高吸着・高分離型精製用担体(TOYOPEARL) 用いた タンパク質の分離 を 東ソー(株) バイオサイエンス事業部 開発部 セパレーションセンター 主任研究員 Tosoh Corporation, Bioscience division 久保 雄二 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 1 バイオ医薬品の製造プロセス 培養液 キャプチャー 工程 Capture step 中間精製工程 Intermediate step 最終精製工程 Polishing step ゲルの粒子サイズ 大型カラム 粗精製 高流速 100-300 μm 主な不純物の除去 50-150 μm 微量不純物や 凝集体の除去 20-50 μm 高純度製品(純度; 99.9 - 99.99%) Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 2 プロセスクロマトグラフィー用充填剤 TOYOPEARL® & TSKgel® バイオ医薬品精製用充填剤 • • Protein, peptide, nucleotide, saccharide, API, food additives IgG, mAb, Factor VIII, insulin, oligoDNA, etc. プロセススケール用充填剤 • TOYOPEARL はラージスケールカラムで使用可能(200cmI.D.) 高分離 • • TOYOPEARL 粒子サイズ 20~200 μm TSKgel 粒子サイズ 20~30 μm 分離モード • SEC, IEC, HIC, AFC, Mixed-mode 高耐久性(化学的、物理的に安定) FDA(DMF)登録済 Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 3 TOYOPEARL & TSKgel 主要ラインアップ ターゲットプロセス Capture Intermed. Polishing 主な用途 OΟΟ O OΟΟ ΟΟ OΟΟ OΟΟ Ο ΟΟ ΟΟ ΟΟ OΟΟ ΟΟ ΟΟ OΟΟ Ο ΟΟΟ Ο ΟΟ Ο Ο ΟΟ Protein, IgG Protein, oligoDNA Protein, Pro-insulin, Factor VIII Small protein, oligoDNA Protein Protein Factor VIII 75 35 75 100 35, 65, 100 35, 65, 100 200 OΟΟ O OΟΟ OΟΟ Ο Ο OΟΟ ΟΟ ΟΟ ΟΟ ΟΟ OΟΟ OΟΟ Ο ΟΟΟ Ο Protein, IgG Protein, IgG, Insulin Protein, IgG Small protein, peptide Protein PEG protein, peptide Insulin アニオン交換 アニオン交換 カチオン交換 カチオン交換 20, 30 20, 30 20, 30 30 Ο Ο Ο Ο ΟΟ ΟΟ ΟΟ ΟΟ OΟΟ OΟΟ OΟΟ OΟΟ タイプ 粒子径 (μm) カチオン交換& 疎水性 75 タイプ 粒子径 (μm) ® TOYOPEARL GigaCap Q-650M TOYOPEARL GigaCap® Q-650S TOYOPEARL GigaCap® DEAE-650M TOYOPEARL® SuperQ-650 TOYOPEARL® Q-600C AR TOYOPEARL® QAE-550C TOYOPEARL® DEAE-650 アニオン交換 アニオン交換 アニオン交換 アニオン交換 アニオン交換 アニオン交換 アニオン交換 75 35 75 35, 65, 100 100 100 35, 65, 100 ® TOYOPEARL GigaCap S-650M TOYOPEARL GigaCap® S-650S TOYOPEARL GigaCap® CM-650M TOYOPEARL® SP-550C TOYOPEARL® SP-650 TOYOPEARL® CM-650 TOYOPEARL® MegaCap II SP-550EC カチオン交換 カチオン交換 カチオン交換 カチオン交換 カチオン交換 カチオン交換 カチオン交換 ® TSKgel DEAE-5PW TSKgel ® SuperQ-5PW TSKgel ® SP-5PW TSKgel ® SP-3PW イオン交換体 ミックスモード TOYOPEARL® MX-Trp-650M アフィニティーモード TOYOPEARL® AF-rProtein A-650F タイプ アフィニティー 新製品 Tosoh Corporation, Bioscience division 粒子径 (μm) 45 ΟΟ ΟΟ Protein OligoDNA PEG protein Insulin ターゲットプロセス Capture Intermed. Polishing 主な用途 ΟΟΟ Protein, IgG OΟΟ Ο ターゲットプロセス Capture Intermed. Polishing OΟΟ 主な用途 IgG ※ SEC, HIC は省略 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 4 新商品① 高吸着容量型イオン交換体 グレード TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M TOYOPEARL GigaCap Q-650S TOYOPEARL GigaCap S-650S 官能基 -R-CH2CH2N(CH2CH3)2 -R-N(CH3)3+Cl-R-SO3-Na+ <特長 TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M> 1. キャプチャー工程、中間精製工程用充てん剤 2. ジエチルアミノエチル基を有する 3. 