51 昭和40年5月20目原著コレラ菌検索に対する螢光抗体法の応用九州大学医学部細菌学教室神中寛霜鳥コレラ菌の検索に蛍光抗体法を応用することは,Finkelsteinち1),2)Mikhailovお Chibrikovaら4)によびLi3), よつて試みられ,いずれも本翔一武谷健二てこれを用いた. 蛍光抗体の作成:Campbellら13)のて,DEAE-セ法がコレラ菌の迅速診断に利用される可能性がから γ2-グロブリン分画を得あるとし,まてfluorescein た試料中の菌数が少い場合の解決法として,増菌培養1)2),遠 membrane filterの心沈渣の染色3), 利用4)などが考案されている. とくにFinkelsteinおよびGomez2)はフィリピ合,非記載に従つルローズを用いて上記の免疫血清これに常法に従つ isothiocyanate(BBL製)を特異因子をDEAE-セルローズカラムクロマトグラフイーにより除去14)後pervaporationによつて濃縮し,染色用緩衝液(以下緩衝液と略すンにおいて本法を保菌者の検索に応用して好成績 NaH2PO4・H2O,0.4g,Na2HPO4・2H2O,1.99, をあげている. NaCl,89,脱近年インドにおけるアジアコレラ流行に加えて,東南アジアにおけるエルトールコレラの流行が甚だしく,しばしば本邦に侵入の機会があり, とくに航空機による交通の発達の結果,外地で感染して発病せぬまま入国して感染源となつたり, あるいは入国後発病するなどの例もあり,法制面では検疫法の合理的な適用,技改善が望まれ,WHOの術面では検査法の共同研究においても「保結た.得イオン水1000mr)に対して透析しられた蛍光抗体液は試驗管に分注,凍存した.染色には,凝集価160倍結保の抗体液を用いた. 染色材料:実株),エ驗室保存のアジアコレラ菌(14 ルトールコレラ菌(27株),グ (20株),非ラム陰性桿菌コレラ患者および健康者の糞便34例について染色を行つた. 染色:染色は直接法によつた.寒天培養菌は蒸菌者検査時間の短縮」が目的の一つにあげられて留水又は生理食塩水を用いて塗抹標本をつくり, いる.わ自然乾燥せしめた.ペれわれは以前から,コレラ菌の検出ないし鑑i別に対するプアージ5),プロフアージ5)6)7)の応用,血球凝集反応8),抗シンB感受性9)な生物質とくにポリミクどについて報じ,蛍光抗体法についても既に二,三の試み10)11)を行つているが, 本報では糞便内コレラ菌検出についての基礎的実驗についてのべる. 実験方法免疫血清:Java分 E5株(小川型)を離のエルトールコレラ菌J 抗原とし,クによつてウサギを免疫,型た.凝集価は20,480倍ロム明ばん法12) のごとく免疫血清を得であり,本実驗にはすべプトン水培養はそのまゝ, 糞便は約10倍量の生理食塩水で稀釈,充放置してその上清を塗抹した.固より,のせガラスを湿室(バをおき,ガ分混和後定は火焔固定にツトにしめつた濾紙ラス管を枕としてならべ,上はしめつた濾紙でおおつた後ガラス板でふたをする)にらべ,蛍光抗体液をのせ,37℃ った.染色後冷緩衝液で充分洗い,グ衝液(グリセリン:緩なで60分間染色を行衝液=9:1)でリセリン緩封入,検鏡した. 蛍光顕微鏡および写真撮影:Leitz製Ortholux にOSRAM HBO 200高圧水銀ラシプを装着 52 目本伝染病学会雜誌したものを用いた.光製水槽,暗学系としては,石英ガラス視野コンデンサー,Achromat 100× 絞りつき対物レンズ(N.A.=1.10),GFI10× 眼レンズ(双眼)を用い,一 SchottのKG1)2mm,断収),お熱),BG38(4m1,赤よびUG1(2mm,UV選 L40(写第2号結果の記載:蛍光抗体染色の強さを,程度に応じて強陽性(卅又は卅),中等度陽性(廾),弱 (+),不明瞭(doubtful,±),陰性(-)等陽性にわけて記載した.大体新宮17)の規準に準じたが,観察される蛍光の強さは,使用する蛍光顕微鏡装置により異なるので,これらの記号は單なる比較的スを,二真用ブイルケールとしての意味しかない.例えば国産某社製= イの装置では,40× 対物レンズを用いても,写真撮ブイルターの特性については影に約2倍の露出を必要とし,そのような装置でターを工作して利用),又ルターを用いた.各色吸択)2枚次フィルターとしてはKenko Leitz15)お接次ブイルターには第39巻はSchott よびKenko16)の UV-absブカタログに記載がある. は,われわれの(+)が(±)又は(-)に相当すると考えられる. 