Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2013 – 2014
Veiligheid en kwaliteit van verse basilicum
Jolien Boussemaere
Promotor: Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele
Tutor: ir. Stefanie Delbeke
dr. ir. Siele Ceuppens
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master of Science in de biowetenschappen: voedingsindustrie
De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt
onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.
The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to
copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more
specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis.
juni 2014
Jolien Boussemaere
Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele
Woord Vooraf
Zoals een klein basilicumzaadje uitgroeit tot een plant mits goede verzorging in een goede
omgeving, zo ben ik ook geëvolueerd gedurende het academiejaar. Daarom wil ik heel wat
personen bedanken die mij gesteund en gestuurd hebben gedurende dit ganse proces.
Eerst en vooral richt ik mijn woord van dank tot mijn promotor Prof. dr. ir. Mieke
Uyttendaele. Door haar kreeg ik de mogelijkheid om mijn thesis te verwezenlijken in het labo
voor levensmiddelenmicrobiologie en conservering. Ik wil haar oprecht bedanken voor de
vele kennis die ik gedurende het jaar opgedaan heb.
Vervolgens wil ik ook ir. Stefanie Delbeke en dr. ir. Siele Ceuppens in de bloemetjes zetten.
Gedurende het volledige jaar kon ik bij hen terecht met problemen en vragen. Bovendien
verwierf ik door hen heel wat praktische inzichten en kennis omtrent het verwerken van data
en het presenteren van resultaten. Ik leerde probleemoplossend denken en resultaatgericht
werken. Tenslotte wil ik hen nog bedanken voor het meermaals nalezen en verbeteren van
mijn thesis. Stefanie en Siele, zonder jullie hulp zou ik niet hetzelfde eindresultaat bereikt
hebben.
Mijn dank gaat ook uit naar de laboratoriummedewerkers omdat ik bij hen steeds terecht kon
met praktische vragen. In het bijzonder wil ik Elien Verguldt, Markus Eriksson, Tim Lacoere,
Ann Dirckx en Danny Pauwels bedanken.
Tenslotte waardeer ik de steun van mijn ouders, Brecht, zus, broer en vrienden gedurende de
opleiding en het schrijven van deze thesis.
Dankzij jullie allemaal bracht ik dit project tot een goed einde en kan ik het omschrijven als
de meest leerrijke, uitdagende en boeiende ervaring uit mijn volledige schoolcarrière.
Jolien Boussemaere, 2014
Samenvatting
Verse basilicum is een kant-en-klaar product dat zonder hittebehandeling wordt geconsumeerd. Indien
pathogenen aanwezig zijn op dit kruid, worden deze niet vernietigd. Daar E. coli O157 en Salmonella
spp. de meest voorkomende ziekteverwekkers zijn op verse levensmiddelen, er reeds uitbraken gemeld
werden met betrekking tot dit koningskruid en er nog weinig gekend is over hun groei/afsterving op
basilicum, werd hun overleving bepaald gedurende tien dagen bij 7 °C, 15 °C en 22 °C. Bovendien
werd de natuurlijke microbiota van basilicum geanalyseerd op de aanwezigheid van EHEC en
Salmonella spp. en via een karakterisatie met denaturatie gradiënt gelelektroforese (DGGE) en nextgeneration sequencing (NGS). Salmonella spp. werd teruggevonden bij twee geïmporteerde stalen uit
Cyprus. Maar, zoals vermeld in de microbiologische richtwaarden en wettelijke microbiologische
criteria, moet Salmonella spp. afwezig zijn in 25 g verse kruiden. Uit de overlevingsstudie volgt dat E.
coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium goed kunnen overleven op basilicum gedurende
zeven dagen bij 22 °C en acht dagen bij 7 °C en 15 °C, niettegenstaande er gekend is dat de
antimicrobiële componenten van basilicum een remmend effect vertonen ten opzichte van beide
pathogenen. Bij de karakterisatie van de bacteriën op basilicum, werd al een eerste selectie gemaakt
van de micro-organismen via de staalvoorbereiding (wassen of stomacheren). Bij gewassen basilicum
werd een variatie waargenomen aan dominante groepen, waaronder Pseudomonas, Klebsiella,
Enterobacter, Pantoea, Sphingobacterium en Flavobacterium. Bij gestomacherde basilicum werd
Novosphingobium. aangetoond als het dominante genus. Echter, dit genus werd niet meer gedetecteerd
na een incubatiestap bij 37 °C.
Abstract
Fresh herbs like basil, are ready-to-eat products without any need for cooking. This means that
pathogens will not be destroyed when present on this herb. In last decade, outbreaks were related to
the consumption of basil. E. coli O157 and Salmonella spp. are the most common pathogens on fresh
produce. As there is not much known about the survival of these pathogens on basil, this has been
determined during ten days at 7 °C, 15 °C and 22 °C. Furthermore, the natural micro-organisms on
fresh basil were investigated by analyzing the presence of EHEC and Salmonella spp. and through a
characterization using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and next-generation
sequencing (NGS). During the screening, Salmonella spp. was detected on two samples imported from
Cyprus. But as reported in the microbiological values and legal microbiological criteria, Salmonella
spp. should be absent per 25 g fresh herbs. Both pathogens (E. coli O157 and Salmonella Thompson
and Typhimurium) could survive on basil during at least seven days at 22 °C and eight days at 7 °C or
15 °C. Nevertheless, it has been shown that the essential oils from basil have an inhibitory effect on
the growth of Salmonella spp. and VTEC O157:H7. During the characterization, the sample
preparation (washing or stomachering) was very important. Washing of the leaves delivered some
variable genera, like Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Pantoea, Sphingobacterium and
Flavobacterium. After stomachering, the dominant genus on fresh basil was Novosphingobium.
However, it couldn't be detected after an incubation at 37 °C.
