３．リアルタイム PCR 装置 GeneDisc® system を用いた TAB の迅速検出・同定 Zoder P. 1), Wang Y. 2), Bao Y. 1), Lu T. 1), Dilger K. 1), Ulve V. ○佐藤仁美 Leborgne G. 3), Knoll C. 4), Wedral D. 5) 日本ポール株式会社応用技術研究所 1), Assaf S. 3), Bouton S. 3), 【目的】従来の耐熱性好酸性菌 TAB の検出手法（日本果汁協会・統一検査法、IFU（国際果汁製造者連盟）推奨方法）では、判定までに 5 日間以上の時間がかかり、製品出荷や異常発生時の対応が遅れてしまうことが問題であった。また、菌種の同定手法（PCR などの遺伝子解析手法）では、遺伝子操作の手技を駆使することから手間と時間が掛かり、ルーティンワークとしては取り入れづらい点が課題であった。さらに、遺伝子解析業務の教育には時間がかかることから、業務を請け負うことのできる人員体制を敷くことが難しい点も課題であった。そこで、Pall Corporation は検出と同定が同時に可能なリアルタイム PCR に着目し、検出時間を削減すると共に、ルーティンワークで活用できるように人的作業を極限まで削減した GeneDisc system を当該問題の解決方法として採用することにした。この装置を使うことにより、A. acidoterrestris、A. acidophilus、A. cycloheptanicus、A. herbarius の４菌種を、液体培養を使用した場合には培養時間を含めて 50 時間程度で検出及び同定を行うことが可能となる。また、コロニーからの場合、約 1.5 時間で菌種同定することが可能となる。上記４菌種以外の TAB が検出された場合には Alicyclobacillus spp.として検出することができる。遺伝子解析のため、結果の信頼性は高いと考えられるが、実際に様々なサンプルでの試験や夾雑菌を混入させたサンプルで解析を行い、サンプルの種類や夾雑菌の影響を受けずに目的の菌種が特定できるか確認を行った。【方法】 ① 菌株の違いによる結果への影響確認試験 A. acidoterrestris において多数の異なる菌株を純粋培養した後 GeneDisc にて解析を行い、検出結果への影響確認を行った。また、他の菌種においても検出に影響がないか確認を行った。試験菌種：A. acidoterrestris ATCC49025 / ATCC49026 / DSM2498 / OS 232 A. hesperidum DSM12489 、A. acidocaldarius ATCC 43034、A. sacchari ATCC17974 など、200 株以上 ② 夾雑菌の結果への影響確認試験 Alicyclobacillus 属以外の夾雑菌が含まれている場合に、偽陽性判定が発生しないか確認を行った。夾雑菌種：Bacillus 属数種、Burkholderia 属、Megasphaera 属、Moorella 属、Lactobacillus 属数種、Candida 属、Micrococcus 属 ③ サンプル種類の違いによる結果への影響確認 TAB 自然汚染の様々なサンプルを用いて試験を行い、培地培養法と差異がないか確認を行った。10 g または 10 mL の様々な濃縮果汁及び/または果汁(オレンジ、グレープフルーツ、パイナップル、白・赤ブドウ、リンゴ、ザクロ、マンゴーなど)を検査し、培養法と 40 サンプルの比較を行った。【結果】 200 株以上の Alicyclobacillus 属菌において、正確に検出することが確認された。また、様々な果汁サンプルにおいても GeneDisc system が培地培養法と結果に差異がなく、夾雑菌の影響も受けないことが確認できた。この結果より、様々な果汁において多数の夾雑菌が含まれるサンプルからでも正確に菌種を特定できることが確認された。この GeneDisc system を用いることにより遺伝子検査がより身近なものとなり、品質管理レベル向上に貢献することができればと考える。 1) Pall ForteBio, Menlo Park, CA, USA, 2) Pall Corporation, Northborough, MA, USA, 3) Pall Life Sciences, Bruz, France, 4) Pall Corporation, Bad Kreuznach, Germany, 5) Pall Corporation, Port Washington, NY, USA