写真の撮影はLeitzの35ミ (MIKAS,Periplan10× 行った.フリカメラ用装置接眼レンズ)を用いてイルムはフジSS(ASA100)およびフジカラーリバーサル(ASA100)を用いた. 黒白フイルムに対しては露出は1∼2分,カフイルムに対しては2∼3分増菌培養:pH8.2の驗管に8mlづ分以上露出をしても蛍光が減退するので意味をなつ分注,これに被検材料(計2ml) を入れて37℃ で培養した.培養時間は6時間を原則とした. ラーが適正であつた(3 アルカリ性ペプトン水を試実験結果コレラ菌の蛍光抗体染色:供試したアジアコレラ菌(14株)およびエルトールコレラ菌(27株) さないと思われる).なお本装置では紫外線照明とのすべては,菌型の如何にかゝわらず,本実驗に可視光照明のきりかえがレバーの操作により容易用いた蛍光抗体によって強く染色された.但に出来るので,観典型のエルトール菌にははやゝ弱いものもあつ察には両者を併用した. 第1表 *古典ウボール型 **古典ウボール型 ,セ供試菌株の螢光抗体染色成績レベス型両者を含む. し古 53 昭和40年5月20目た.ビブリオ以外のグラム陰性桿菌保存株で(廾) 第3表菌量と視野中の菌数との関係以上の染色性を示したものはなかった(以上第 1表).第1図 E.coli B株にエルトールコレラ菌JE5株光による観察(a)と観察(b)しと, との混合菌液を染色,同一視野を蛍可視光線暗視野法によつてたものを示すが,2つの方法を併用することによつて観察が容易になり,且つ染色の弱い,又は染色されない菌の形態をはつきりさせることが出来た.一般に蛍光抗体染色をうけたコレラ菌は強く細胞壁の部分が光るが,可視光線暗視野法では,細胞質内顆粒はよく見えるがかえって細胞壁が不明瞭となる.大腸菌を初め,他の菌にあつては,可視光線暗視野で,細胞壁及び細胞質内顆粒の両者とも,よく光線を屈折してはつきり見えるものが多かつた.鞭毛の染色は,寒天培地上に生育した菌からの標本ではきわめて明瞭であったが(第1図aおよび第2図a),ペプトン水培養菌では不明瞭であつた(第2図b). 第2表浮游せしめ,10倍段階で稀釈,各浮游液を1白金耳つつのせガラスにとり,10×20mmの広さにひろげ,乾燥,蛍光抗体染色を行い,100× 対物レンズを用いた場合の1視野中の菌数を数えた.10∼ 20視野について平均した値を第3表に示す.一方菌液より定量培養を行い,菌数を集落形成数/ml で表わしたが,菌数106/mlでは確実に検出できるが,105/mlではやゝ不確実であつた.106/ml以上あれば糞便中の菌の検出も容易であった. 増菌培養を行つた場合のコレラ菌検出成績:前糞便(非コレラ)塗抹標本の抗エルトールコレラ菌螢光抗体染色の成績項でのべた直接塗抹の場合の検出の限界より少数の菌を検出するためのモデルとして,10倍にペプトン水で稀釈した健康人の糞便と,ペプトン水で適当に稀釈したJE5株ン水8m1にの菌液各1m1をペプト加え,増菌培養を行い,6時間後前項と同じようにして塗抹,染色,検鏡して1視野内の菌数を記録した.結果は第4表に示すごとく,接糞便の直接塗抹標本の染色:第2表度であつてに非コレラ糞便の染色成績を示すが,染色をうける菌(又は第4表粒子)の存在は強弱の差はあるが,全標本の88% に及んだ.しかし陽性のものの83%(全 %)は(廾)以および第4図種菌量が102/m1程螢光抗体染色にペプトン水増菌*を応用したときの検出成績体の73.5 下で,対照のコレラ菌とは容易に識別できた.残り少数の例も形態的には明らかにコレラ菌と区別できた(第3図).特に可視光による暗視野観察法を併用することにより,この区別 .2ペプトン水8mlに,1mlの10× 釈液と,1mlのは非常に容易になつた. コレラ菌を糞便に混じて塗抹染色をした場合も,染色の程度は全く対照と同様であつた. 菌量と視野中の菌数との関係:塗 *pH8 抹材料中の菌量と,視野中の菌数との関係を知るため,エルトールコレラ菌JE5株新鮮培養菌を生理食塩水に糞便稀菌液を加え,37℃ で6時間増菌培養後塗抹. も,明らかにその存在を認めることができた.後にのべるような計算によって,標本中の菌量を推定した結果,この時間内に菌は約104倍に増殖していたと考えられる.尚第2表の(卅)の1例に 54 日本伝染病学会雜誌第39巻第2号昭和40年5月20日 55 56 日本伝染病学会難誌ついて,コレラ菌を混じて増菌培養を試みたが, 第2号色にさいして,まず非特異的に多量の抗生物質の投与があつたためか,菌の充分ウサギグロブリンが附着した菌(直接法での陽性な増殖が認められず,コ菌に相当)と,蛍レラ菌以外の陽性染色菌性があるから,染第39巻光抗体液で直接染色される菌のについてのペプトン水培養の影響についてのデー両者が検出されることはなるので,直タは出し得なかつた. て非特異染色の率が2倍考 1.非れにしろ,非察と,い特異的染色について今回のわれわれの実験では,抗エルトールコレラ菌蛍光抗体によつて,コレラ菌は特異的に染色特異染色には共通抗原によるもののような菌の染色は一般には劣いものでも精細に観察すれば形態的には区され,実験室保存の他のグラム陰性桿菌は染色を別がつく揚合が多いので,可受けなかったが,非法を行い,且コレラ患者および健康者の糞つくることによつて,かレラ菌以外のビブリオについては,別に報告10)し出来ると思われる. 2.材れらの糞便の中にも或はそのようなビブリオの存視光暗視野同時観察つ染色のたびにコントロール標本を便の中に,かなりの率に陽性菌が検出された.コているように,かなりの交叉反応がみられた.こずわゆる自然抗体によるものの両者があると考えられるが,そく,強接法に比しになることになる.いなり誤まりを防ぐことが料中の菌数の問題蛍光抗体法を実際の診断に応用するに当つて遭在があるかも知れないが,それ程高率であるとは遇する第二の問題は,材老えられず,原ガラス上に塗抹する材料は大体において1∼2白因は他に求めるべきであろう. Thomasonら18)は,腸研究のさい,抗料中の菌数である.のせ内細菌の蛍光抗体染色法の金耳であり,それを適当な広さにぬりひろげるのコレラ0蛍光抗体による腸内細菌であるから,菌量がある程度より少なければ菌のの交叉反応を検し,E.freundiiの1株Proteus 密度がまばらになつて,検属の1株がきわめて強い染色性を示すに拘らず, に材料1白凝集価が0であることを見,そひろげたと仮定すれば,100× の理由を使用血清鏡が困難になる.か金耳(2×10-3ml)を20×10mmに中にあるこれらの菌に対する不完全抗体に帰しての直径は0.15mm,面いるが,特定の抗原に対して不完全抗体のみが生本の全面積は200÷0.0177,即ずると考えるのはいささか無理がある.われわれ相当することになり,材の観察10)11)によれば,コあれば1視レラ菌と交叉染色性を示りぬり対物レンズの視野積は0.0177mln2だから,標ち約104の視野に料中の菌数が108/mlで野中の菌数は108×2×10-3×10-4= すビブリオも,凝集反応を起さないに拘らず,抗 20個,107/mlの体の吸収は起しうることが見出されたが,その理野に2個ということになる.第3表由の一っとして,共通抗原が細胞壁より内側に存値は,これよりやや大きくなつているが,菌在するため,附着した抗体が2価集落形成数で示しているために生じた誤差と老えとして働いて菌揚合,2個,106/mlの体相互を結合することが出来にくいからではないてよかろう.従かという可能性もある.一方,Finkelsteinおの限界は,大びGomez2)は,非よコレラ糞便中にしばしば染色強陽性の桿菌や球菌の存在を認め,その理由を, 免疫に用いたウサギが既にそのような菌によつて感染を受けていて,いわゆる自然抗体の作成と同場合10視に示した実測数をつて,直接塗抹で検出できる菌数体106/mlあるいはそれよりやや下というこになる.Chibrikovaら4)が水中のコレラ菌を塗抹によつて検出する揚合の菌数の限界を約 100万といつているのと,ほぼ一致した成績である. Smithら19)によれば,コレラ患者糞便中のコ時に蛍光色素がラベルされたためであろうとしている.彼等の考えが正しいとすれば,間接法によレラ菌のi数は,発る染色では使用する抗一ウサギグロブリン血清が, ーダーにあり ,経過と共に急速に減少して3日やはりそのような非特異的抗体を持つている可能には104以病の第1日で106∼108/m1のオ目下あるいは検出不能になる例が多いと昭和40年5月20日 57 いわれる.保菌者の場合,糞便中のコレラ菌の数学的特徴でコレラ菌と区別することが可能であつは更に少ない筈で,従つて蛍光抗体法で直接塗抹た.な標本の検査をしても,殆んど菌の検出は出来ない野法による検鏡を行うと鑑別は更に容易である. 3.塗抹標本中の菌の検出可能の濃度の限界と考えねばならない.菌数の少い材料についての検出法として,MikhailovおよびLi3)は遠心沈渣の染色を,Chibrikovaら4)はmembrane filter で材料を濾過後五lterに附着した菌を洗い出しおこの際,蛍光の観察と同時に可視光暗視は,約106/ml或 4.上はそれよりやや下である. 