Trefwoorden: basilicum, overleving, Salmonella spp., EHEC, DGGE, 16S rRNA sequencing
Inhoudsopgave
Woord vooraf
Abstract
Inhoudsopgave
Inleiding ..................................................................................................................................... 1
1
Literatuurstudie .................................................................................................................. 3
1.1
Basilicum ..................................................................................................................... 3
1.1.1
Kenmerken en belang ........................................................................................... 3
1.1.2
Microbiële populatie aanwezig op basilicum ....................................................... 4
1.2
Verocytotoxineproducerende Escherichia coli (VTEC) en Salmonella spp. ............ 10
1.2.1
Inleiding ............................................................................................................. 10
1.2.2
VTEC ................................................................................................................. 10
1.2.2.1
Situering ...................................................................................................... 10
1.2.2.2
Oorsprong ................................................................................................... 10
1.2.2.3
Infectiedosis en ziektebeeld ........................................................................ 11
1.2.3
1.3
Salmonella spp. .................................................................................................. 11
1.2.3.1
Situering ...................................................................................................... 11
1.2.3.2
Oorsprong ................................................................................................... 12
1.2.3.3
Infectiedosis en ziektebeeld ........................................................................ 12
Overleving van VTEC O157 en Salmonella spp. op verse kruiden zoals basilicum en
bladgroenten ......................................................................................................................... 13
1.3.1
Invloed van de nutriënten ................................................................................... 13
1.3.2
Competitie met de van nature aanwezige microbiële populatie ......................... 14
1.3.3
Invloed van de temperatuur ................................................................................ 15
1.3.4
Onderzoeken naar de overleving van VTEC O157 en Salmonella spp. op verse
kruiden zoals basilicum en bladgroenten ......................................................................... 15
2
Proefopzet......................................................................................................................... 19
3
Materiaal en methoden ..................................................................................................... 21
3.1
Natuurlijke microbiële populatie aanwezig op basilicum ......................................... 21
3.1.1
Analyse van basilicum op de aanwezigheid van E. coli, coliformen en de
pathogenen EHEC en Salmonella spp. ............................................................................. 21
3.1.1.1
Beoordeling van de visuele kwaliteit .......................................................... 22
3.1.1.2
Microbiologische analyse ........................................................................... 22
3.1.2
3.2
Microbiële diversiteit aanwezig op basilicum .................................................... 24
3.1.2.1
Staalvoorbereiding ...................................................................................... 24
3.1.2.2
DNA-extractie ............................................................................................. 26
3.1.2.3
Controle extracten op gel ............................................................................ 26
3.1.2.4
Polymerasekettingreactie (PCR) ................................................................. 27
3.1.2.5
Denaturatie Gradiënt Gelelektroforese (DGGE)......................................... 28
3.1.2.6
Next-Generation Sequencing (NGS) .......................................................... 28
Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium ............... 29
3.2.1
Basilicum ............................................................................................................ 29
3.2.1.1
Opkweek E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium
stammen 29
3.2.1.2
Inoculatie ..................................................................................................... 30
3.2.1.3
Microbiologische analyse ........................................................................... 31
3.2.1.4
Beoordeling van de visuele kwaliteit .......................................................... 31
3.2.1.5
Dataverwerking ........................................................................................... 31
3.2.2
Bladgroenten: kropsla, jonge spinazie en baby leaves ....................................... 32
3.2.2.1
Opkweek E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium
stammen 32
4
3.2.2.2
Inoculatie ..................................................................................................... 32
3.2.2.3
Microbiologische analyse ........................................................................... 33
3.2.2.4
Beoordeling van de visuele kwaliteit en bepaling O2/CO2-gehalte ............ 33
3.2.2.5
Dataverwerking ........................................................................................... 33
Resultaten ......................................................................................................................... 35
4.1
Natuurlijke microbiële populatie aanwezig op basilicum ......................................... 35
4.1.1
Analyse van basilicum op de aanwezigheid van E. coli, coliformen en de
pathogenen EHEC en Salmonella spp. ............................................................................. 35
4.1.2
4.2
Microbiële diversiteit aanwezig op basilicum .................................................... 36
4.1.2.1
Optimalisatie staalvoorbereiding ................................................................ 37
4.1.2.2
Natuurlijke microbiële gemeenschap .......................................................... 39
4.1.2.3
Evolutie bacteriële diversiteit ..................................................................... 44
Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium ............... 48
4.2.1
Basilicum ............................................................................................................ 48
4.2.1.1
Visuele kwaliteit ......................................................................................... 48
4.2.1.2
Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium . 50
4.2.2
Bladgroenten: kropsla, jonge spinazie en baby leaves ....................................... 53
4.2.2.1
Visuele kwaliteit ......................................................................................... 53
4.2.2.2
Zuurstof- en koolstofdioxidegehalte ........................................................... 54
4.2.2.3
Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium 56
4.2.3
Vergelijking basilicum en bladgroenten ............................................................ 59
5
Discussie........................................................................................................................... 61
6
Besluit............................................................................................................................... 69
Referentielijst ........................................................................................................................... 71
Lijst met afkortingen ................................................................................................................ 78
Lijst met figuren ....................................................................................................................... 79
Lijst met tabellen ...................................................................................................................... 81
Bijlagen .................................................................................................................................... 82
Inleiding
Kruiden en specerijen worden over de ganse wereld gebruikt en verhandeld voor hun aroma.
Basilicum kent binnen deze groep een belangrijke rol en zou 50 % van de totale kruidenmarkt
innemen binnen Europa (Smith, 2013). Verse basilicum behoort tot de kant-en-klare
producten, die direct consumeerbaar zijn zonder hittebehandeling (Elviss et al., 2009; Hsu,
Simonne, & Pongphen, 2006; Zweifel & Stephan, 2012). Ze worden vaak bij het einde van de
bereiding toegevoegd als decoratie of soms rauw gegeten. Indien pathogenen aanwezig zijn,
worden ze niet vernietigd (Elviss et al., 2009; Hsu et al., 2006; Kisluk, Kalily, & Yaron,
2013). Gedurende de laatste jaren was basilicum enkele keren betrokken bij uitbraken
(Guzman-Herrador et al., 2013; Pakalniskiene et al., 2009; Pezzoli et al., 2008). Zo werden 55
ziektegevallen van Salmonella Senftenberg gerapporteerd in Engeland en Wales in 2006 en
2007. Daarvan meldden Schotland, Nederland, Denemarken en de Verenigde Staten 19
gevallen van ziekte. De contaminatiebron zou voorverpakte verse basilicum zijn (Pezzoli et
al., 2008). De pathogenen die voornamelijk geassocieerd werden met uitbraken door
consumptie van verse voedingsmiddelen zoals kruiden en bladgroenten zijn Escherichia coli
O157:H7 en Salmonella spp. (Deering, Mauer, & Pruitt, 2012; Olaimat & Holley, 2012).
Binnen deze thesis staan twee onderzoeksvragen centraal. Enerzijds is het de bedoeling om de
microbiële populatie aanwezig op basilicum in kaart te brengen. Hierbij wordt verse basilicum
geanalyseerd op de aanwezigheid van E. coli en coliformen en de pathogenen Salmonella spp.
en EHEC. Bovendien wordt de natuurlijke microbiële gemeenschap gekarakteriseerd met
behulp van denaturatie gradiënt gelelektroforese (DGGE) en next-generation seqeuncing
(NGS). Anderzijds wordt de invloed van de bewaartemperatuur (7 °C, 15 °C of 22 °C) en de
tijd (dag 0 tot en met dag 10) nagegaan op de overleving van E. coli O157 en Salmonella
Thompson en Typhimurium op basilicum. De overleving van deze pathogenen wordt nadien
vergeleken met deze op bladgroenten (kropsla, spinazie en baby leaves) bij 7 °C, 15 °C en 22
°C gedurende drie dagen.
