 色 が 認 め られ ず ,特 異 性 の 高 い 検 査 法 で あ る こ と が 確 認 さ れ た. 次 に 北 里 研 究 所 病 院 を 受 診 した 帯 状 疱 疹 患 者19人 の 皮 疹 部 よ り塗 抹 標 本 を 作 製 し,ISH法 を施 行 し た,19例35検 体 の うち30検 体 で 陽 性 で,特 に 水 庖 期 で は100%の 検 出 率 で あ っ た .ま た,血 疱 ・膿 疱 期, 潰 瘍 ・痂 皮 期 で は,検 体 で は,ウ 出 率 は そ れ ぞ れ75%,77.6%で イ ル ス 分 離16検 体,ISH法18検 あ っ た.さ 体 陽 性 で,分 患 者 の 塗 抹 標 本 で は 全 検 体 で 陰 性 で あ った.本 ら に 同 時 に ウ イ ル ス分 離 を 行 った19検 離 法 に 比 して 感 度 が 高 か った .ま た,単 純 疱 疹 法 は 全 操 作 時 間1時 間 あ ま りで,簡 便 で,特 異 性,感 度 も高 く,水 疱 帯 状 疱 疹 ウ イ ル ス感 染 症 の 迅 速 診 断 法 と し て 有 用 と考 え られ た . 従 来 の ヘ ル ペ ス ウイ ル ス 感 染 症 の検 査 法 に は ウ イ ル ス分 離,同 定 や ウイ ル ス抗 体 価 検 査 が 行 わ れ ウイ ル ス 同 定 法 が 開 発 さ れ て きて お り,単 純 ヘ ル ペ ス ウイ ル ス(以 下HSVと て い るが,前 者 は 結 果 が 出 る まで 最 低 数 日か か る オ チ ン化DNAプ こ とや,後 者 は,初 感 染 以 外 で は 必 ず し もそ の 診 れ,そ 断 に有 用 で な い場 合 が あ り,ま た ペ ア ー血 清 の 検 略 す)で は,す で に ビ ロ ー ブ に よ る キ ッ トも 使 用 さ の有 用 性 も確 認 され て い る1). また,水 痘 ・帯 状 疱 疹 ウ イ ル ス に つ い て も,最 査 で 判 定 す るた め診 断 確 定 に 時 間 が か か る とい う 近,本 藤 らは ビ オ チ ン化VZV 欠 点 が あ る. い たISH法 近 年,塗 抹 標 本 の蛍 光 抗 体 法 やin zation法(以 別 刷請 求 先: 下ISHと (〒108)港 ロー ブを 用 を 応 用 し,感 染 培 養 細 胞 お よ び剖 検 固 situ hybridi- 定 標 本 を 染 色 し 良 好 な 結 果 を 得 て い る2).今 回 略 す)に よる迅 速 で 簡 便 な 我 々 は,こ れ らの 方 法 を 改 良 し,帯 状 疱 疹 患 者 の 皮 疹 の 塗 抹 標 本 に ビオ チ ン 化 したVZV 区 白金5-9-1 北 里 大 学検 査 セ ン ター 平 成2年11月20日 DNAプ 和山 行正 ロー ブを 用 いたISH法 DNAプ を 行 な った と こ ろ,迅 速, 高橋 1368 ン100含 有PBSで 簡 便 で か つ 良 好 な 結 果 が 得 ら れ た の で 報 告 す る. 対 象 peroxidase 瘍 ・痂 皮 期9例)お 疱 ・膿 疱 期 よ び 単 純 疱 疹2例 に カ ー ボ ナ イ トお よ びH2O2を 結 帯 状 疱 疹11例19検 肺 細 胞(以 ∼7日 (1) ウ イル ス分 離 り綿 棒 で 擦 過,培 体 に つ い て皮 膚 粘 膜 病 巣 部 よ 養 液 中 に て よ く撹 拌 後 ヒ ト胎 児 下HEL細 胞 と略 す)に 接 種 し た.3 以 上 の 継 代 培 養 を 繰 り返 し,細 変 性 効 果 の 有 無 を 確 認 し た.細 buffered saline(以 心 後,少 下PBSと 胞 法)を HSV, CMV感 染HEL細 胞 の蛍 光 抗VZVモ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 に よ る蛍 光 抗 体 法 染 細 胞 で は一 部 の細 胞 で 一 方HSV感 た.サ 染 細 胞 で は 全 く認 め ら れ な か っ イ ト メ ガ ロ ウ イ ル ス(以 下CMVと 略 す) 量 の 略 す)に 浮 游 さ せ ス ポ ッ ト標 本 を 無 蛍 光 ス ラ イ ドに2枚 成 し 以 下 の ウ イ ル ス 同 定(蛍 VZV, 果 緑 色 の 蛍 光 を 発 し て い た(Fig.1). 