高流速でも高い吸着容量を有する <特長 TOYOPEARL GigaCap S-650S, Q-650S> 1. 中間精製工程、最終精製工程用充てん剤 2. 高吸着容量で高分離能を有する Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 5 TOYOPEARL GigaCap DEAE-650Mの基本性能 DEAEタイプゲル TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M TOYOPEARL GigaCap Q-650M TOYOPEARL DEAE-650M Brand A (agarose, DEAE) Brand B (graft type, DEAE) (eq/L) 動的吸着容量 (DBC) (g/L-gel) 回収率 (DBC) (%) 0.23 0.17 0.11 0.29-0.35 - 165 172 25 140 - 100 97 97 96 - 粒子径 イオン交換容量 (μm) 50-100 50-100 40-90 90(median) 40-90 静的吸着容量 (g/L-gel) 179 191 30 143 52 <動的吸着容量測定条件> 動的吸着容量は10%破過曲線から計算した カラムサイズ: 6 mm I.D. x 4 cm 吸着緩衝液: 0.05 mol/L Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.5) 溶出緩衝液: 0.05 mol/L Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.5) + 0.5 mol/L NaCl 負荷線速度: 212 cm/hr 検出: UV (280 nm) サンプル: BSA (1 g/L) <静的吸着容量測定条件> 吸着緩衝液:0.05 mol/L Tris-HCl 緩衝液 (pH8.5) タンパク質濃度10 g/L, 負荷タンパク質量; BSA 210 g/L-gel TOYOPEARL GigaCap DEAE-650Mは、高い吸着容量を示します Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 6 0.5 mol/L NaOHによるCIP耐久性(DEAE タイプ) 180 160 DBC (g/L) 140 120 100 80 60 40 20 TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M 0 0 20 40 60 80 CIP cycle (times) 100 120 CIP 条件 アルカリ洗浄溶媒: 0.5 mol/L NaOH 洗浄緩衝液: 0.05 mol/L Tris-HCl (pH8.5) + 0.5 mol/L NaCl, 洗浄速度: 0.5 mL/min. アルカリ洗浄量: 27 CV / cycle, 洗浄時間: 1 hr 緩衝液洗浄量: 10 CV / cycle 動的吸着容量測定条件 カラムサイズ : 6 mm I.D. X 4 cm 吸着緩衝液: 0.05 mol/L Tris-HCl (pH 8.5) サンプル : BSA (1 g/L), 負荷流速: 1 mL/min. 検出 : UV (280 nm) TOYOPEARL GigaCap DEAE-650Mは、高い化学的安定性を示します Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 7 タンパク質の分離選択性(DEAE タイプ) 180 TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M 160 TOYOPEARL GigaCap Q-650M 140 TOYOPEARL DEAE-650M Brand A (agarose, DEAE) 120 mV 100 2 80 1 60 3 40 20 0 -20 0 10 20 30 40 Retention time (min.) 50 60 測定条件 カラムサイズ: 7.5 mm I.D. x 7.5 cm 緩衝液 A: 0.05 mol/L Tris-HCl (pH 8.5) 緩衝液 B: 0.05 mol/L Tris-HCl + 1.0 mol/L NaCl (pH 8.5) グラジエント条件: 緩衝液A 100% から緩衝液B 100%まで120分 リニア―グラジエント 流速: 1.0 mL/min, 検出: UV (280nm) サンプル: 1. トランスフェリン (2.9 g/L), 2. オブアルブミン (6.5 g/L), 3. 