Aan de hand van het praktisch deel zal een antwoord geformuleerd worden op de
verschillende onderzoeksvragen.
Het belang van het onderzoek wordt aangehaald in de literatuurstudie. In het eerste deel wordt
de situatie van het belang van basilicum in België en Europa in kaart gebracht. Bovendien
wordt de microbiële populatie omschreven en worden de uitbraken met pathogenen op dit
koningskruid opgesomd. Vervolgens wordt in het tweede deel dieper ingegaan op de
pathogenen Salmonella spp. en VTEC O157 (potentieel EHEC) waarna geëindigd wordt met
1
de overleving van deze ziekteverwekkers bij verse kruiden zoals basilicum in vergelijking met
andere verse kruiden en bladgroenten.
In een volgend hoofdstuk, genaamd 'materiaal en methoden', worden alle protocollen en
technieken beschreven die nodig zijn voor de uitvoering van de verschillende proeven.
In het daaropvolgende twee delen worden de resultaten weergegeven en bediscussieerd om
uiteindelijk tot de eindconclusie te komen.
Dit volledige onderzoek kadert binnen het project Veg-i-Trade, waarbij de impact van de
globalisering en de klimaatsverandering nagegaan wordt op de veiligheid van verse kruiden,
groenten en fruit (Veg-i-Trade, 2010).
2
1 Literatuurstudie
1.1 Basilicum
1.1.1 Kenmerken en belang
Kruiden en specerijen worden over de ganse wereld gebruikt en verhandeld voor hun aroma.
Verse kruiden krijgen de voorkeur, want bij drogen gaat het grootste deel van de geur en
smaak verloren. Dit geldt ook voor basilicum (De Geeter, 2004). Verse kruiden behoren tot de
kant-en-klare producten, die direct consumeerbaar zijn zonder hittebehandeling (Elviss et al.,
2009; Hsu et al., 2006; Zweifel & Stephan, 2012). In de praktijk worden deze dus vaak rauw
gegeten of op het einde aan gerechten toegevoegd (bijvoorbeeld als decoratie), waardoor
pathogenen, indien aanwezig, niet vernietigd worden (Elviss et al., 2009; Hsu et al., 2006;
Kisluk et al., 2013). Basilicum kent een courant gebruik in allerhande recepturen en wordt
vaak gegeten in combinatie met tomaat (De Geeter, 2004). Bovendien is pesto een belangrijke
toepassing, waarvan de hoofdingrediënten naast dit koningskruid ook knoflook, olijfolie,
Parmezaanse kaas, pijnboompitten en eventueel pecorino zijn (Bauwens, 2006; Pakalniskiene
et al., 2009). Bewaren van basilicum gebeurt het best zonder dat de blaadjes vooraf gesneden
zijn. Door het versnijden komen allerhande nutriënten vrij (zoals koolhydraten en eiwitten)
die gunstig zijn voor de microbiële groei (Aruscavage, Miller, Lewis Ivey, Lee, & LeJeune,
2008; Elviss et al., 2009). Er wordt aangeraden om basilicum te bewaren bij 12 – 15 °C om
koudeschade te voorkomen (Elviss et al., 2009).
Basilicum bevat anti-oxidatieve componenten (Gorbatsevich, Shlomo, Pinto, & Bernstein,
2013) en essentiële olie die onder andere bestaat uit linalool, estragol en methyl chavicol (Da
Silva et al., 2005; Karagözlü, Ergönül, & Özcan, 2011; Kisluk et al., 2013; Tajkarimi,
Ibrahim, & Cliver, 2010). Deze bestanddelen zouden een antimicrobiële activiteit vertonen
tegen bacteriën, schimmels en gisten (Da Silva et al., 2005; Suppakul, Miltz, Sonneveld, &
Biggers, 2003).
In de medische sector wordt de basilicumolie ook gebruikt in aromatherapie, cosmetica en
farmaceutische producten. Bovendien kan deze olie ook toegepast worden in verschillende
voedingsmiddelen (Kisluk et al., 2013; Suppakul et al., 2003).
Daarnaast zou basilicum een kalmerende werking hebben, de koorts verlagen en krampen
verminderen. Dit kruid zou ook een urine-afdrijvende werking hebben (Bell'Aroma, 2008).
Doch werd er nog geen oorzaak-verbandrelatie vastgesteld tussen de consumptie ervan en het
verbeteren van de vochtafdrijving (EFSA & NDA, 2009).
3
Basilicum speelt een belangrijke rol in Europa en zou er 50 % van de totale kruidenmarkt
innemen (Smith, 2013). Uit de een kleinschalige enquête van het provinciaal proefcentrum
voor de groenteteelt van Oost-Vlaanderen, blijkt dat basilicum tot de top 5 van de meest
gebruikte kruiden behoort in de Vlaamse Ardennen en het Meetjesland. Bovendien volgt uit
deze enquête dat de voorkeur gaat naar verse kruiden in de lente en zomer en gedroogde in de
herfst en winter. Vervolgens vinden de meeste respondenten het belangrijk dat verse kruiden
regionaal geproduceerd worden (PCG, 2012). Basilicum behoort tot de belangrijkste kruiden
in de supermarkt (Verbeke, 2011). Uit de landbouwtelling van 2010 blijkt dat 23 bedrijven in
België kruiden produceren, waarvan 16 aanwezig in Vlaanderen (FOD economie, 2011).
Figuur 1: Tien grootste importeurs (links) en exporteurs (rechts) van kruiden en specerijen in 2012 in de Europese Unie (uit
CBI, 2013)
België behoort tot de tien grootste importeurs en exporteurs van kruiden en specerijen binnen
de Europese Unie. De import en de export van kruiden en specerijen bedraagt respectievelijk
ongeveer 19 000 en 10 000 ton per jaar, waarmee België op de zevende plaats komt te staan in
de top tien van grootste importeurs en exporteurs binnen Europa in 2012. De import naar
België is vooral afkomstig van andere leden van de Europese Unie en in mindere mate van
ontwikkelingslanden. De export vanuit België is vooral bedoeld voor de andere landen van de
Europese Unie, gevolgd door de rest van de wereld en de ontwikkelingslanden (Figuur 1)
(CBI, 2013).
1.1.2 Microbiële populatie aanwezig op basilicum
Er werd nog niet zo veel onderzoek verricht naar de microbiële diversiteit op verse basilicum.