胞変性 効果の認 め ら れ た も の は ト リ プ シ ン 処 理 し,遠 Phosphate 行 な っ 抗 体 法 お よ びISH法 の 染 色 に お い て,VZV感 毎 に 継 代 培 養 を 繰 り返 し ,早 い も の で2代, 遅 い も の で10代 加 え15分 反 応 さ せ, 洗 浄 後 対 比 染 色 と し て ラ イ ト染 色 を1分 方法 (1) つ く っ た. セ テ ー トバ ッ フ ァ ー に ア ミ ノ エ チ ル た. つ い て 以 下 の 検 索 を 行 な っ た. 2. complexを (HRP)のcomplexを 洗 浄 後,ア 北 里 研 究 所 病 院 を 受 診 し た 帯 状 疱 疹 患 老19例 (そ の 臨 床 病 期 の 内 訳 は 水 疱 期14例,血 12例,潰 洗 浄 後,Detection 15分 反 応 さ せ ア ビ チ ン ・ビ オ チ ン ・Horse-radish- 対 象 と方 法 1. 慎一 他 Fig. 1 作 Direct VZV-infected immunofluorescent HEL cells staining using monoclonal of anti- bodies. 光 抗 体 法 お よ びISH 行 な っ た. (2) 塗 抹 標 本 の 作 製 全 例 で,水 底 を,潰 疱 ・血 疱 で は 疱 蓋 を 切 開 し そ の 水 疱 瘍 で は 潰 瘍 底 を 綿 棒 で 擦 過 し,ス グ ラ ス 上 に 塗 抹,風 (3) ライ ド 乾 し た. 蛍光抗体法 ア セ トン 固 定10分 後,旭 メ デ ィ カ ル の 水 痘 ・帯 状 疱 疹 ウ イ ル ス(以 下VZVと ル 抗 体 を30分 作 用 さ せ,PBSで 略 す)モ ノ ク ロー ナ 洗浄後 蛍光顕微鏡 で 観 察 した. (4) In situ hybridization法 A. プ ロ ー ブの 作 成 Fig. 2 In HEL cells hyubridization with biotinylated of VZV-infected VZV DNA probe 東 京 大 学 医 科 学 研 究 所 本 藤 良 博 士 よ り供 与 され た 水 痘 ・帯 状 疱 疹 ウ イ ル スDNA EcoRI-B, H断 片 の ビ オ チ ン 化 プ ロ ー ブ は,ENZO社 の タ ー ミナ ル ラ ベ リ ン グ シ ス テ ム を 用 い3'-OH末 端 に ビオ チ ン を 標 識 し た2). B. 染 色 次 に 固 定 標 本 に プ ロ ー ブ を 滴 下 し,カ ス を の せ,ヒ 熱 後,室 PBS液 バ ーグ ラ ー テ ィ ン グ ブ ロ ッ ク 上 で92℃3分 温 で10分 静 置 し,フ 加 ォル ム ア ミ ド含 有 を の せ さ ら に10分 静 置 し た.0.1%ト リ ト 感 染 症 学 雑誌 第64巻 第11号 塗 抹 標 本 に お け るIn Situ Hybridization法 1369 感 染 細 胞 や ウ イル ス非 感 染 細 胞 に お い て も同 様 に 検 出 感 度 が 高 い と考 え られ た(Table1).ま 染 色 され な か った.ISH法 状 疱 疹19例35検 で は,VZV感 染細 胞 で は 多 数 の 細 胞 に 赤 褐 色 の顆 粒 状 の 染 色 が 認 め られ た(Fig.2).し か しHSV感 染 色 は 全 く認 め られ ず,他 染 細 胞 で は赤 褐 色 の のCMV感 染細胞 や ウ イ ル ス 非 感 染 細 胞 も同 様 で あ っ た(Fig.3). 細 胞 内 に 赤 褐 色 の頼 粒 状 の 染 色 が 認 め られ る も の は 陽 性 と した,し か し,一 部 の症 例 で は,穎 粒 陽性 であ っ た.一 方 単 純 疱 疹 患 者 で は 全 検 体 で 陰 性 で あ っ た . ISH法 お よび ウイル ス 分離 と帯状 疱疹 の臨 床 病 期 と の 関 係 に つ い て,皮 期,血 (2) 帯 状 疱 疹 患 者 の 皮 疹 部 塗 抹 標 本 のISH法 体 中30検 体,85.7%に た帯 疱 ・膿 疱 期,潰 (Table2). ISH法 疹 の 性 状 に よ り,水 瘍 ・痂 皮 期 に わ け 集 計 し た で は 水 疱 期 は100.0%と 出 率 が 高 く,血 疱 ・膿 疱 期 で75.0%,潰 期 で は77.8%と 検 出 率 が 低 下 し た.ま 最 も検 瘍 ・痂 皮 た,表 のよ 状 で な く,び ま ん性 に 淡 く染 色 さ れ て い た(Fig. 4).一 た.