大豆トリプシンインヒビター(10.0 g/L) インジェクション量: 100 µL Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 8 カラム圧力損失(DEAE タイプ) 0.30 Brand A (agarose, DEAE) Column pressure (MPa) 0.25 0.20 0.15 TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M 0.10 0.05 0.00 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Linear Velocity (cm/hr) カラムサイズ: 22 mm I.D. x 20 cm 溶媒 : 0.1 mol/L NaCl 水溶液 Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 9 <まとめ> TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M • DEAEタイプの高吸着容量型 弱アニオン交換体 • 潜在的用途: Factor VIII、Pro-insulin分離精製など • 従来のTOYOPEARL DEAE-650Mより、保持力はやや強い • TOYOPEARL GigaCap Q-650Mより、保持力は弱い 2013年5月発売 Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 10 TOYOPEARL GigaCap Q-650Sの基本性能 アニオン交換体 TOYOPEARL GigaCap Q-650S TOYOPEARL GigaCap Q-650M Brand C ( agarose, Q ) Brand D ( agarose, Q ) 回収率 (DBC) 静的吸着容量 (eq/L) 動的吸着容量 (DBC) (g/L-gel) (%) (g/L-gel) 0.20 0.17 0.15 0.12 191 172 81 40 99 97 99 100 200 191 114 92 粒子サイズ イオン交換容量 (μm) 20-50 50-100 24-44 36-44 (median) <動的吸着容量測定条件> 動的吸着容量は10%破過曲線から計算した カラムサイズ: 6 mm I.D. x 4 cm 吸着緩衝液: 0.05 mol/L Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.5) 溶出緩衝液: 0.05 mol/L Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.5) + 0.5 mol/L NaCl 負荷線速度: 212 cm/hr 検出: UV (280 nm) サンプル: BSA (1 g/L) <静的吸着容量測定条件> 吸着緩衝液:0.05 mol/L Tris-HCl 緩衝液 (pH8.5) タンパク質濃度10 g/L, 負荷タンパク質量; BSA 210 g/L-gel TOYOPEARL GigaCap Q-650Sは、高い吸着容量を示します Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 11 0.5 mol/L NaOHによるCIP耐久性(Q タイプ) 200 180 160 DBC (g/L) 140 120 100 80 60 40 TOYOPEARL GigaCap Q-650S 20 0 0 20 40 60 80 100 120 CIP cycle (times) CIP 条件 アルカリ洗浄溶媒: 0.5 mol/L NaOH 洗浄緩衝液: 0.05 mol/L Tris-HCl (pH8.5) + 0.5 mol/L NaCl, 洗浄速度: 0.5 mL/min. アルカリ洗浄量: 27 CV / cycle, 洗浄時間: 1 hr 緩衝液洗浄量: 10 CV / cycle 動的吸着容量測定条件 カラムサイズ : 6 mm I.D. X 4 cm 吸着緩衝液: 0.05 mol/L Tris-HCl (pH 8.5) サンプル : BSA (1 g/L), 負荷流速: 1 mL/min. 検出 : UV (280 nm) TOYOPEARL GigaCap Q-650Sは、高い化学的安定性を示します Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 12 タンパク質の分離選択性(Q タイプ) 690 2 1 3 590 TSKgel DEAE-5PW (30) 490 ・TOYOPEARL GigaCap Q-650Sは Mグレードとほぼ同じ選択性を有し ピークは、よりシャープです ・他のゲルに比べ保持が強い TOYOPEARL DEAE-650S 390 mV TSKgel Super Q-5PW (30) 290 測定条件 カラムサイズ: 7.5 mm I.D. x 7.5 cm 緩衝液 A: 0.05 mol/L Tris-HCl (pH 8.5) 緩衝液 B: 0.05 mol/L Tris-HCl + 1.0 mol/L NaCl (pH 8.5) グラジエント条件: 緩衝液A 100% から緩衝液B 100%まで 120分 リニア―グラジエント 流速: 1.0 mL/min, 検出: UV (280nm) サンプル: 1. トランスフェリン (2.9 g/L) 2. オブアルブミン (6.5 g/L) 3. 