In de literatuur worden enkele experimenten teruggevonden betreffende de microbiële
populatie op gedroogde basilicum (Witkowska, Hickey, Alonso-Gomez, & Wilkinson, 2011;
Wojcik-Stopczynska, Jakubowska, & Reichelt, 2009) en basilicumzaden (Khattak, 2012). In
de meeste onderzoeken worden steeds dezelfde parameters nagegaan, namelijk: het kiemgetal
4
(aeroob, mesofiel), schimmels en gisten, coliformen, E. coli en de aanwezigheid van
Salmonella spp. (Khattak, 2012; Wojcik-Stopczynska et al., 2009).
De mate van de aanwezigheid van bacteriën op basilicum, hangt af van de contaminatie die
optreedt gedurende de teelt (Stopczynska & Jadczak, 2007) en dus ook van de hygiënische
handelingen tijdens dit proces (Witkowska et al., 2011). Van kruiden is gekend dat het totaal
kiemgetal hoog ligt. Stopczynska & Jadczak (2007) bepaalden de microbiële contaminatie
van verse basilicum en bekwamen respectievelijk 4,4 log kve/g, 2,2 log kve/g en 2,1 log kve/g
voor het totaal aeroob mesofiel kiemgetal, de schimmels en de gisten. De pathogenen
(Salmonella spp., pathogene E. coli en S. aureus) werden niet gevonden (Stopczynska &
Jadczak, 2007).
Biologisch geteeld (n = 19)
Conventioneel geteeld (n = 10)
Figuur 2: Samenstelling van de bacteriën aanwezig op biologisch en conventioneel geteelde basilicum na 16S rRNA
sequencing (naar Wetzel et al., 2010)
In Figuur 2 wordt de bacteriepopulatie op basilicum weergegeven na 16S rRNA sequencing.
Hierbij wordt een onderscheid gemaakt tussen biologisch geteelde en conventioneel geteelde
basilicum. De biologisch geteelde basilicum vertoont een grotere variatie aan bacteriën. Uit de
figuur blijkt dat Enterobacter het meest aangetroffen wordt. Deze analyses worden echter
uitgevoerd na een aanrijkingsstap overnacht bij 37 °C (in Brain Heart Infusion Broth; BHI)
om het maag-darmstelsel na te bootsen. Hierdoor creëert de cultivatiestap een mogelijke grote
fout, namelijk enerzijds voor de kweekbare bacteriën en anderzijds treedt een verschuiving op
naar de snelst groeiende species. Deze studie kan dus niet beschouwd worden als een echte
5
karakterisatie van de bacteriële gemeenschap op verse basilicum, maar het geeft wel een
indicatie van de species die aanwezig zijn en voor welke species geselecteerd wordt tijdens
een aanrijkingsstap (Wetzel, Lee, Soo Lee, & Binkley, 2010).
Er bestaan tevens alternatieve methodes om de microbiële populatie aanwezig op basilicum te
bepalen waar niet gewerkt moet worden met een aanrijkingstap. In het kader van deze thesis
wordt gebruik gemaakt van next-generation sequencing (NGS) en denaturatie gradiënt
gelelektroforese (DGGE) om de bacteriële populatie te karakteriseren.
Figuur 3: Principeschema pyrosequencing met PPi = pyrofosfaat, Pi = fosfaat; APS =
adenosinefosfosulfaat
Het principe van pyrosequencing wordt uitgelegd aan de hand van Figuur 3. Bij elke
deelreactie wordt één soort nucleotide toegevoegd op een bepaald tijdstip. In deze figuur gaat
het om dCTP. Met behulp van DNA polymerase wordt cytosine gebonden aan deze
onbekende streng. Cytosine bindt complementair met guanine en er volgt een cascade van
enzymatische reacties die zorgt voor de ontwikkeling van een lichtsignaal. De intensiteit
hiervan is evenredig met het aantal gebonden basen van eenzelfde soort. Omdat het
toegevoegde nucleotide gekend is, kan men de onbekende sequentie achterhalen. Als
dATPS (dATP is een substraat voor luciferase en zorgt voor een te hoog
achtergrondsignaal), dGTP of dTTP toegevoegd wordt in plaats van dCTP in deze situatie,
dan worden deze niet-complementaire nucleotiden met behulp van apyrase gedegradeerd,
waardoor geen lichtsignaal ontstaat. Nadat ook de niet gebonden overmaat dCTP stukgemaakt
6
wordt met apyrase, kan de reactie opnieuw van start gaan met een ander nucleotide (Novais &
Thorstenson, 2011; Ronaghi & Elahi, 2002).
Een DGGE analyse wordt uitgevoerd met behulp van een verticale polyacrylamidegel. Hierin
bevindt zich een lineaire gradiënt van ureum en formamide, die denaturatie veroorzaakt. De
hoogste concentratie aan ureum en formamide is onderaan in de gel aanwezig. De scheiding
met behulp van DGGE is gebaseerd op de verminderde mobiliteit tijdens de gelelektroforese
wanneer het dubbelstrengig DNA denatureert. De DNA-fragmenten stoppen/denatureren op
verschillende plaatsen in de gel omdat ze een verschillende sequentie vertonen. Hoe meer GC bindingen er aanwezig zijn in de sequentie, hoe lager de DNA-fragmenten zullen
denatureren in de gel. Bij DGGE is het dus mogelijk om fragmenten van eenzelfde grootte te
onderscheiden van elkaar, mits een verschil in sequentie. Er wordt een GC-klem (30 - 50
nucleotiden) toegevoegd aan één van de primers, hier aan het 5'-uiteinde van de voorwaartse
primer. De GC-klem voorkomt dat de DNA-strengen volledig enkelstrengig worden bij
denaturatie (Ercolini, 2004; Muyzer & Smalla, 1998).
Volgens Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF) werden reeds verschillende
gevallen gemeld omtrent verse basilicum inzake de aanwezigheid van micro-organismen. Dit
gaat enerzijds om 93 informatieve meldingen, waar de twee meest frequente problemen tussen
1 januari 2000 en 1 april 2014 bij basilicum het voorkomen van Salmonella spp. en een te
hoog gehalte aan E. coli waren. Naast informatieve rapporteringen, worden basilicumstalen
ook geklasseerd als alarmerend of een geweigerd staal aan de grens van een land van de
Europese Unie (EU) of Europese Economische Ruimte (EEA) (Tabel 1).
