クローニング用ベクターとライブラリー new CLONING VECTORS AND LIBRARIES 市場最強のPCRクローニング・キット 問題点 Problem 解決法 Solution PCRクローニングでは、ライゲーションの簡便さから ストラタジーン社の新製品 StrataCloneTM Blunt PCR Cloning Kit は、ト Taq 等のPol I 型酵素に見られる3'末端に付加されるAを ポイソメラーゼ I とCreリコンビナーゼの二つの酵素を使用した画期 利用したTAクローニングが主流で、ライゲーション効 的な高効率のPCRクローニング・キットです。Pfuをはじめとする3'→ 率が劣る平滑末端（Blunt）でのPCRクローニングは敬 5'エクソヌクレアーゼ活性（proofreading機能）を持つ酵素による平 遠されていました。 滑末端のPCR産物からでも、高効率でのクローニングが可能です。 StrataCloneTMに使われている新技術 ストラタジーン社の新製品 StrataClone Blunt PCR Cloning Kitでは、Vaccinia ウィル ス由来のDNAトポイソメラーゼ I とP1ファー ジ由来のCreリコンビナーゼの二つの酵素を使 用しています。本製品に使われている StrataCloneTM Vector Mixには、一方の末端に DNAトポイソメラーゼが充填され、もう一方 の末端にlox P配列を持った二種類のベクター アームが含まれています（図1）。PCR産物が Vector Mixに加えられると、DNAトポイソメ ラーゼ I がそれぞれの結合反応を触媒し、 ＜ベ クターアーム・PCR産物・ベクターアーム＞ からなるDNA直鎖が形成されます。この反応 は、室温で5分ほど静置するだけで十分です。 次に、この DNA 直鎖をそのままの状態で、 Creリコンビナーゼを一過的に発現するコンピ テ ン ト ・ セ ル （ SoloPack ® PCR Cloning Competent Cells）に形質転換します。形質転 換されたDNA直鎖は両端にlox P配列を持つた め、Creリコンビナーゼによりlox Pの位置で組 換反応が起こり、閉じた環状二本鎖のベクター になります。そのベクターは、そのまま大腸 菌を一晩培養することにより増幅されます。 インサートがある陽性のクローンは、lac Z による青白スクリーニング法により容易に選 TM 別することができ、10kbまでのPCR産物なら 長さに関係なく、95％以上の高効率で目的の クローンが手に入ります。また、Eco RI 切断 部位とM13のプライマー結合部位がMCSの両 側にあるため、インサートの切り出しやシー クエンシングも容易に行えます。 Blunt用には、現在販売されているPCR酵素 の 中 で 最 高 の 正 確 性 を 持 つ （ Taq の 25 倍 ） PfuUltra TM II Fusion HS DNA Polymerase （#600670）と高速、高感度、高収量、高正確性 の万能型PCR酵素（本誌P2を参照してくださ い） Herculase ® II Fusion DNA Polymerase （ #600675 ）が特に有用です。前者は変異導 StrataCloneTMの応用 StrataCloneTMにはTAとBluntの両方があり、 これらは使用するPCR酵素により使い分けま す。 TA クローニング用に使用できる Easy-A ® High-Fidelity PCR Cloning Enzyme（#600400） は、古細菌由来ではあるけれども3'末端にAが 付加され、Taq の6倍もの正確性があります。 6kb までのテンプレートに対応できるので、 多くのPCRに応用することができます。 入やライブラリーの作製等の非常に高い正確 性が求められる場合に有効で、後者は一般的 なPCRから難しいテンプレートを扱う際に有 効です。いずれも二本鎖DNA結合ドメインが 融合した Fusion タイプの酵素なので、高速で の PCR が可能で、従来の PCR に比べて反応時 間を1/5に短縮できます。前者は、PCR40反応 分（50µl）とクローニング20反応分が一つにま とまって非常にお得な StrataClone Ultra TM Blunt PCR Cloning Kit（#240218）としても 販売しています。 lac Z' MCS PCR産物をStrataCloneTM Vector Mixに加えて5分間室温で静置 P lac Creリコンビナーゼを持った StrataClone™ Competent Cellsに PCR Product トランスフォーメーション PCR Product pUC ori Topoisomerase I loxP pUC ori P lac lac Z' MCS MCS lac Z' ampicillin StrataClone™ PCR Cloning Vector pSC-B loxP Topoisomerase I 図1 StrataClone TM <loxP> Blunt PCR Cloning Kitの仕組み MCS lac Z' ampicillin f1 ori StrataCloneTM PCR Cloning Kits Blunt/TA 製品 カタログ# 価格（税別） 容量 PCRクローニング・キット&PCR酵素 new StrataClone UltraTM Blunt PCR Cloning Kit Blunt 20反応 (PCRは40反応） 240218 ¥69,800 Blunt 20反応 240207 ¥52,000 Blunt 10反応 240208 ¥27,800 Blunt/TA Blunt 10反応 TA 10反応 240209 ¥52,000 TA 20反応 240205 ¥52,000 TA 10反応 240206 ¥27,800 PfuUltra TM II Fusion HS DNA Polymerase Blunt 40反応 600670 ¥25,500 Herculase II Fusion DNA Polymerase Blunt 40反応 600675 ¥11,500 TA 100U 600400 ¥19,000 PCRクローニング・キット new new new StrataCloneTM Blunt PCR Cloning Kit StrataCloneTM Combo PCR Cloning Kit StrataCloneTM PCR Cloning Kit （TA用） PCR酵素 ® Easy-A® High-Fidelity PCR Cloning Enzyme Strategies 日本語版 Vol.2 No.3 p1
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