大豆トリプシンインヒビター(10.0 g/L) インジェクション量: 100 µL TOYOPEARL Super Q-650S 190 Brand D (agarose, Q) TOYOPRAL GigaCap Q-650M 90 TOYOPRAL GigaCap Q-650S -10 0 10 20 30 40 Retention time (min.) Tosoh Corporation, Bioscience division 50 60 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 13 ウシ血清アルブミンの分離(Q タイプ) 450 400 pH 8.5 , 120 min. 350 TOYOPEARL DEAE-650S 【測定条件】 カラムサイズ: 7.5 mm I.D. x 7.5 cm <分離条件-1> 緩衝液 A: 0.02 mol/L Bis-Tris (pH 6.0) 緩衝液 B: 0.02 mol/L Bis-Tris + 1.0 mol/L NaCl (pH 6.0) <分離条件-2> 緩衝液 A: 0.05 mol/L Tris-HCl (pH 8.5) 緩衝液 B: 0.05 mol/L Tris-HCl + 1.0 mol/L NaCl (pH 8.5) <分離条件-3> 緩衝液 A: 0.02 mol/L ピペラジン (pH 9.5) 緩衝液 B: 0.02 mol/L ピペラジン + 1.0 mol/L NaCl (pH 9.5) グラジエント(1): 緩衝液A 100% から緩衝液B 100% まで120分 リニア―グラジエント グラジエント(2): 緩衝液A 100% から緩衝液B 100% まで240分 リニア―グラジエント 流速: 1.0 mL/min, 検出: UV (280nm) サンプル:. BSA (7.1 g/L) インジェクション量: 100 µL 300 pH 8.5 , 120 min. mV 250 TOYOPEARL Super Q-650S 200 150 pH 6.0 , 120 min. pH 8.5 , 120 min. Brand C (agarose, Q) 100 TOYOPEARL GigaCap Q-650S 50 pH 6.0 , 120 min. pH 8.5 , 120 min. aggregate pH 9.5 , 240 min. 0 -50 0 20 40 60 80 100 Retention time (min.) Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 14 TOYOPEARL GigaCap S-650Sの基本性能 カチオン交換体 TOYOPEARL GigaCap S-650S TOYOPEARL GigaCap S-650M Brand E (agarose, SP) Brand F (agarose, S) (eq/L) 動的吸着容量 (DBC) (g/L-gel) 回収率 (DBC) (%) 0.24 0.16 0.15 0.12 164 145 65 27 99 98 100 100 粒子サイズ イオン交換容量 (μm) 20-50 50-100 24-44 36-44 (median) 静的吸着容量 (g/L-gel) 177 156 105 89 <動的吸着容量測定条件> 動的吸着容量は10%破過曲線から計算した カラムサイズ: 6 mm I.D. x 4 cm 吸着緩衝液: 0.05 mol/L 酢酸緩衝液 (pH 4.7) 溶出緩衝液: 0.05 mol/L 酢酸緩衝液 (pH 4.7) + 0.5 mol/L NaCl 負荷線速度: 212 cm/hr, 検出: UV (280 nm) サンプル: gamma-Globulin (1 g/L) <静的吸着容量測定条件> 吸着緩衝液: 0.05 mol/L 酢酸緩衝液 (pH4.7) TOYOPEARL GigaCap S-650Sは、高い吸着容量を示します Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 15 0.5 mol/L NaOHによるCIP耐久性(S タイプ) 200 180 160 DBC (g/L) 140 120 100 80 60 40 TOYOPEARL GigaCap S-650S 20 0 0 20 40 60 80 100 120 CIP cycle (times) CIP 条件 アルカリ洗浄溶媒: 0.5 mol/L NaOH 洗浄緩衝液: 0.05 mol/L 酢酸緩衝液 (pH4.7) + 0.5 mol/L NaCl, 洗浄速度: 0.5 mL/min. アルカリ洗浄量: 27 CV / cycle, 洗浄時間: 1 hr 緩衝液洗浄量: 10 CV / cycle 動的吸着容量測定条件 カラムサイズ : 6 mm I.D. X 4 cm 吸着緩衝液: 0.05 mol/L 酢酸緩衝液 (pH 4.7) サンプル : gamma-Globulin (1 g/L), 負荷流速: 1 mL/min. 