METODI FISICI DI FISSAZIONE • I metodi fisici di fissazione sono rappresentati da: – Calore/essiccamento – Raffreddamento/congelamento • Il calore e l’essiccamento sono impiegati solo in strisci di sangue ed in apposizioni di midollo osseo – di regola sono seguiti da un ulteriore trattamento con metodi chimici. • Il freddo non è un agente fissativo in senso stretto, – non garantisce una stabile conservazione delle strutture biologiche: – quando i tessuti vengono riportati a temperatura ambiente possono aver luogo tutte quelle modificazioni degenerative che intervengono dopo la morte del tessuto. – Il freddo è un agente conservante piuttosto che un vero e proprio fissativo. – molto usato in istochimica, perchè permette: • Conservazione del tessuto, • Indurimento del tessuto per la sezione – Dopo aver ottenuto le sezioni si eseguono le reazioni istochimiche previste e solo successivamente si fissa il tessuto con metodi chimici. (postfissazione) – In questo caso le reazioni istochimiche devono essere di durata relativamente breve (in genere, non più di mezz’ora per scongiurare artefatti da dislocazione o da solubilizzazione di sostanze • • • • • • Il congelamento del materiale oggetto di studio deve essere quanto più rapido possibile. si evita così la formazione di grossi cristalli di ghiaccio, capaci di alterare profondamente la struttura dei tessuti. I cristalli si formano allorché coesistono la fase liquida e quella solida, perché, per motivi termodinamici, è favorita la dissoluzione dei cristalli piccoli a favore dell’accrescimento di quelli più grandi. Un congelamento particolarmente rapido può impedire del tutto la cristallizzazione dell’acqua, stabilizzandola in uno stato solido amorfo, come il vetro (ghiaccio vetroso) Per ottenere un rapido congelamento si devono trattare pezzi molto piccoli (non più spessi di 1—2 mm) , a basse temperature; negli studi più delicati, il congelamento può essere ottenuto mediante – azoto liquido, a —170 C, – isopentano, propano – derivati alogenati del metano e dell’etano (cosiddetti freon), • • In studi meno raffinati un congelamento sufficientemente rapido si può realizzare introducendo i campioni da esaminare in una camera refrigerata, quale quella di un criostato, eventualmente spruzzandovi sopra un gas che, espandendosi, sottragga calore (freon oppure anidride carbonica) . I criostati sono apparecchi usati per sezionare tessuti congelati, costituiti da una camera refrigerata contenente un microtomo, cioè uno strumento per ottenere sezioni istologiche, anch’esso refrigerato. criostato Fissazione per congelamentoessiccamento (freeze-drying) Principi teorici del metodo • Questa tecnica, piuttosto complessa e che richiede l’impiego di apparecchiature costose, proposta da Altmann fin dal 1890, fu ripresa negli anni trenta da Bensley, Gersch, Hoerr e ulteriormente sviluppata in tempi più recenti. • Ha il vantaggio di non richiedere l’uso di liquidi fissatori e trova impiego per ricerche citologiche, istochimiche e, con accorgimenti particolari, in microscopia elettronica. • Il metodo esige: a) b) c) d) rapido prelievo del tessuto, raffreddamento alla temperatura dell’azoto liquido, disidratazione a una temperatura compresa fra -60° e -30°C inclusione in paraffina o carbowax e successivo taglio. Fissazione per congelamentoessiccamento (freeze-drying) • ll raffreddamento rappresenta il passaggio più delicato del metodo, da esso dipende la buona conservazione dei tessuti. • Durante il raffreddamento è necessario evitare la formazione di grossolani cristalli di ghiaccio, che provocano profonde alterazioni nelle cellule e lasciano tracce ben visibili all’analisi microscopica. • Perciò il pezzo deve essere raffreddato il più velocemente possibile; ( formazione di ghiaccio vetroso, non cristallino), • Nella pratica si impiegano pezzi piccoli (1 mm) e un liquido raffreddante con conduttività alta anche alle basse temperature, quale l’isopentano (metilbutano). Fissazione per congelamentoessiccamento (freeze-drying) • La disidratazione si effettua in base al seguente principio: – In un pezzo di tessuto congelato esposto a una pressione di vapore inferiore a quella della pressione di equilibrio del ghiaccio, quest’ultimo sublima con il conseguente essiccamento del tessuto • il pezzo viene posto in un recipiente adeguatamente raffreddato e nel quale venga fatto il vuoto spinto • Il vapore d’acqua viene allontanato con una pompa a vuoto Fissazione per congelamentoessiccamento (freeze-drying) inclusione • Una volta completata la disidratazione il pezzo viene incluso in paraffina o in carbowax: • i pezzi sono lasciati cadere in un piccolo recipiente contenente paraffina che viene portata al punto di fusione • negli apparecchi più perfezionati, l’inclusione avviene nello stesso recipiente nel quale è stata effettuata la disidratazione: