JP 3680315 B2 2005.8.10 (57)【特許請求の範囲】【請求項１】マイコバクテリアにＤＮＡを挿入するためのシャトルベクターであって、上記マイコバクテリアにおける機能的複製のための少なくとも１つの起点と、他の細菌における機能的複製のための別の起点と、マイコバクテリアに発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡの挿入を可能にする酵素切断部位とを含み、上記マイコバクテリアに重金属含有化合物耐性を与える遺伝子をも担うことを特徴とするシャトルベクター。【請求項２】上記化合物が無機水銀または水銀化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。 10 【請求項３】耐性遺伝子が水銀還元酵素の遺伝暗号をもつことを特徴とする請求の範囲第１項及び第２項のいずれかの項記載のベクター。【請求項４】耐性遺伝子が有機水銀リアーゼの遺伝暗号をもつことを特徴とする請求の範囲第１項及び第２項のいずれかの項記載のベクター。【請求項５】水銀還元酵素の遺伝暗号をもつトランスポゾンＴｎ５０１の遺伝子ｍｅｒＡを含むことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項記載のベクター。【請求項６】 20 (2) JP 3680315 B2 2005.8.10 プラスミドｐＤＵ１３５８の遺伝子ｍｅｒＡ及びｍｅｒＢを含むことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかの項記載のベクター。【請求項７】Ｎｏ．ＬＭＢＰ３０４６と命名されてＢＣＣＭに保管されている請求の範囲第１項ないし第３項及び第５項のいずれかの項記載のプラスミドｐＭＲ００１。【請求項８】Ｎｏ．ＬＭＢＰ３０４７と命名されてＢＣＣＭに保管されている請求の範囲第１項ないし第４項及び第６項のいずれかの項記載のプラスミドｐＶＮ２。【請求項９】重金属耐性の遺伝子と酵素切断部位とがトランスポゾンに担持されることを特徴とする請 10 求の範囲第１項ないし第６項のいずれかの項記載のベクター。【請求項１０】上記重金属が砒素であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。【請求項１１】砒素耐性の遺伝子がオペロンａｒｓであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のベクター。【請求項１２】Ｎｏ．ＬＭＢＰ３０４８と命名されてＢＣＣＭに保管されている請求の範囲第１０項及び第１１項のいずれかの項記載のプラスミドｐＶＮ３。【請求項１３】 20 マイコバクテリアにおいてそれ自体を発現する遺伝子であって、ヒト及び動物において免疫反応を誘起することができる蛋白質の遺伝暗号をもつ遺伝子を担うことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれかの項記載のベクター。【請求項１４】無機水銀のような重金属を含む化合物、水銀化合物または砒素に対して耐性を有する病原性または弱毒化マイコバクテリウム。【請求項１５】請求の範囲第１項ないし第１３項のいずれかの項記載のベクターを担うことを特徴とするマイコバクテリウム。【請求項１６】 30 請求の範囲第１項記載のベクターを染色体に含むことを特徴とするマイコバクテリウム。【請求項１７】請求の範囲第１６項記載の染色体中に、無機水銀のような重金属を含む化合物又は水銀化合物に対する耐性の遺伝暗号をもつ遺伝子と抗原の遺伝暗号をもつ遺伝子とを含むトランスポゾンを担うことを特徴とするマイコバクテリウム。【請求項１８】病原性マイコバクテリウムであることを特徴とする請求の範囲第１５項ないし第１７項のいずれかの項記載のマイコバクテリウム。【請求項１９】うし型結核菌、スメグマ菌または結核菌であることを特徴とする請求の範囲第１５項ない 40 し１８項記載のマイコバクテリウム。【請求項２０】請求の範囲第１４項ないし１９項のいずれかの項記載のマイコバクテリウムの少なくとも１つを、１つ以上の相容性の、薬物学的に容認される賦形薬と組み合わせて含む薬物学的組成物。【請求項２１】請求の範囲第１４項ないし第１９項のいずれかの項記載の細菌を少なくとも１つ含むことを特徴とするワクチン。