記限界以下の菌を含む材料も,アルカリ性ペプトン水で6時間増菌を行うことにより,蛍て増菌するというような方法を考えているが,材光抗体法で検出可能となり,このときの限界は約料が糞便の場合,共 102/m1であつた. に適用は困難で,手数の上からみてもFinkelsteinら1)2)の使用しているペプトン水増菌法がより適しているとみられる.彼等の方法を追試した結果第4表あるが,増菌培養6時のごとくなつたので間で,はじめの菌量102/ml 以上の菌は確実に検出できることがわかった.われわれは,さきにセレベス型エルトールコレラ菌が,特異的なテンペレートプアージを出すことを利用して,この型の菌の検出にフアージの検出を以てすることを試みたが7),そ接種菌数が10個/m1以の実験によれば, 下の場合,8時間増菌後も,正常の分離培養によつてはコレラ菌の集落の検出はできないが,プアージの検出は全菌数10個以下の場合も可能であつた.増して,大菌時間の差から体分離培養の感度と蛍光抗体法の感度は同程度であり,感度の上からすればテンペレートプアージ法がもつとも優れていることになる. しかし,プアージ法ではセレベス型エルトールコレラ菌以外の菌の検出が出来ない点もあり,所要 5.所要時間の点と,感度の点から考えて本法はコレラ患者ないし保菌者の検出にさいして有効なスクリーニング法であると考えられる. 本論文の要旨は昭和39年12月,第14回会西日本地方会で発表した. 文献 1) Finkelstein, R. A., & LaBrec, E. H.: J. Bact., 78, 886-891,1959. 2) Finkelstein, R. A., & Gomez, C. Z.: Bull. Wld Hlth Org., 28, 327-332, 1963. 3) Mikhailov, I. F., & Li, Li: Zh. Mikrobiol., 30 (8), 27-34, 1959. 4) Chibrikova, E.V., Shurkina, I.I., Tabakov, P.K., & Mosolova, O.N.: ibid., 33 (3), 9 14, 1962. 5) 武谷健二, 霜鳥翔一: -30 , 1962. 7) 武谷健二, Shimodori, 2時間以内で検鏡,陽性者が決定できるわけであ & Iida, るから,この方法が最も能率的であることにな arch, 9) 10) 2.非強陽性にそまるものはごくわずかで,それも形態霜鳥翔一, 1-5, Y., on Y., Amako, Cholera January, K., Rese1965. 神中寛, 武谷健二: K.: 日伝染誌, 印 1965. 霜鳥翔一, Y., Shimodori, 武谷健二: 1964. 第3回 10月: S., & Takeya, 日本熱 Zinnaka, K.: in pre- paration. 11) コレラ患者および健康者の糞便の中には高率に上記蛍光抗体にそまる菌が見出されたが, K., Zinnaka, of Hawaii, 帯医学会九州支部会, 1。抗エルトールコレラ菌(小川型)蛍光抗体レラ菌は特異的に染色された. 神中寛, 39, むすびによつて,コ Symposium University J. Bact., 85, 霜鳥翔一: 日本細菌学雑 S., Nakayama, K.: 27 8) Zinnaka, Y., Shimodori, S., & Takeya, Jap. J. Microbiol., 8, 97-103, 1964. 法の使用はスクリーニングの目的に限るべきであろう. 神中寛, 19, 339, 1964 : Takeya, 時間の点からみれば,蛍光抗体法が,増菌培養後まつて到定を下さねばならぬのは当然で,一応本日本医事新報, 1999, 6) Takeya, K., & Shimodori, S.: 957-958, 1963. 誌, る.もちろん染色陽性の場合も他の検査の結果を日本伝染病学神中寛, 天児和暢, 菌学会九州支部総会, 12) 伝研学友会: p.202. 霜鳥翔一: 1964. 第17回日本細 11月. 細菌学実習提要, 丸善, 1958, 58 日本伝染病学会雑誌 Mikroskopie 13) Campbell, D.H., Garvey, J. S., Cremer, N. E.; & Sussdorf, D. H.: Methods in Immunology, W. A. Benjamin Inc., 1963, p. 122. 