Tabel 1: Overzicht geweigerde stalen en alarmerende stalen van basilicum van 01/01/2000 tot en met 01/04/2014. Met A =
alarmerend staal en AG = afwijzing van het staal aan de grens van land EU of EEA (naar RASFF, 2014)
Datum
Klasse Herkomst Gevaar
Actie
20/06/2007
A
Egypte
Salmonella spp.
terugroepen product
16/10/2008
A
Thailand
Salmonella spp.
geen product over
03/11/2008
AG
Thailand
Salmonella spp.
terugroepen product + vernietiging
23/01/2009
A
Thailand
Salmonella spp.
geen product over
22/02/2010
AG
Thailand
Salmonella Brunei
inbeslagname product
29/03/2010
AG
Egypte
Salmonella spp.
terugroepen product
30/06/2010
AG
Thailand
Salmonella Brunei
inbeslagname product
15/07/2010
AG
Egypte
Te hoog aantal Enterobacteriaceae
terugroepen product + vernietiging
28/04/2011
AG
Egypte
Te hoog aantal Enterobacteriaceae
terugroepen product
05/10/2012
A
Turkije
Salmonella Amersfoort
terugname product
16/05/2013
AG
Thailand
Salmonella spp.
vernietiging product
30/05/2013
AG
Thailand
Salmonella spp.
weigeren import
7
Daarnaast zijn er in de literatuur enkele uitbraken van Salmonella spp. bij basilicum
omschreven (Tabel 2). Vervolgens worden ook uitbraken gemeld met andere pathogenen,
zoals Shigella sonnei (Guzman-Herrador et al., 2013).
Tabel 2: Overzicht uitbraken Salmonella spp. bij basilicum
Jaar
Plaats uitbraak
2006
Denemarken
2007
Pathogeen
Salmonella Anatum
en ETEC
Verenigd Koninkrijk, Verenigde Salmonella
Staten, Nederland en Denemarken
Senftenberg
Referentie
(Pakalniskiene et al., 2009)
(Pezzoli et al., 2008)
In november 2006 werden 200 studenten en docenten ziek in een school in Denemarken. Men
werd vooral ziek na het eten van pastasalade met pesto. Na verder onderzoek werd Salmonella
Anatum teruggevonden in deze salade, waardoor dit werd beschouwd als mogelijke oorzaak
van de uitbraak. Verse basilicum zou de meest aangewezen bron van contaminatie zijn. De
basilicum, geïmporteerd uit Israël, zou potentieel besmet kunnen zijn door het gebruikte
irrigatiewater, maar de exacte oorsprong werd nooit achterhaald (Pakalniskiene et al., 2009).
Tussen januari en juni 2007 werden er 55 ziektegevallen van Salmonella Senftenberg
gerapporteerd in Engeland en Wales. Daarvan meldden Schotland, Nederland, Denemarken
en de Verenigde Staten 19 gevallen van ziekte. De contaminatiebron zou voorverpakte verse
basilicum zijn (Pezzoli et al., 2008). Hiervan was er ook een informatieve melding aanwezig
bij het portaal van RASFF. De actie die ondernomen werd, was het informeren van de
consumenten via een persbericht (RASFF, 2014). Vervolgens bleek na verder onderzoek dat
de verse voorgesneden basilicum, verkocht in het Verenigd Koninkrijk, besmet was met
Salmonella Senftenberg. In totaal waren acht stalen van de voorverpakte basilicum (n = 674),
geïmporteerd uit Israël, gecontamineerd met Salmonella Senftenberg (Elviss et al., 2009).
Verse kruiden kunnen dus een bron van contaminatie met Salmonella spp. zijn (Zweifel &
Stephan, 2012). Verocytotoxine producerende Escherichia coli (VTEC) werd in de literatuur
nog niet teruggevonden als veroorzaker van een uitbraak met basilicum. Bij andere kruiden,
zoals koriander, was dit wel het geval in Engeland en Wales (Whittaker et al., 2008).
Er is sprake van een toename van het aantal uitbraken gerelateerd aan de consumptie van
verse producten, zoals verse kruiden en bladgroenten (Chang & Fang, 2007; Kisluk et al.,
2013; Olaimat & Holley, 2012). Deze stijging kan verschillende redenen hebben. Een eerste
reden is dat meer verse producten geconsumeerd worden en dat de voedingsmiddelen over het
ganse jaar beschikbaar zijn om aan de hogere vraag van de consument te voldoen. Om hieraan
te beantwoorden, wordt beroep gedaan op import. Hierdoor stijgt de tijd tussen oogsten en de
8
consumptie en worden kruiden geteeld in landen met minder goede hygiënische praktijken in
vergelijking met België. Daarnaast moet vaker gebruik gemaakt worden van landbouwgrond
die zich naast weilanden met daarop dieren bevindt, waardoor er een grotere kans is op de
besmetting via fecaliën (Deering et al., 2012; Lynch, Tauxe, & Hedberg, 2009; Olaimat &
Holley, 2012). Vervolgens wordt er ook meer onderzoek verricht, wordt er meer
gerapporteerd (Berger et al., 2010; Heaton & Jones, 2008; Wetzel et al., 2010) en is de
bewustwording van de kans op uitbraken bij verse voedingsmiddelen, zoals kruiden, groter
(Deering et al., 2012; Lynch et al., 2009; Olaimat & Holley, 2012).
Het achterhalen van de oorzaak van contaminatie bij een uitbraak, start met een zorgvuldige
beoordeling van alle mogelijke risico’s (Lynch et al., 2009). Het is moeilijk om hierbij de rol
van verse kruiden aan te tonen. Dit is zeker zo wanneer ze een onderdeel zijn van een gerecht,
waar ook andere voedingsmiddelen aanwezig zijn die ook als oorzaak van de ziekteverwekker
kunnen aangeduid worden. Uit de literatuur volgt dat consumenten vaak onbewust verse
kruiden eten in een reeds bereide maaltijd of bij een restaurantbezoek (Berger et al., 2010;
Pezzoli et al., 2008). Bovendien zijn er meerdere factoren die een invloed hebben op de
aanwezigheid van de pathogenen en kan contaminatie optreden op het veld en bij de
consument (Deering, Mauer, & Pruitt, 2012; Golberg, Kroupitski, Belausov, Pinto, & Sela,
2011; Lynch et al., 2009; Olaimat & Holley, 2012; Stopczynska & Jadczak, 2007).
De meest aangewezen oorzaken van de contaminatie van verse kruiden zijn de kwaliteit van
het water (bijvoorbeeld irrigatiewater) en fecale contaminatie door mens of dier (Chang &
Fang, 2007; Golberg, et al., 2011; Lynch et al., 2009; Tomàs-Callejas et al., 2011; WHO &
FAO, 2008). Naast de kwaliteit van het water heeft de irrigatiemethode ook een invloed op
het aantal micro-organismen op de plant. Irrigatie met behulp van druppels zou voordeliger
zijn dan beregening (Berger et al., 2010; Doyle & Erickson, 2008; Kisluk et al., 2013;
Olaimat & Holley, 2012).