【請求項２２】遺伝子をマイコバクテリウムに導入する方法において、上記遺伝子を担う請求の範囲第１ 50 (3) JP 3680315 B2 2005.8.10 項ないし第１３項のいずれかの項記載のベクターを導入する少なくとも１つの段階と、そのベクターが導入されたマイコバクテリアを選択する段階とを含んでなる方法。【請求項２３】ベクターが導入されたマイコバクテリアを無機水銀などの重金属を含む化合物または水銀化合物に対する耐性に関して選択することを特徴とする請求の範囲第２２項記載の方法。【発明の詳細な説明】本発明はＤＮＡをマイコバクテリアに挿入するためのシャトルベクターに関するものである。本発明は、これらベクターの１つが挿入されたマイコバクテリアをワクチンとして使用することにも関係する。 10 マイコバクテリウム属は５０以上の種からなり、そのなかにはヒトにおける主要病原菌、例えば結核の病原菌である結核菌（ Mycobacterium tuberculosis）、ライ病の病原菌であるライ菌（ Mycobacterium leprae）、ＡＩＤＳ過程の主な日和見感染菌であるとり型結核菌（ Mycobacterium avium）などが含まれる。結核菌及びヒトにおけるその他の病原菌種の毒性の遺伝的メカニズムについては、これら細菌の遅い成長速度、及び十分なクローニングベクターの欠如によりほとんど知られていない；その結果異種ＤＮＡをこれら微生物に挿入することは難しい。その上マイコバクテリアは多くの抗生物質に特別の耐性を示す；それは、その壁構造がこれら分子をあまり透過しないためである。しかしながら最近の研究により、ＢＣＧに異種ＤＮＡを挿入し、この細菌に異種抗原を発現させ得ることがわかった。 20 ＢＣＧ操作の場合には、これまでに使用できる抗生物質に対する耐性のマーカー、例えば高度のカナマイシン耐性を与えるａｐｈ３遺伝子、またはストレプトマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を与える遺伝子などの使用はすすめられない、なぜなら組換えＢＣＧをヒトまたは動物において治療的または予防的目的で使用するならば、これら抗生物質に対する耐性を環境に撒き散らすことになり得るからである。こうして広く使用し得る組換えマイコバクテリアを選択するために環境に害のない耐性マーカーを開発することが最も重要である。現在、マイコバクテリアに使用できるマーカーは非常にわずかしか手に入らない。例えば、アルドヴィニ（ Aldovini）ら（ J.Bacteriol.,1993, 175巻、 7282− 7289ページ）は、うし型結核菌（ Mycobacterium bovis）ＢＣＧのオロチジン -５ ’ − 一リン酸脱炭素酵 30 素（ＯＭＰ−ＤＣａｃｏ）の遺伝暗号をもつ遺伝子を分離した。その他のマーカー、ｃＩ遺伝子（Ｌ１ファージリプレッサーをコードする）も用いられている（特許出願ＷＯ−９０／００５９４）。これらのマーカーに基礎を置いた、大腸菌（ Escherichia coli）とマイコバクテリアとの間のＤＮＡの往き来を可能にするシャトルベクターはすでに報告されている。例えば特許出願ＷＯ−９１／１３１５７は２つのシャトルベクター、ｐＥＰ２及びｐＥＰ３を記載している。これらはそれぞれカナマイシン及びヒグロマイシン耐性の遺伝子を担う。これらのベクターの１つ、ｐＥＰ２を、特許出願ＷＯ−９０／１０７０１に記載のように、マイコバクテリウムの蛋白質プロモーターＭＢＰ７０の挿入によって変形する。マイコバクテリアに使用でき、抗生物質耐性マーカー、栄養素要求性マーカーまたはｃＩ 40 遺伝子を担持するその他のシャトルベクターが特許出願ＷＯ−９０／００５９４に記載されている。最後に、レーンズ（ Ranes）ら（ J.Bacteriol.,1990, 172巻、 2793− 2797ページ）は、うし型結核菌ＢＣＧ及びスメグマ菌（ Mycobacterium smegmatis）に発現される、カナマイシン耐性の遺伝子をもつｐＥＰ３と呼ばれるシャトルベクターの構造を報告した。１１５ＭＤのプラスミドを担う水銀耐性の非病原性、腐生性マイコバクテリウムの菌株も知られるに至った（マイスナー（ Meisssner）及びファルキンハム（ Falkinham）、 J.Bact eriol., 157巻、 669− 672ページ、 1984）。