14) McDevitt, H. O., Peters, J. H., Pollard, L.W., Harter, J. G., & Coons, A. H.: J. Immunol., 90, 634-642,1963. 15) Ernst Leitz GMBH (シュミットKK, 東京, 大阪): Einrichtungen fur die 16) Yutaka .JINNAKA, (Liste52-50). ケンコー写真用品KK (東京): ケンコーブイ 17) 新宮光二: 日伝染会誌, 38, 193-202, 1964. 18) Thomason, B. M., Cherry, W. S., & Edwards, P. H.: J. Bact., 77, 478-486,1959. 19) Smith, ILL., Jr., Freter, R., & Sweeney, F. J., Jr: J. Inf. Dis., 109, 31-34, 1964. of Fluorescent Detection 第2号ルターガイドブック. Fluoreszenz- Application 第39巻 Antibody of Cholera Technique to the Vibrio Shoichi SHIMODORI and Kenji TAKEYA Department of Bacteriology, School of Medicine, Kyushu University, Fukuoka, Japan. 1. Both El Tor and Asiatic cholera vibrios were stained specifically with anti-El Tor vibrio fluorescent antibody irrespective of their types, whereas twenty laoratory strains of Gram-negative rods .other than cholera vibrio could not be stained with the same fluorescent antibody. 2. In the fecal specimens from the non-cholera patients and healthy persons, the fluorescent antibody stain-positive organisms or particles were found in a very high rate (88%), in which only a few were strongly positive. These positively stained organisms were easily differetiated from cholera vibrio in the morphological properties or strength of fluorescence. The differentiation of specific and non-specific stain was improved by the observation of the same field using the dark-field illumination by the visible light. 3. The limit of bacterial concentration in this technique to find the stained organisms obviously in . the smeared specimen, was considered as around 106/ml. 4. After the enrichment culture for 6 hours, the vibrios could be detected by fluorescent antibody staining in the material which initially contained vibrios as few as about l02/ml. 5. Fluorescent antibody technique is considered as an effective screening method to detect cholera, patients or carriers, as this technique requires shorter time than the ordinary isolation technique.