Besmetting van verse kruiden met Salmonella spp. en VTEC O157 wordt het best preventief
beheerst, want eens het product gecontamineerd is met deze pathogenen, kan een
reinigingsstap deze niet meer volledig verwijderen en betekenen ze dus een gevaar tijdens de
consumptie (Gorbatsevich et al., 2013; Luo, He, & McEvoy, 2010; Lynch et al., 2009;
Olaimat & Holley, 2012). De oorzaak hiervan zou zijn dat de pathogenen kunnen
binnendringen in de huidmondjes van basilicum en daar bescherming krijgen tegen het
wassen, zelfs met ontsmettingsmiddelen (Golberg et al., 2011). Het toepassen van goede
hygiënische praktijken (GHP) is dus een must om contaminatie te voorkomen (Lynch et al.,
2009).
9
1.2 Verocytotoxineproducerende Escherichia coli (VTEC) en
Salmonella spp.
1.2.1 Inleiding
De pathogenen die voornamelijk geassocieerd worden met uitbraken door consumptie van
verse kruiden zoals basilicum en bladgroenten zijn Escherichia coli O157:H7 en Salmonella
spp. (Deering et al., 2012; Olaimat & Holley, 2012). In dit deel worden VTEC en Salmonella
spp. besproken. Beiden zijn zoönotische pathogenen en behoren tot de groep van de
Enterobacteriaceae (Baylis, Uyttendaele, Joosten, & Davies, 2011).
1.2.2 VTEC
1.2.2.1 Situering
Escherichia coli wordt overvloedig aangetroffen in het maagdarmkanaal van de mens (Baylis
et al., 2011; M. A. Karmali, Gannon, & Sargeant, 2010; Ridderbos, 2006). Meestal zijn deze
niet ziekteverwekkend, maar een aantal hebben een pathogeen karakter, namelijk
enteropathogene E. coli (EPEC), enterotoxigene E. coli (ETEC), entero-invasieve E. coli
(EIEC), entero-aggregatieve E. coli (EAEC), diffuus aanhechtende E. coli (DAEC) en VTEC
(Baylis et al., 2011; Elliot & Robins-Brone, 2005; M. A. Karmali et al., 2010; Ridderbos,
2006).
Om tot de groep van VTEC te behoren, moet er tenminste één van de verocytotoxinen (vtx-1
of vtx-2) geproduceerd worden. VTEC komt in de literatuur ook vaak voor als STEC of
Shigatoxine producerende E. coli, door de vergelijkbare eigenschappen van het toxine dat
gevormd wordt door Shigella dysenteriae (Baylis et al., 2011; M. A. Karmali et al., 2010;
Nataro, Bopp, Fields, Kaper, & Strockbine, 2011; Pennington, 2010; Ridderbos, 2006).
VTEC O157 komt binnen de verocytotoxine producerende E. coli het vaakst voor (EFSA &
ECDC, 2014; M. A. Karmali et al., 2010; Pennington, 2010; Ridderbos, 2006). Andere
belangrijke niet-VTEC O157 serotypes die voorkomen, zijn O26, O111, O103 en O145
(EFSA, 2013). Bepaalde VTEC bezitten ook het eae-gen (enterocyte attachment effacement
gen), waardoor ze potentieel Enterohaemorrhagische Escherichia coli (EHEC) zijn. Het eaegen codeert voor intimine, waardoor de bacteriën kunnen binden aan de darmwand (Elliot &
Robins-Brone, 2005; Tarr, Gordon, & Chandler, 2005).
1.2.2.2 Oorsprong
De belangrijkste contaminatiebron van EHEC is de herkauwer, voornamelijk de koe, die als
natuurlijk reservoir dient voor dit pathogeen (Baylis et al., 2011; EFSA, 2011b; M. A.
Karmali, 2004; M. A. Karmali et al., 2010). Via de feces kunnen deze herkauwers de
10
omgeving (zoals bijvoorbeeld water) besmetten. Daarnaast kan besmetting ook optreden via
gecontamineerd voedsel en bij contact van dier of persoon tot persoon (EFSA, 2011b; EFSA
& ECDC, 2014; M. A. Karmali et al., 2010).
De levensmiddelen die het meest geassocieerd worden met een contaminatie met EHEC zijn
rauwe of te weinig verhitte levensmiddelen, zoals rauw vlees, ongepasteuriseerde melk of
vruchtensap en groenten waaronder spinazie, sla, radijzen, spruiten, sojascheuten en tomaten
(Baylis et al., 2011; Collins & Green, 2010; M. A. Karmali, 2004; M. A. Karmali et al.,
2010). Bovendien kan EHEC gedurende meer dan vijf maanden overleven in de bodem (Hsu
et al., 2006).
1.2.2.3 Infectiedosis en ziektebeeld
De infectiedosis van EHEC bedraagt slechts 10 tot 100 cellen (Chang & Fang, 2007; Collins
& Green, 2010; M. A. Karmali, 2004).
De symptomen van een voedselinfectie door EHEC gaan van een milde diarree tot
haemorragische colitis (HC) (Baylis et al., 2011; Brooks et al., 2005; EFSA, 2011b; EFSA &
ECDC, 2014; M. A. Karmali, 2004; M. A. Karmali et al., 2010). Eerst treedt waterige diarree
op in combinatie met buikkrampen en in een verder stadium ook bloederige diarree (HC).
Bovendien moeten patiënten vaak overgeven en gaat de ziekte niet gepaard met koorts
(EFSA, 2011b; Elliot & Robins-Brone, 2005; M. A. Karmali, 2004; M. A. Karmali et al.,
2010; Ridderbos, 2006). Vervolgens kan ook het hemolytisch uremisch syndroom (HUS)
optreden met als gevolg schade aan de nieren, anemie en trombocytopenie (EFSA, 2011b;
EFSA & ECDC, 2014; Elliot & Robins-Brone, 2005; M. A. Karmali, 2004; M. A. Karmali et
al., 2010). Volgens Karmali et al. (2004) treedt HUS op bij 10 – 25 % van de zieken door
EHEC. HUS komt vooral voor bij kinderen, maar ook ouderen kennen een verhoogd risico
voor het optreden van HUS (M. A. Karmali, 2004; M. A. Karmali et al., 2010; Ridderbos,
2006; Tomàs-Callejas et al., 2011). Volgens Ridderbos (2006) treedt chronische
nierinsufficiëntie op bij 25 % van de patiënten waar HUS waargenomen wordt en volgens
Karmali (2004) loopt het in 3-5 % van de gevallen fataal af.
1.2.3 Salmonella spp.
1.2.3.1 Situering
Salmonella spp. bestaat uit twee species en verschillende subspecies (Figuur 4). Deze
subspecies kunnen nog verder onderverdeeld worden in serotypes. Zo zijn Thompson en
Typhimurium twee serotypes die behoren tot species enterica subspecies enterica (Baylis et
al., 2011; Coburn, Grassl, & Finlay, 2007; FAVV., WIV., & CODA., 2011). Voor Salmonella
zijn meer dan 2600 serotypes gekend (EFSA & ECDC, 2014).