しかしこの非常に大きいプラスミドは特徴づけられなかった。すなわち、水銀耐性に関係する遺伝子は部位決定もされず、同定もされなかった、したがってこのプラスミドはシャトルベクターとして使用することができなか 50 (4) JP 3680315 B2 2005.8.10 った。その上、腐生性マイコバクテリアは病原性マイコバクテリアには属さない、後者は主として結核菌、うし型結核菌及びライ菌に含まれる。その結果、大腸菌におけるクローニングによって得られた、抗原類の遺伝暗号をもつＤＮＡをマイコバクテリアに伝達したいと考える熟練せる当業者は、ワクチンを作るという観点から、大腸菌とマイコバクテリアに発現されるマーカーを担い、ヒトまたは動物の健康に危険を及ぼさない、容易に操作できるベクターの欠如に直面した。治療目的の抗生物質に耐性をもつ遺伝子の使用は実際、前に述べた理由により除外しなければならない。栄養素要求性突然変異体の使用は、選択が実際にむずかしく、その上各マイコバクテリウム菌種ごとに突然変異体を得ることが必要である。そこで出願人は、シャトルベクターのその他のＤＮＡ断片担持能力を過度に低下させずに 10 そのシャトルベクターに含まれることができるその他のマーカーを見いだし、しかもそれらマーカーが発現されるマイコバクテリアに、それらマーカーをもつマイコバクテリアとそのマーカーをもたないマイコバクテリアとを明白に且つ容易に区別すし得る特徴を与えるマーカーを見いだすことを計画した。こうして出願人は驚くべきことに、無機水銀のような重金属を含む化合物または水銀化合物類に耐性をもつ遺伝子を担うグラム陰性菌に由来するシャトルベクターがグラム陽性菌に発現され、大腸菌とマイコバクテリアとの間のＤＮＡ伝達のために使用できること、及びこれらのシャトルベクターを担う細菌が容易に選択できることを明らかにした。本発明はしたがってマイコバクテリアにおける機能的複製起点を少なくとも１つと、他の細菌、例えば大腸菌における機能的複製のもう一つの起点と、マイコバクテリアに発現す 20 ることができる蛋白質の遺伝暗号を持つＤＮＡの挿入を可能にする酵素切断部位とを含み、上記マイコバクテリアに、無機水銀などの重金属を含む化合物、水銀化合物または砒素に対する耐性を上記マイコバクテリアに付与する遺伝子をも担うという特徴をもつ、ＤＮＡを上記マイコバクテリアに挿入するためのシャトルベクターに関するものである。熟練せる当業者は多年にわたり、遺伝子をマイコバクテリアに伝達するためのマーカーを探す問題に直面していたが、現在までこの問題の満足すべき解決法は見いだされていないことは考慮されるべきである。出願人が見いだした解決法、すなわちグラム陰性菌に由来し、重金属耐性の遺伝暗号をもつ遺伝子を選択するという方法は、熟練せる当業者がグラム陽性菌に発現されるグラム陰性菌の発見を理論的には期待していなかった事実から見て、特に驚異である。実際に多く 30 の研究は、グラム陰性菌からの遺伝子がグラム陽性菌に発現することは不可能であることを証明している（ミスラ（ Misra）、プラスミド（ Plasmid）、 27巻、４ − 16ページ、 1992 ；ロビンソン（ Robinson）及びツオヴィネン（ Tuovinen）、微生物学研究（ Microbiologi cal Reviews）、 48巻、２号、 95− 124ページ、 1984）。出願人はこうして、長年にわたる問題及びさらに一般大衆の健康にも非常に重要な問題の解決法を見いだした；マイコバクテリア及び特にうし型結核菌ＢＣＧは、もしもこれらの細菌が異種抗原を発現し得るならば、種々の疾患に対するワクチン化の良い候補であると考えられる。本発明は効果もあり、一般大衆の健康に害のないこれら抗原の遺伝暗号を持つ遺伝子を紹介するものである。したがって本発明は一般大衆保健の分野における重要な技術的進歩に関係する。 40 水銀耐性のマーカーが特にマイコバクテリアに依存することはすでに公知であるとはいえ、熟練せる当業者は決して、水銀または水銀化合物耐性の遺伝子をマイコバクテリアに使用できるシャトルベクターに組み込もうとはしなかったことも注目すべきである。これに対して、例えば大腸菌に発現するオペロンはマイコバクテリアには発現しないことは広く知られている。熟練せる当業者はこうして、一般に大腸菌に発現する遺伝子をマイコバクテリアに使用する気にはならなかった。言い換えれば、耐性遺伝子、特に水銀または水銀化合物耐性の遺伝子を、シャトルベクターを取り組んだマイコバクテリアの選択のための遺伝子として使用することを擁護するものは何もなかったのである。本発明の目的の１つは異種ＤＮＡをマイコバクテリアに伝達することに関係するが、シャ 50 (5) JP 3680315 B2 2005.8.10 トルベクターはマイコバクテリアのＤＮＡ断片をその他の細菌、例えば大腸菌に伝達し、マイコバクテリアの遺伝研究をし易くすることができることは注目すべきである。マイコバクテリアは、大部分それらの遅い増殖速度のために、遺伝的観点から研究することは困難であり、そこでこの研究はマイコバクテリアのＤＮＡ断片を大腸菌においてクローニングすることによって容易になることは事実である。本発明に関係があるシャトルベクターは、マイコバクテリアのＤＮＡのクローニングのために、そしてこれらの細菌の研究のためにも好都合に使用できる。これらを用いて、トランスポゾンの助力によって、結核菌及びその他の有毒マイコバクテリアの毒性を減らすこともできる。こうして本発明はマイコバクテリアの遺伝子分析の進歩をかなり速めるはずであり、多価 10 ワクチンを作るためのＢＣＧの遺伝子操作も可能にする。本発明の目的のための“異種ＤＮＡ”とは、それを発現するために選択されたマイコバクテリア種には属さないＤＮＡを意味すると理解される。伝達可能の異種ＤＮＡの例としてはＥＰ９１．４０１．６０１に記載されているものがある。水銀及びその他の水銀化合物、例えば有機水銀化合物に耐性の遺伝子はオペロンに組織化される。細胞質のＨｇ 2+イオンの輸送及びそれらの解毒のために現在までに６種類の遺伝子ｍｅｒが記載されている。鍵となる酵素は、Ｈｇ 2+イオンをＨｇ 0元素水銀 − 細菌によって容易に排除される比較的毒性の小さい揮発性化合物である−に還元する、ｍｅｒＡ遺伝子にコードされた水銀還元 20 酵素である。遺伝子ｍｅｒＢも公知であり、Ｃ − Ｈｇ結合を切り、水銀をＨｇ 2+イオン（これはその後上記の水銀還元酵素によって解毒される）に変換することができる有機水銀脱離酵素の遺伝暗号を持つ遺伝子である。本発明の範囲内で使用する水銀耐性の遺伝子はすべて、それらの塩基配列と共に、ミスラ（ 1992、上記）、ロビンソン及びツオニヴェン（ 1984、上記）、フェレイ（ Fellay）ら（ 1987、遺伝子（ Gene）、 52巻、 147− 154ページ）、グリフィン（ Griffin）ら（ 1987、 Pro c.Natl.Acad.Sci.USA、 84巻、 3112− 3116ページ）またはヘレロ（ Herrero）ら（ 1990、 J. Bacteriol., 172巻、 6557− 6567ページ）によるレビューに記載されている。しかしマイコバクテリアにそれ自体を発現する水銀耐性の遺伝子ならばその他のいかなる 30 遺伝子でも本発明に関係するシャトルベクターに組み込まれ得る。本発明に関するベクターはそれ自体に遺伝子ｍｅｒＡ、または遺伝子ｍｅｒＡ及びｍｅｒＢを、遺伝子ｍｅｒＴ及びｍｅｒＰと共に含むのが好都合である。前者の場合、ベクターはトランスポゾンＴｎ５０１のｍｅｒＡオペロンを含むのが好都合である。後者の場合ベクターは、セラチアマルセッセンス（ Serratia marcescens）から分離したプラスミドｐＤＵ１３５８からクローン化され、Ｈｇ 2+イオン及び有機水銀化合物、例えば酢酸フェニル水銀（ＰＭＡ）などに対する広い耐性スペクトルを表すオペロンｍｅｒＡ及びｍｅｒＢを含むのが好都合である。好都合なのは、本発明による、オペロンｍｅｒＡを担うシャトルベクターがベルギー共同微生物コレクション（ Belgian Collection of Coordinated Microorganisms）（ＢＣＣＭ 40 ）にＮｏ．ＬＭＢＰ３０４６として保管されているプラスミドｐＭＲ００１であり、２つのオペロンｍｅｒＡ及びｍｅｒＢを担うベクターがＢＣＣＭにＮｏ．ＬＭＢＰ３０４７として保管されているプラスミドｐＶＮ２であることである。これら２つのプラスミドは遺伝子ｍｅｒＴ及びｍｅｒＰをも担い、ｐＭＲ００１ではｍｅｒＲをも担う。水銀耐性の遺伝子が本発明で好都合に用いられるとはいえ、砒素、カドミウムまたは鉛などの重金属に耐性のその他の遺伝子を用いてもよい。これらその他の重金属に対する耐性を与える遺伝子は、シルバー（ Silver）及びワルダーホーグ（ Walderhaug）（微生物学研究、 56巻、１号、 195-229ページ、 1992）、カウル（ K aur）及びローゼン（ Rosen）（プラスミド、 27巻、 29− 40ページ、 1992）及びニース（ Ni es）（プラスミド、 27巻、 17− 28ページ、 1992）が報告したものであることは注目に値す 50 (6) JP 3680315 B2 2005.8.10 る。遺伝子ａｒｓを用いて砒素耐性を与えてもよい。このような遺伝子を担うベクターはＢＣＣＭにＮｏ．ＬＭＢＰ３０４８として保管されているｐＶＮ３である。トランスポゾンは重金属を含む化合物に耐性を有する遺伝子と、酵素切断部位とをもつのが好ましい。このような構造は、マイコバクテリアに発現されるのが望まれる蛋白質の遺伝暗号を持つＤＮＡを挿入しようとする切断部位をもつＤＮＡの組込みを容易にする；相同的組換えが非常には効率的でない場合には特にそうである。上に述べたように、本発明による上記ベクターはマイコバクテリアに発現し得る蛋白質の遺伝暗号をもつＤＮＡを挿入させる酵素切断部位を含む。こうして本発明はこの切断部位を有するベクターのみならず、選択した宿主とは異種の蛋 10 白質の遺伝暗号をもつＤＮＡ断片がこの切断部位に挿入されているベクターにも関係する。このような蛋白質は、好適には、ヒトまたは動物において免疫反応を引き起こすことができる抗原、例えばライ菌の抗原、結核菌の抗原、マラリアベクター、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、リーシュマニアの抗原、サルモネラの抗原、マイコバクテリウム・アフリカン、マイコバクテリウム・イントラセルラーリス、とり型結核菌の抗原、トレポネーマ属、トキソプラズマ属、住血吸虫、百日咳トリパノソーマ属の抗原、ヘルペスウィルス、ＨＢＶ、ＨＣＶ、赤痢菌、ナイセリア属、ボレリア属、ポリオウィルス、ＨＩＶウィルスの抗原、または蛇−、昆虫毒、またはコレラ菌の抗原、または真核生物細胞に由来し、免疫予防または免疫治療に有用な抗原を含めたその他の抗原である。 20 本発明に関するシャトルベクターの複製起点は大腸菌またはマイコバクテリアにおいてベクターを複製させる起点である。大腸菌及びマイコバクテリアにおける複製起点がプラスミドｐＲＲ３において用いられるものであることが好都合である。その他のプラスミド、例えばｐＭＳＣ２６２及びＲＳＦ１０１０などの起点も好都合に用いられる。しかし、その起点がマイコバクテリアにおいて機能しない場合、または最適には機能しない場合は、そのシャトルベクターを例えば転位または組換えによってマイコバクテリアの染色体ＤＮＡに組み込むことができることは注目すべきである。マイコバクテリアに発現させることが所望の蛋白質をコードするＤＮＡ断片をシャトルベクターに組み込ませる切断部位は、スティッキーエンドまたはブラントエンドを提供し得 30 る制限酵素による切断部位である。このような酵素はその酵素を使用する場合などの操作条件を考慮して熟練せる当業者によって選択される。概して、そして特に本発明に関するベクターの製造及びＤＮＡのこのベクターへの組込みに関連して、熟練せる当業者は以下のような一般的技術マニュアルを参照することができる：マニアティス（ Maniatis）ら、 1982、分子クローニング、実験室マニュアル；コールドスプリングハーバー研究所（ Cold Spring Harbor Laboratory）、 Cold Spring Harbo r N.Y. USA、またはその最近の再訂版のいづれか。熟練せる当業者はこの発明に関するいかなる事物にもこのマニュアルを参照することができる。本発明は、例えば無機水銀のような重金属を含む化合物、水銀化合物または砒素に耐性を 40 有する病原性マイコバクテリア、特にうし型結核菌、ライ菌、結核菌、とり型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーリスにも関係する。