検出 : UV (280 nm) TOYOPEARL GigaCap S-650Sは、高い化学的安定性を示します Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 16 タンパク質の分離選択性(S タイプ) 3 380 1 330 2 ・TOYOPEARL GigaCap S-650Sは Mグレードとほぼ同じ選択性を有し ピークは、よりシャープです ・他のゲルに比べ保持が強い 280 230 mV TSKgel SP-5PW (20) 180 TOYOPEARL SP-650S 130 Brand F (agarose, S) 80 Brand E (agarose, SP) 30 TOYOPEARL GigaCap S-650M TOYOPEARL GigaCap S-650S -20 0 10 20 Retention time (min.) Tosoh Corporation, Bioscience division 30 測定条件 カラムサイズ: 7.5 mm I.D. x 7.5 cm 緩衝液 A: 0.02 mol/L リン酸緩衝液 (pH 7.0) 緩衝液 B: 0.02 mol/L リン酸緩衝液 + 1.0 mol/L NaCl (pH 7.0) グラジエント: 緩衝液A 100% から緩衝液B 100% まで60分 リニア―グラジエント 流速: 1.0 mL/min 検出: UV (280nm) サンプル:1. リボヌクレアーゼ A (9.8 mg/mL) 2. チトクローム C (3.6 mg/mL) 3. リゾチーム (6.4 mg/mL) インジェクション量: 20 µL 40 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 17 カラム圧力損失(S, Q タイプ) 3.0 3.0 TOYOPEARL GigaCap S-650S 2.5 2.5 Column pressure (MPa) Colum pressure (MPa) Brand C (agarose, Q) 2.0 1.5 Brand E (agarose, SP) 1.0 2.0 1.5 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 0 200 400 600 Flow linear velocity (cm/hr) 800 1000 TOYOPEARL GigaCap Q-650S 0 100 200 300 400 500 600 700 Flow linear velocity (cm/hr) カラムサイズ: 22 mm I.D. x 20 cm 溶媒 : 0.1 mol/L NaCl 水溶液 Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 18 800 <まとめ> TOYOPEARL GigaCap Q-650S TOYOPEARL GigaCap S-650S • 高吸着容量型/高分離能イオン交換体,微粒子(35 μm) • 高純度精製、最終精製(ポリッシング)に適しています • リニアグラジエント分離に適しています 2013年5月発売 Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 19 新商品② ミックスモードTOYOPEARL O OCH2CNH H C COONa Weak cation exchange CH2 TOYOPEARL Hydrophobic N H 製品名: TOYOPEARL MX-Trp-650M リガンド : トリプトファン 粒子径分布: 50-100 µm Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 20 TOYOPEARL MX-Trp-650Mの基本性能 充填剤 TOYOPEARL MX-Trp-650M TOYOPEARL GigaCap CM-650M TOYOPEARL GigaCap S-650M Brand M (Agarose Multi-mode resin) (eq/L) 動的吸着容量 *1 (g/L-gel) 回収率 *1 (%) 動的吸着容量 *2 (g/L-gel) 回収率 *2 (%) 0.12 0.24 0.16 0.069 95 18 2 14 97 86 48 0 0 11 96 85 粒子径 イオン交換 容量 (μm) 50-100 50-100 50-100 75 (median) <動的吸着容量測定条件> 動的吸着容量は10%破過曲線から計算した カラムサイズ: 6 mm I.D. x 4.0 cm 吸着緩衝液 *1: 0.05 mol/L 酢酸緩衝液 (pH 4.7) + 0.10 mol/L 塩化ナトリウム 吸着緩衝液*1 の伝導度は、およそ12 mS/cm 吸着緩衝液 *2: 0.05 mol/L 酢酸緩衝液 (pH 4.7) + 0.15 mol/L 塩化ナトリウム 吸着緩衝液*2 の伝導度は、およそ17 mS/cm 溶出緩衝液: 0.1 mol/L Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.5) + 0.3 mol/L 塩化ナトリウム 負荷線速度: 212 cm/hr, 検出: UV (280 nm) サンプル: ポリクローナル ヒト IgG (1 g/L) TOYOPEARL MX-Trp-650Mは、高塩濃度でも高い吸着容量を示します Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 21 動的吸着容量の塩濃度耐性(MX-Trp-650M) 120 Human IgG DBC (g/L) 100 80 0.00 0.10 0.15 0.20 60 mol/L mol/L mol/L mol/L NaCl NaCl NaCl NaCl 40 20 0 3.5 4 4.5 5 5.5 Loading buffer pH 6 6.5 <動的吸着容量測定条件> 動的吸着容量は10%破過曲線から計算した カラムサイズ: 6 mm I.D. x 4.0 cm 吸着緩衝液: 0.05 mol/L 酢酸緩衝液 (pH 4.0, 4.3, 4.7, 5.0, 5.5, 6.0) + 塩化ナトリウム(0.0, 0.1, 0.15, 0.2 mol/L) 溶出緩衝液: 0.1 mol/L Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.5) + 0.3 mol/L 塩化ナトリウム 負荷線速度: 212 cm/hr, 検出: UV (280 nm) サンプル: ポリクローナル ヒト IgG (1 g/L) 高塩濃度下でも、pHを下げることにより高い吸着容量を維持 Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 22 モノクローナルIgGの精製例(MX-Trp-650M) 900 1000 mAb/CHO Cell Protein Breakthough curve 800 DBC loading solutrion 700 mAb DBC = 93 g/L Yield 96% 600 400 600 200 500 mV mV DBC elution fraction 800 0 0 20 40 60 80 100 120 monoclonal antibody 400 140 -200 Time(min.) 動的吸着容量測定条件 カラムサイズ: 6 mm I.D. x 4.0 cm 吸着緩衝液: 0.05 mol/L 酢酸緩衝液 (pH 4.7) + 0.1 mol/L 塩化ナトリウム 溶出緩衝液: 0.1 mol/L Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.5) + 0.3 mol/L 塩化ナトリウム 負荷流速: 1.0 mL/min.(212 cm/h), 溶出流速: 2.0 mL/min. 検出: UV (280 nm) 負荷サンプル: 0.05 mol/L 酢酸緩衝液 pH 4.7 + 0.1 mol/L 塩化ナトリウムの 緩衝液へCHO Cell culture とモノクローナルIgGを溶解させた溶液 モノクローナル IgG の濃度: 1 g/L 負荷サンプル溶液の伝導度: 12 mS/cm 300 200 100 0 0 5 10 Retention time (min.) 15 20 溶出フラクションのSEC分析条件 カラム: TSKgel G3000SWXL, 7.8 mm I.D. X 30 cm 溶離液: 0.1 mol/L リン酸緩衝液 + 0.3 mol/L 塩化ナトリウム (pH 7.0) 流速: 1.0 mL/min, 検出: UV (280 nm) サンプル: 左図の分離で得られた各フラクション インジェクション量: 100 µL ※精製mAb中の残存HCP量は今後ELISAで確認予定 Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 23 モノクローナル抗体の凝集体分離(MX-Trp-650M) 120 200 B% monomer 180 160 140 80 120 mV 100 aggregate (HMW) 100 80 60 aggregate (Dimer) 60 40 40 20 Buffer B (%) 220 20 0 1 -20 0 2 3 4 5 6 7 20 8 910 11 40 60 80 Retention time (min.) 12 13 100 0 120 カラムサイズ: 7.5 mm I.D. x 7.5 cm 緩衝液 A: 0.04 mol/L リン酸 + 0.03 mol/L シュウ酸 + 0.2 mol/L 塩化ナトリウム (pH 4) 緩衝液 B:緩衝液 A + 0.3 mol/L 塩化ナトリウム (pH 7) 流速:1mL/min. 