11
Thompson
enterica
Typhimurium
salamae
arizonae
enterica
Salmonella spp.
diarizonae
bongori
houtenae
indica
Figuur 4: Overzicht Salmonella spp. (naar Baylis et al.,2011 & Nataro et al., 2011)
1.2.3.2 Oorsprong
Salmonella spp. komt verspreid voor in de natuur en kan onder andere voorkomen in het
maag-darmkanaal van dieren zoals vogels en knaagdieren, maar kan ook aanwezig zijn bij
mensen. Besmetting met deze ziekteverwekker kan dus optreden van dieren of personen op
personen of via water met gecontamineerde feces (Baylis et al., 2011; Bell & Kyriakides,
2002; FAVV et al., 2011; Ridderbos, 2006). De oorsprong van Salmonella spp. is afhankelijk
van het serotype, want van de tyfeuze soorten is gekend dat ze enkel voorkomen bij de mens
(Baylis et al., 2011; Bell & Kyriakides, 2002). Volgens Bell & Kyriakides (2002) kan deze
pathogeen gedurende een lange tijd overleven in de bodem en in de feces van dieren.
Bovendien kan Salmonella spp. verspreid worden via gecontamineerd voedsel.
De levensmiddelen die het meest geassocieerd worden met een besmetting met Salmonella
spp. zijn eieren, rauw vlees (varkens, gevogelte) en verse voedingsmiddelen zoals
bladgroenten of kruiden (Baylis et al., 2011; EFSA, 2011a; FAVV. et al., 2011).
1.2.3.3 Infectiedosis en ziektebeeld
In het algemeen zou een infectiedosis van 10 – 100 cellen al genoeg zijn. De hoeveelheid is
zeker laag bij kinderen, ouderen en chronisch zieken. Bij personen die niet tot de YOPI
(jongeren, bejaarden, zwangere vrouwen en zieken) behoren, zou een dosis van 10 000 nodig
zijn om ziekte te veroorzaken (Bell & Kyriakides, 2002).
De symptomen zijn afhankelijk van de gastheer en het serotype. De verschillende serotypes
worden onderverdeeld in drie groepen, namelijk Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi en
tenslotte de niet-tyfeuze Salmonella (Baylis et al., 2011; Coburn et al., 2007; Ridderbos,
2006). Salmonella Typhi wordt aangeduid als de meest gevaarlijke. De niet-tyfeuze soorten
zouden dit in mindere mate zijn, met uitzondering van de serotypes Typhimurium en
Enteritidis (Ridderbos, 2006).
De drie mogelijk voorkomende fenomenen bij een infectie met Salmonella spp. zijn gastroenteritis, enterische koorts (enkel bij (para)tyfeuze serotypes) en tenslotte bacteriemie (Bell &
12
Kyriakides, 2002; Coburn et al., 2007). Bovendien kan Salmonella spp. nog een lange tijd
aanwezig blijven in het darmkanaal van de geïnfecteerde persoon. Dit kan maanden tot jaren
duren na het optreden van enterische koorts en komt in mindere mate en voor een kortere duur
voor na gastro-enteritis (Bell & Kyriakides, 2002).
Het eerste fenomeen is gastro-enteritis of ontsteking van de maag en dunne darm. Dit komt
voor bij subspecies enterica en arizonae (Bell & Kyriakides, 2002) en kan optreden na 12 - 72
uur van incubatietijd en duurt twee tot zeven dagen (Baylis et al., 2011; Bell & Kyriakides,
2002). De symptomen die hierbij optreden zijn misselijkheid, buikpijn, braken, koorts en
diarree (Baylis et al., 2011; Bell & Kyriakides, 2002; Coburn et al., 2007).
Vervolgens komt enterische koorts enkel voor bij de infectie door (para)tyfeuze groepen (Bell
& Kyriakides, 2002). Hierbij treedt misselijkheid, buikpijn, een verminderde eetlust en hoge
koorts op. Daarnaast treedt ook constipatie op in het begin van de ziekte en diarree naar het
einde toe (Bell & Kyriakides, 2002; Coburn et al., 2007).
Tenslotte komt bacteriemie (aanwezigheid van Salmonella spp. in de bloedbaan) voor bij
subspecies enterica. Indien Salmonella spp. aanwezig is in de bloedbaan treedt pijn aan de
borstkast en buik, een verminderde eetlust, hoge koorts en rillingen op (Bell & Kyriakides,
2002).
1.3 Overleving van VTEC O157 en Salmonella spp. op verse
kruiden zoals basilicum en bladgroenten
De overleving van Salmonella spp. en VTEC O157 op verse kruiden zoals basilicum en
bladgroenten
wordt
beïnvloed
door
diverse
factoren,
zoals
bijvoorbeeld
de
nutriëntbeschikbaarheid, competitie met de achtergrondmicrobiota (Doyle & Erickson, 2008;
Olaimat & Holley, 2012; Tomàs-Callejas et al., 2011) en de bewaartemperatuur (Chang &
Fang, 2007; Doyle & Erickson, 2008; Luo et al., 2010; Sant'Ana, Barbosa, Destro, Landgraf,
& Franco, 2012; Tian et al., 2012). Vervolgens kan de vrijgave van antimicrobiële
componenten ook een belangrijke rol spelen (Doyle & Erickson, 2008; Olaimat & Holley,
2012).
1.3.1 Invloed van de nutriënten
Bij beschadigde of gesneden bladeren van verse kruiden of bladgroenten, worden nutriënten
(koolhydraten en eiwitten) beschikbaar voor micro-organismen. Deze voedingsstoffen zijn
gunstig voor de microbiële groei (Aruscavage et al., 2008; Campbell et al., 2001; Delaquis &
Dinu, 2007; Doyle & Erickson, 2008; Elviss et al., 2009; Luo et al., 2010; Lynch et al., 2009;
Olaimat & Holley, 2012; Stopczynska & Jadczak, 2007; Tomàs-Callejas et al., 2011). Naast
het vrijkomen van de nutriënten, stijgt ook de wateractiviteit bij het versnijden (Olaimat &
Holley, 2012).
13
Vaak zijn de voedingsstoffen niet homogeen verdeeld op het bladoppervlak van de plant,
waardoor enige beweeglijkheid van de micro-organismen wordt verwacht om te kunnen
overleven. Van de pathogenen VTEC O157 en van Salmonella spp. is gekend dat ze
respectievelijk meer voorkomen bij gesneden stukken groente en rottende verse producten in
vergelijking met onbeschadigde. Beschadigde planten geven namelijk koolhydraten en
eiwitten vrij, waardoor de pathogenen beter kunnen overleven op de bladoppervlakken.
Bovendien zal de celwand van de planten enzymatisch stukgemaakt worden door zachte rot,
waardoor meer nutriënten beschikbaar worden voor pathogenen (Aruscavage et al., 2008;
Brandl, 2008).