概ね本発明は、上記のようなベクターを担うマイコバクテリア、特に病原性または弱毒化マイコバクテリアに関するものである。それは重金属耐性遺伝子を担い、異種抗原の遺伝暗号をもつ遺伝子を発現するマイコバクテリアにも関係する。 “異種抗原”とは、或る抗原が発現される細菌においては普通は見いだされない抗原と理解される。このベクターは細菌内で組込まれない形で存在することができる。しかし少なくとも１部は細菌染色体に組込まれるのが好都合である。 50 (7) JP 3680315 B2 2005.8.10 マイコバクテリアが重金属耐性の遺伝子及びマイコバクテリア中で発現され得る蛋白質の遺伝暗号をもつ遺伝子を、それらの染色体に挿入された形で含むトランスポゾンを担うことが特に好都合である。このような利用の仕方が特に好都合であるのは、それは蛋白質の発現喪失（これはそのベクターが組込まれないときにはよりしばしばおきるかも知れない）のリスクを減らすからである。本発明は、１つ以上の相容性の、薬物学的に容認される賦形薬と組み合わせて上記のようなマイコバクテリウムを少なくとも１種類は含む薬物学的組成物、及びこのようなマイコバクテリアを含むワクチンにも関係する。最後に本発明は、遺伝子をマイコバクテリウムに挿入する方法において、上記遺伝子を担う上記のようなベクターを上記マイコバクテリアに挿入する少なくとも１つの段階と、ベ 10 クターを挿入したマイコバクテリアを選択する段階とからなる方法に関する。プラスミドを挿入したマイコバクテリアは、水銀または水銀化合物に対するそれらの耐性のために好都合に選択される。ベクターはエレクトロポレーションによってマイコバクテリアに挿入するのが好都合である。しかし同じ結果を与える方法ならばいかなる方法でも同様に成功裡に用いられる。本発明は下記の例によって、制限することなく、説明される： −図１及び図２はプラスミドｐＭＲ００１及びｐＶＮ２の地図の線図である。 −図３及び図４は組換え及び非組換えスメグマ菌クローンそれぞれのＰＭＡ及びＨｇＣｌ 2に対する感度を示す、 − 図５及び図６は組換え及び非組換えＢＣＧクローンそれぞれのＰＭＡ及びＨｇＣｌ 2に 20 対する感度を示す、 −図７及び図８は組換えまたは非組換えＨ３７ＲＡクローンそれぞれのＰＭＡ及びＨｇＣｌ 2に対する感度を示す、そして −図９はプラスミドｐＶＮ３の地図の線図である。図３ないし図８では、クローンの増殖を、ＰＭＡ − またはＨｇＣｌ 2濃度（ｘ軸）に対する６００ｎｍにおける光学密度（ｙ軸）によって測定する。例：例１：水銀耐性の遺伝子を担うシャトルプラスミドｐＭＲ００１及びｐＶＮ２の構造及びそれらのマイコバクテリアへの伝達。 30 オペロンｍｅｒを担う次の２つのプラスミドを用いる： −緑膿菌に初めて見いだされ、単独で無機水銀に対する耐性を発現する、トランスポゾンＴｎ５０１のオペロンｍｅｒを含むｐＨＰ４５ − Ω − Ｈｇ（フェレイら（ 1987、遺伝子、 52巻、 147− 154ページ））；ｍｅｒＡによって遺伝暗号がもたらされる。 −水銀及び有機水銀化合物両方に耐性をもつ遺伝子（ｍｅｒＡ及びｍｅｒＢを含める）を含み、プラスミドｐＤＵ１３５８からクローン化され、最初にセラチアマルセッセンスから分離され、Ｈｇ 2+イオン及び有機水銀化合物、例えば酢酸フェニル水銀（ＰＭＡ）に対する広い耐性スペクトルを発現するｐＬＯＦ − Ｈｇ（ヘレロら、（ 1990、 J.Bacteriol.、 172巻、 6557− 6567ページ））。これらプラスミドのｍｅｒオペロンを別々にシャトルベクターｐＲＲ３に挿入する。 40 この例で用いる細菌−大腸菌またはマイコバクテリアーは表１に記載される。１）ｐＭＲ００１の作成Ｔｎ５０１のｍｅｒオペロンを含むｐＨ４５ Ω Ｈｇの４ .３ｋｂ断片ＳｍａＩをｐＲＲ３の単一部位ＳｃａＩに挿入する。結合後、混合物を用いて大腸菌ＸＬｉ−ｂｌｕｅをエレクトロポレーションによって形質転換する。それからトランスフォーム細菌を１２ μ ｇ／ｍｌＨｇＣｌ 2を補充したルリア −ブイヨン（ＬＢ）上に培養する。１晩３７℃でインキュベートすると、水銀耐性を発現するいくつかのコロニーがあらわれる、他方ｐＲＲ３で形質転換した細菌のみを培養した場合にはコロニーは認められない。水銀耐性を有する１０クローンのプラスミドを抽出し、分析する。