こ 方 全 く染 色 の 認 め られ な い も の は 陰 性 と し れ らの結 果 を ま とめ る と,同 時 に ウ イル ス Table 1 Comparison of virus and in situ hybridization isolation of VZV with DNA probes 分 離 を 行 な った19検 体 で は 分 離 陽 性16検 体 分 離 陰 性3検 Fig. 3 体 で,ISH法18検 体 陽 性 でISH法 In situ hybridization cells with biotinylated はよ り of HSV-infected VZV DNA HEL probe Table 2 Comparison isolation the various Fig. 4 (1), (2) Detection (1) 平 成2年11月20日 of VZV DNA in the smear of the sensitivity and hybridization with stage cells by in situ hybridization (2) 疱 VZV of virus DNA in 高橋 1370 慎一 他 うに 水 疱 期 お よ び潰 瘍 ・痂 皮 期 で は ウ イル ス分 離 感 染 で は,塗 抹 標 本 で の比 較 で,有 用 性 が 確 認 さ に比 し検 出率 が よ り高 か った. れ て お り1),ウ イ ル ス感 染 の 診 断 に 有 力 な方 法 と 考 案 考 え られ る.今 後 こ の点 に つ い て も検 討 す る予 定 近 年,ウ イル ス感 染 症 の 診 断 や 研 究 にISH法 が で あ る. 文 取 り入 れ られ て きて い る.当 初 は放 射 性 同 位 元 素 標 識 プ ロ ー ブ を 用 い る方 法 が 主 流 で あ った が3), ビオ チ ン な どの 非 放 射 性 同 位 元 素 を用 い る方 法 が 開 発 され4)5),単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス な どで は簡 便 な検 査 法 と して 応 用 さ れ て い る6).今 回 我 々 は こ の 方 法 を 用 い て 帯 状 疱 疹 皮 疹 部 のISH法 を行 Comvirus som- の ヘ ル ペ ス ウイ ル の 比 較 に お い て,今 回 用 い た プ ロー ブ の フ ィル タ ー上 で の特 異 性 が 高 い こ とが 既 に本 藤 1985. R., Yogo, Y., Kurata, tured cells RNA ロー ブ に 色 が 認 め られ,特 異 性 が 高 い こ とが 確 認 さ れ た. 皮 疹 部 塗 抹 標 本 のISH法 に お い て は,ウ イ ル ス 分 離 と本 法 を 比 較 す る と,本 法 は よ り感 度 高 く検 出 で きた.ま た,ISH法 お よ び ウ イル ス分 離 と も tissue virus specimens J.: in human 265-268, Detection sensory 4) Langer, P.R., Enzymatic probes. 1981. : Novel Proc. 5) Beckmann, Natl. A.M., A.A. and の こ とは,病 期 の 進 行 お よ び lomavirus DNA in human 本 法 は全 操 作 時 間1時 間 あ ま りで 簡 便 な方 法 で 染 症 の 迅 速 検 査 法 と して 有 用 で あ る と考 え られ た.今 回,塗 抹 標 本 の 蛍 光 抗 体 法 と の M. & simplex 95 : N.B., Fenglio, in situ hybridization probes. J. Med. Virol., 6) Forghani, B., Dupuis, in human brain tissue acid affinity D., Daling, J.R., of human J.K. : papil- genital condylomas with bioinylated 16 : 265-273, 1985. K.W. & Schmidt, of herpes J. Clih. Microbiol., D.C. : polynu- C.M. & McDougall, localization detection & Ward, Sci., 78: 6633-6637, Myerson, Detection あ り,VZV感 Jpn. Virology, nucleic Acad. よ び潰 瘍 ・痂 Rapid of herpes of biotin-labelled 率 が 高 く,以 後 の血 疱 ・膿 疱 期,お 及 ぼ して い る可 能 性 が あ る もの と考 え られ る. in sotu probes. ganglia. Waldrop, synthesis cleopeptides by Y. : in cul- 1979. Kiviat, 検 体 中 の 白血 球 あ る い は 赤 血 球 が 何 ら か の影 響 を by using biotin-labelled 疱 疹 皮 疹 の 臨 床 病 期 に よ り,初 期 の 水 疱 期 で検 出 皮 期 で 低 下 した.こ DNA J. Exp. Med., 57 : 339-346, 1987. 