検出:UV (280nm) サンプル: モノクローナル抗体 5.6 g/L (50℃で1hインキュベーションした抗体を一部含む) インジェクション量:200μL Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 24 モノクローナル抗体の凝集体分離 (溶出フラクションのSEC分析-1 MX-Trp-650M) 45 13 monoclonal antibody original sample solution 40 35 monomer 30 9 20 mV mV 25 aggregate (HMW) aggregate (dimer) 15 7 5 10 3 5 1 0 Fraction-2 Fraction-3 Fraction-4 Fraction-5 Fraction-6 -1 -5 0 5 10 15 Elution time (min.) 20 0 25 5 10 15 Elution time (min.) 20 25 0.5 5 4 0.4 monomer Fraction-3 3 0.2 Fraction-5 1 Fraction-8 0.1 Fraction-6 0 monomer 0.3 Fraction-4 2 dimer mV mV monomer 11 Fraction-9 0 Fraction-10 -0.1 -1 0 5 10 15 Elution time (min.) 20 25 0 5 10 15 Elution time (min.) 20 25 カラム: TSKgel G3000SWXL, 7.8 mm I.D. X 30 cm 溶離液: 0.1 mol/L リン酸緩衝液 + 0.2 mol/L アルギニン (pH 6.8) 流速: 1.0 mL/min, 検出: UV (280 nm) サンプル: スライド1の分離で得られた各フラクション インジェクション量: モノクローナル抗体オリジナルサンプル溶液7.5 µL , 各フラクション100 µL Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 25 モノクローナル抗体の凝集体分離 (溶出フラクションのSEC分析-2 MX-Trp-650M) 45 2 monoclonal antibody original sample solution 40 35 1.5 monomer 30 HMW 1 20 aggregate (HMW) 15 mV mV 25 aggregate (dimer) 0.5 10 5 Fraction-13 0 0 -5 -0.5 0 5 10 15 Elution time (min.) 20 25 0 5 10 15 20 25 Elution time (min.) カラム: TSKgel G3000SWXL, 7.8 mm I.D. X 30 cm 溶離液: 0.1 mol/L リン酸緩衝液 + 0.2 mol/L アルギニン (pH 6.8) 流速: 1.0 mL/min, 検出: UV (280 nm) サンプル: スライド1の分離で得られた各フラクション インジェクション量: モノクローナル抗体オリジナルサンプル溶液7.5 µL , 各フラクション100 µL Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 26 <まとめ> TOYOPEARL MX-Trp-650M • 高塩耐性/高吸着容量型カチオン交換ミックスモード充填剤 • キャプチャー、中間精製工程に利用可能 • 潜在的用途: 抗体精製(キャプチャー工程、凝集体除去) Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 27 ■連絡先 東ソー株式会社 バイオサイエンス事業部 東京本社 営 業 部 大阪支店 バイオサイエンスG 名古屋支店 バイオサイエンスG 福岡支店 山口営業所 カスタマーサポートセンター (03) 5427-5180 (06) 6209-1948 (052) 211-5730 (092) 781-0481 (0834)63-9888 (0120)17-1200 開発部セパレーションセンター (0834)63-9864, FAX (0834)63-9879 〒746-8501 山口県周南市開成町4560 〒105-8623 〒541-0043 〒460-0008 〒810-0001 〒746-0015 〒252-1123 東京都港区芝3-8-2 大阪市中央区高麗橋4-4-9 名古屋市中区栄1-2-7 福岡市中央区天神1-13-2 山口県周南市清水1-6-1 神奈川県綾瀬市早川2743-1 ■ホームページ http://www.separations.asia.tosohbioscience.com/ ■お問合せe-mail [email protected] ◆御清聴ありがとうございました◆ Tosoh Corporation, Bioscience division 第65回 日本生物工学会大会ランチョンセミナー 28
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