期待した制限プランを 50 (8) JP 3680315 B2 2005.8.10 有する組換えプラスミドの存在を確認する。ｐＭＲ００１と命名され、その制限地図が図１に線図からあらわされているプラスミドを用いてマイコバクテリアを形質転換する。２）ｐＶＮ２の作成セラチア・マルセッセンスのｍｅｒオペロンを担うプラスミド、ｐＬＯＦ−Ｈｇを用いて、同様なやり方で行う。セラチア・マルセッセンスのｍｅｒオペロンを担うｐＬＯＦ−Ｈｇの３ｋｂ断片ＭｌｕをＤＮＡポリメラーゼＩで処理し（ Klenow）、その後ｐＲＲ３の単一部位ＳｃａＩに挿入する。トランスフォーム細菌は水銀耐性を発現し、組換えプラスミドの再配列は認められない。ｐＶＮ２と命名されたプラスミドをその後用いてマイコバクテリアを形質転換した。 10 このプラスミドは図２に線図で示されている。３）ｐＭＲ００１及びｐＶＮ２によるマイコバクテリアのエレクトロポレーション。水銀耐性及びカナマイシン耐性を有するｐＭＲ００１及びｐＶＮ２を用いてスメグマ菌、うし型結核菌および結核菌を電気形質転換した；この際ボーラード（ Baulard）ら（ 1992 、核酸研究（ Nucleic Acid Research） 20巻、 4105）が報告したようなエレクトロポレーション器械（ Eurogentec S.A.）を用いた。緑膿菌のｍｅｒオペロンの転写−翻訳シグナルはマイコバクテリアには認識されないから、ｐＭＲ００１によって形質転換した細菌を先ず最初に、カナマイシン２０μｇ／ｍｌを補充したミドルブルック寒天７Ｈ１０（ Difco、デトロイト、ＭＩ、ＵＳＡ）上で選択した。 20 受け取るマイコバクテリアに依って５日間か、２または３週間３７℃でインキュベートした後、分離組換えコロニーがこの３種類のマイコバクテリアで得られる。“細菌増殖が認められない最も低い水銀化合物濃度”と定義された最小阻止濃度（ＭＩＣ）を推定するために、細菌懸濁液（１０ 8− １０ 9細菌／ｍｌ）１０ μ ｌをミドルブルック寒天培地７Ｈ１０（ Difco）に滴下するか、または１００ μ ｌを漸増濃度のＨｇＣｌ 2を補充したソートン液体培地１０ｍｌを含むルーのミドルブルック小瓶に接種する。培養基を３７℃で５日間（スメグマ菌）または２ないし３週間（結核菌、うし型結核菌ＢＣＧ）、対照培養基に細菌増殖が検出されるまでインキュベートする。対照マイコバクテリアは固体培地上でＨｇＣｌ 2 ０ .１５ μ ｇ／ｍｌ濃度に顕著な感受性を示すのに対し、プラスミドｐＭＲ００１を担うマイコバクテリアではＨｇＣｌ 2耐性レ 30 ベルが非常に著しく上昇する。細菌増殖の完全阻止は固体培地上における１６０μｇ／ｍｌの濃度で初めて認められる。ＨｇＣｌ 2に関する最小阻止濃度（ＭＩＣ）をソートン液体培地上で決定する場合は、細菌増殖の完全阻止は非形質転換 -対照マイコバクテリアではＨｇＣｌ 2 １ μ ｇ／ｍｌ濃度で認められる（表２）。これに対してプラスミドｐＭＲ００１を担うマイコバクテリアはＨｇＣｌ 2 ２０ μ ｇ／ｍｌ濃度でも増殖することができる。３種類のマイコバクテリア中、１５ μ ｇ／ｍｌのＨｇＣｌ 2に耐性を示す１２クローンのプラスミドＤＮＡをその後、ボーラードが記載したように（ 1992、上記） electroduction によって大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに移す。 40 水銀耐性の大腸菌トランスフォームドプラスミドは正常な消化プランを示す。期待通り、プラスミドｐＭＲ００１によって与えられる水銀耐性は無機水銀に制限され、有機水銀化合物には関係しない。ｐＭＲ００１及びｐＶＮ２の水銀耐性がマイコバクテリの形質転換のための直接選択マーカーとして使用できるかどうかを確認するために、２つのプラスミドのうち１つでエレクトロポレートしたうし型結核菌ＢＣＧ、スメグマ菌及び結核菌マイコバクテリアをＨｇＣｌ2 １２μｇ／ｍｌを補充した寒天培地７Ｈ１０に直接培養した。菌種に応じて５ないし１５日培養後、ｐＭＲ００１１ μ ｇあたり１０ 3耐性コロニーが得られた。無機水銀及び有機水銀化合物（ＰＭＡ）に対する耐性を発現するプラスミドｐＶＮ２で同じ操作を行う。