3) Galloway, D.A., Fenglio, C., Schevchuk, ウ イ ル ス感 染 培 養 細 胞 のVZVDNAプ 染細胞 のみ に染 and hybridization Mcdougall, 行 な った が,VZV感 T. & Aoyama, of vaicellazoster らに よ り報 告 され て お り2),さ らに 各 種 ヘ ル ペ ス よ るISHを J. & Tilton, plex virus-specific DNA probes and monoclonal antibodies. J. Clin. Microbiol., 22: 748-753, Detection 染 色 の特 異 性 につ い て は,他 スDNAと R.C. : parison of the detection of herpes simplex in direct clinical specimens with herpes 2) Honfo, な った. 献 1) Fung, J.C., Shanley, simplex virus N.: DNA by in situ hybridization. 22 : 656-658, 1985. 感染 症 学 雑 誌 第64巻 比 較 は行 な っ て い な い が,単 純 ヘ ル ペ ス ウイ ル ス 第11号 塗 抹 標 本 に お け るIn Situ Hybridization法 1371 The Detection of VZV DNA in the Smear Cells of the Patients of Herpes Zoster by In Situ Hybridization Using Biotinylated DNA Probe Shin-ichi TAKAHASHI Departmentof Dermatologyof KeioUniversitySchoolof Medicine Sectionof Dermatologyof KitasatoInstitute Hospital Yukimasa KAZUYAMA Research& DevelopmentCenterof hygieneScience,Kitasato University We performed the in situ hybridization (ISH) study of the smear cells taken from the patients of herpes zoster. We used the biotinylated EcoRI-B,H fragment of varicella-zoster-virus (VZV)DNA as the probe. In the control study of ISH VZV-infectedcells showed strong staining, but no staining was observed in the infected cells by other herpes virus. We examined the smear cells of 19 patients of herpes zoster and 2 patients of herpes simplex by ISH. 30 of the 35 specimens of herpes zoster was positive by ISH. We detected VZV DNA in the smear cells of all cases of the bullos stage, but the sensitivity was about 75%in the laterstage. Smear cells of herpes simplex was not stained by ISH. We also performed virus isolation of 13 cases of herpes zoster. But the sensitivity of ISH was higher than that of virus isolation in the other stages of herpes zoster. This method is very simple and can be completed in about 1 hour. It also has high specificity and sensitivity. So this method is very useful for the rapid diagnosis of VZV infection. 平成2年11月20日
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![平成 27 年 5 月 14 日 [神戸大学大学院農学研究科] 李智博准教授が](http://s1.expydoc.com/store/data/006070707_1-3e6fd1585bf925076db6363e411c729d-250x500.png)
