2002,Dec Ｆ−キットシュウ酸（半量法:20回用）紫外部吸光度測定法約10回測定用製品番号 755699 ㈱J.K.インターナショナル一般、食品分析酵素試薬測定原理 Oxalate decarboxylase formate + CO 2 （１）Oxalate formate dehydrogenase （２）Formate + NAD + + H2O HCO 3- + NADH + H + （２）式で生成したNADHの量を340nmでの吸光度の増加で定量します。 Oxalate decarboxylase：シュウ酸脱炭酸酵素 formate dehydrogenase：ギ酸脱水素酵素ｄｄ試薬溶液の調製ビン1 １本包装内容ビン3 ビン2 ビン4 溶液Ⅱ 溶液Ⅳ 溶液Ⅲ ビン1の内容物をそのままビン2の内容物をそのビン4の内容物をビン3のビン5の内容物を1.2mlの蒸留水で溶解使用（3ml）まま使用（0.5ml）緩衝液で溶解（45ml）１本１本溶液Ⅰ ビン5 １本 (ﾘﾝ酸ｶﾘｳﾑ緩衝液) (β-NAD) １本溶液の成分リン酸カリウム/クエン酸シュウ酸脱炭素酵素 β-NAD：約420mg リン酸カリウム緩衝液：約8U 緩衝液：pH5.0 ：0.1M,pH9.5 安定化剤ギ酸脱水素酵素：約80U（約200mg） 4℃で2週間 4℃で1年 4℃で20日間、-20℃で 4℃で1年使用前に20∼25℃に加温使用前に20∼25℃に加温 6週間 ※ シュウ酸標準液を添加回収試験、日常のコントロール、スタンダード法、検量線法にご利用下さい。調製後の安定性測定操作法測定条件下記の如くセミマイクロキュベットに採取します。ブランク試料溶液Ⅰ 0.050ml 試料 0.100ml 0.050ml 0.100ml 溶液Ⅱ - 0.025ml 混和し、20∼25℃で30分間インキュベーションします。溶液Ⅲ 1000ml 1000ml 蒸留水 0.225ml 混和し、2分後にE1を測定します。 0.200ml 0.025ml 0.025ml 溶液Ⅳ 波長： 340nm 光路長： 1cm 温度終量対照： 20∼25℃ ： 1.40ｍｌｷｭﾍﾞｯﾄ：ｾﾐﾏｲｸﾛｷｭﾍﾞｯﾄ（約1.5ml用）：水試料量： 1キュベット当りシュウ酸1∼10μgを含む測定限界混和し、20∼25℃で20分間インキュベーション（セミマイクロキュベットはパラフィルムでおおう）した後、E2を測定します。シュウ酸の量は1セミマイクロキュベット当り1μg∼10μgまでが限界ですので試料液はシュウ酸濃度が0.01∼0.1ｇ/ｌの範囲になるように希釈して下さい。シュウ酸g/l 蒸留水 < 0.1g - 1 計算 0.1 ∼ 1.0g 1 + 9 10 シュウ酸の量は次の式で求めます。 V×MW シュウ酸(g/l)= × △E ε×d×ｖ×1000 1.0 ∼ 10g 1 + 99 100 △E ＝（E2 - E1）試料-（E2 - E1）ブランクＶ（反応液量）ＭＷ（分子量）ｄ（光路長） ε（分子吸光係数）もし、試料の濃度で0.01g/l以下の場合、キュベットに秤取する試料の量を0.25ml まで増やすことが出来ます。この場合、反応液量をかえないために蒸留水を減らして下さい。また、計算時にｖがかわってきます。ご注意下さい。 :1.40ml :90.04 :1cm :6.3cm〔1×mmol -1×cm-1〕 1.4 × 90.4 シュウ酸（g/l）＝ × △E 6.3 × 1 × 0.1 × 1000 = 0.200 × △E 希釈率（F）