非形質転換スメグマ菌、うし型結核菌ＢＣＧ及び結核菌のＭＩＣはＰＭＡ 50 (9) JP 3680315 B2 2005.8.10 に関して０ .１５ μ ｇ／ｍｌ以下である。上記のようにエレクトロポレーションによって得たｐＶＮ２担持マイコバクテリアはＨｇＣｌ 2 ４０ μ ｇ／ｍｌ濃度までの、そしてＰＭＡ５μｇ／ｍｌ濃度までの寒天培地上で増殖する。ＰＭＡ１０μｇ／ｍｌを含む寒天ボックス７Ｈ１０上で２５日後に１０ 3／ μ ｇの耐性コロニーがあらわれる。ソートン液体培地では３種類のマイコバクテリアの非形質転換細菌でＰＭＡ０ .１５ μ ｇ／ｍｌ濃度で増殖阻止が認められる。ｐＶＮ２によって形質転換したマイコバクテリアでは水銀耐性レベルはＰＭＡ５μｇ／ｍｌまたはＨｇＣｌ 2 ４０ｍｇ／ｍｌと推定される（表２）。得られた結果を図３ないし図８にまとめる。すべての場合に、 electroductionによる大腸菌の逆形質転換によって、耐性マイコバクテ 10 リアのクローンに期待のプラスミドが存在することが確認される。例２：砒素耐性を有するシャトルベクターの構造プラスミドｐＬＯＦ／Ａｓは、種々の腸内細菌において分離されたプラスミドｐＲ７７３に由来する遺伝子ａｒｓＡ及びａｒｓＢを担う。２つの遺伝子はアエロバクチンプロモーターのコントロール下におかれている。ｐＬｏｆ／Ａｓの酵素Ｍ１ｕＩによる消化によって３ .４ｋｂ断片が得られた；それはａｒｓＡ、ａｒｓＢ及びアエロバクチンプロモーターを担う。この断片の末端をＤＮＡポリメラーゼＩで塞ぎ、その後の断片をシャトルベクター、大腸菌ーマイコバクテリウムｐＹＵＢ１２の単一部位ＳｃａＩにクローン化した。このベクターの構造はスナッパー（ Sn 20 apper）らが報告した（ PNAS,1988,85巻、 6987− 6991ページ；及び Mol.Microbiol.,1990, ４巻、 1911− 1919）。プラスミドｐＶＮ３はスメグマ菌に１０ｍｇ／ｌ程度の硝酸砒素（ＡｓＮＯ 3）耐性を与える。このプラスミドは図９に線図の形で示される。結論：得られた結果は、重金属である水銀及び砒素に対する耐性を発現するベクター類を、組換えマイコバクテリアの選択マーカーとして用いることができることを示している。したがって本発明に関係するシャトルベクターは、異種遺伝子を、この異種遺伝子を発現することができる宿主マイコバクテリアに伝達することができ、この伝達は直ちに効率があらわれ、利用しやすく、選択しやすい。 30 (10) JP 3680315 B2 2005.8.10 10 20 30 (11) JP 3680315 B2 2005.8.10 10 20 【図１】【図２】 (12) 【図３】【図４】【図５】【図６】 JP 3680315 B2 2005.8.10 (13) 【図７】【図９】【図８】 JP 3680315 B2 2005.8.10 (14) JP 3680315 B2 2005.8.10 フロントページの続き 7 (51)Int.Cl. ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 1:325 ) Ｃ１２Ｒ 1:325 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:32 Ｃ１２Ｒ 1:32 Ｃ１２Ｒ ) (73)特許権者エスティティパストゥールデリルフランス国５９０１９リルセデックスベー．ペー．２４５ルーカルメ１番地 (74)代理人弁理士西郷義美 (72)発明者エスカイアヴィンセントフランス国９１３００マシールージョルジュマンデル３番地 (72)発明者バーラーアランベルギー国ベー−７５００トルナイグランプラス６番地 (72)発明者ベルシェパトリックフランス国９２２００サン−クロードルータエール６４番地 (72)発明者ロシュカミールフランス国５９８３０ワネインルードゥヴァルプレ１４番地 (72)発明者アダナディアフランス国７５０１２パリルーデランベルヴィラース６番地審査官斎藤真由美 7 (58)調査した分野(Int.Cl. ，ＤＢ名) C12N 15/00 - 90 C12P 1/00 - 41/00 C12N 1/00 - 9/99 G01N 33/50 - 98 PubMed,MEDLINE(STN) BIOSIS/WPI(DIALOG) EUROPAT(QUESTEL)