TECNOLOGIE PER LINEE CELLULARI E CELLULE STAMINALI – aa 2013-2014 ESERCITAZIONE: ALLESTIMENTO DI UNA COLTURA PRIMARIA Introduzione L’esercitazione ha lo scopo di fornire allo studente le conoscenze di base per l’isolamento di cellule da tessuti al fine di allestire una coltura primaria. L’allestimento di una coltura cellulare può avere innumerevoli applicazioni come la produzione di vaccini, l’isolamento di specifiche tipologie cellulari che si desidera studiare, analisi citogenetiche, sviluppo di terreni di coltura selettivi, ingegneria tissutale, test di citossicità. Le fasi per l’allestimento di una coltura primaria sono: 1. Prelievo di un tessuto (biopsia) Il prelievo deve essere effettuato secondo i regolamenti vigenti (es Regolamento italiano DPR 7/1/1992, European Community regulation 86/609,…) e seguendo procedure asettiche. Se il tessuto viene prelevato in un luogo diverso dal laboratorio potrà essere conservato in ghiaccio (+4°C) per non più di 72 ore. 2. Disgregazione delle cellule In base alla tipologia di tessuto e cellule da isolare è possibile procedere con dissociazione enzimatica (es. uso di tripsina), dissociazione meccanica, o espianto (il tessuto non viene dissociato e si lasciano migrare le cellule liberamente da frammenti tissutali in coltura) 3. Incubazione e crescita Il tipo di terreno di coltura, i parametri di incubazione e le tempistiche vengono selezionate in base al tipo di linea cellulare e al modello animale. Approfondimento consigliato: “Isolamento delle cellule e loro crescita in coltura” capitolo 8, pagine 502-511, Biologia molecolare della cellula (Alberts et al. Zanichelli), “Primary culture” capitolo 12, pagine 175-197, Culture of Animal Cells (Freshney RI, Wiley –Liss Pub) TECNOLOGIE PER LINEE CELLULARI E CELLULE STAMINALI – aa 2013-2014 Materiali e Reagenti necessari - Tessuto - Tripsina - Terreno di coltura - PBS con aggiunta di antibiotico e antifungineo - Petri per coltura e dissezione - Bisturi sterile - Puntali e Micropipette - Pipette pasteur sterili - Tubi da centrifuga - Centrifuga - Incubatore Protocollo - Isolare un frammento di tessuto (es. biopsia di 5mm) - Lavare il tessuto in PBS contenente antibiotico e antifungineo - Trasferire il tessuto in una petri e rimuovere grasso e aree necrotiche - Disgregare il tessuto sia enzimaticamente che meccanicamente - Centrifugare il tessuto in medium caldo 5-10 min a 1200 rpm - Eliminare il surnatante - Risospendere il pellet in medium caldo o PBS - Centrifugare 5-10 min a 1200 rpm - Eliminare il surnatante - Trasferire pezzi di tessuto in una petri di coltura distribuendolo su tutta la superficie disponibile - Aggiungere il volume minimo di terreno di coltura così da coprire tutta la superficie della petri (es. petri da 60 mm, aggiungere circa 1,5-2 ml) - Trasferire in incubatore a 38.5°C, 5% CO2, umidità > 90% - Dopo 2-3 giorni le cellule dovrebbero iniziare a migrare dal tessuto - Dopo 1 settimana cambiare il medium