Het is ook mogelijk dat de pathogenen zich internaliseren in de plant. De twee wegen van
Salmonella spp. en VTEC O157 om de plant binnen te treden, zijn enerzijds via openingen
(huidmondjes en beschadigde delen) en anderzijds via passief meebewegen met het water in
de plant (Deering et al., 2012; Lynch et al., 2009; Olaimat & Holley, 2012). Eens de
ziekteverwekker in de plant binnendringt, heeft desinfectie of wassen van het oppervlak geen
invloed meer op het pathogeen en kunnen ze overleven (Gorbatsevich, Sela, Pinto, &
Bernstein, 2013; Luo et al., 2010; Lynch et al., 2009). De aangewezen oorzaak is dat de
pathogenen kunnen binnendringen in de huidmondjes en daar bescherming krijgen tegen
ontsmettingsmiddelen (Doyle & Erickson, 2008; Golberg et al., 2011; Heaton & Jones, 2008).
Een tekort aan nutriënten zou een negatieve invloed hebben op de overleving en groei van de
pathogenen (Doyle & Erickson, 2008).
Om te kunnen overleven moeten voldoende nutriënten en dus beschadigde plantendelen
aanwezig zijn voor de pathogenen, maar dit is tweeërlei, want aangetaste stukken geven ook
antimicrobiële componenten vrij (Aruscavage et al., 2008). Basilicum bezit antimicrobiële
componenten, zoals linalool, estragol en methyl chavicol (Karagözlü et al., 2011; Kisluk et
al., 2013; Tajkarimi et al., 2010). De werking van de essentiële oliën zou berusten op het
stukmaken van de celmembraan van de bacterie, met als gevolg afsterving. Zoals verder zal
blijken (zie 1.3.4), is het effect van de essentiële oliën van basilicum afhankelijk van het
serotype voor Salmonella spp. Een hogere resistentie voor deze componenten zou verklaard
kunnen worden door een verschil in de samenstelling van het celmembraan van deze
serotypes. Het werkingsmechanisme van de essentiële oliën wordt echter nog niet volledig
begrepen (Kisluk et al., 2013).
1.3.2 Competitie met de van nature aanwezige microbiële populatie
Pathogenen strijden met de achtergrondmicrobiota van verse kruiden en bladgroenten om
beschikbaar vocht en aanwezige nutriënten (Aruscavage et al., 2008; Doyle & Erickson,
2008). De groei van pathogenen kan enerzijds gecontroleerd worden met behulp van een lage
14
temperatuur (< 7 °C). Anderzijds treedt meer competitie op tussen de achtergrondflora en de
pathogenen bij het verhogen van de temperatuur (Luo et al., 2010). De samenstelling van
micro-organismen wordt dus bepaald door de concurrentie tussen de achtergrondmicrobiota
en pathogenen bij een bepaalde temperatuur (Delaquis & Dinu, 2007).
Er is ook gekend dat Salmonella spp. meer voorkomt op bladeren waarbij al bederf optreedt
(Deering et al., 2012; Doyle & Erickson, 2008). Consumenten zullen een product vaak visueel
beoordelen. Bederf op bladgroenten, zal hen er toe aanzetten het product niet meer te
consumeren. Volgens Luo et al. (2010) is er voorlopig geen significante informatie
beschikbaar die zegt dat de zichtbare kwaliteit van een levensmiddel achteruitgaat indien
pathogenen groeien op bladgroenten.
1.3.3 Invloed van de temperatuur
Controle van de temperatuur wordt aanzien als één van de belangrijkste factoren voor het
behoud van de veiligheid en kwaliteit van verse kruiden en bladgroenten (Campbell et al.,
2001; Luo et al., 2010; Sant'Ana et al., 2012; Tian et al., 2012). Dit geldt nog sterker voor de
gesneden varianten (Campbell et al., 2001; Tian et al., 2012).
Handhaven van een correcte temperatuur speelt een belangrijke rol in de preventie en groei
van pathogenen. Algemeen gaat de voorkeur naar een bewaartemperatuur van < 7 °C, waarbij
de groei gecontroleerd is, want de groei daalt bij temperaturen ≤ 8 °C (Baylis et al., 2011;
Delaquis & Dinu, 2007). Tian et al. (2012) raadt aan om sla (zoals Romeinse sla en ijsbergsla)
te bewaren bij temperaturen lager dan 4 °C om de groei van pathogenen te voorkomen. Bij
basilicum moet naast de veiligheid ook rekening gehouden worden met de visuele kwaliteit.
Er wordt geadviseerd om basilicum te bewaren bij 12 – 15 °C om koudeschade te voorkomen
(Elviss et al., 2009).
1.3.4 Onderzoeken naar de overleving van VTEC O157 en Salmonella spp.
op verse kruiden zoals basilicum en bladgroenten
In de literatuur zijn enkele onderzoeken terug te vinden waarin de invloed van de nutriënten
en
antimicrobiële
componenten,
de
temperatuur
en
de
competitie
met
de
achtergrondmicrobiota voor basilicum wordt beschreven. Bovendien worden ook studies
teruggevonden waarin de overleving van VTEC O157 en Salmonella spp. werd nagegaan op
andere verse kruiden en bladgroenten.
In de studie van Stopczynska and Jadczak (2007) werd de invloed van het versnijden van
verse basilicum nagegaan. Het aeroob mesofiel kiemgetal steeg met 0,8 log kve/g en de gisten
15
namen met 1 log kve/g toe ten opzichte van de resultaten bij niet versneden basilicum. Er
werd geen stijging van het aantal schimmels waargenomen na versnijden.
Uit onderzoek van Kisluk et al. (2013) kan besloten worden dat Salmonella Senftenberg op
basilicumbladeren beter bestand is tegen de antimicrobiële componenten zoals eugenol,
linalool en methyl chavicol ten opzichte van Salmonella Typhimurium. Het aantal van het
serotype Senftenberg was 2 log kve/g hoger na 48 uur in vergelijking met Typhimurium op de
basilicumbladeren. De mate deze pathogeen bestand is tegen de antimicrobiële componenten,
is dus afhankelijk van het serotype. Nadat een verschil vastgesteld werd tussen deze twee
serotypen, gingen Kisluk et al. (2013) nog verder. Ze onderzochten wat de invloed was van
essentiële olie van basilicum en de drie componenten (eugenol, linalool en methyl chavicol)
apart. Hieruit kon besloten worden dat er meer inhibitie optrad door de componenten en de
basilicumolie bij het serotype Typhimurium in vergelijking met Senftenberg. Vervolgens
leverde linalool bij beide serotypes het meest inhibitie op.
Volgens Gorbatsevich et al. (2013) overleefde Salmonella Newport minder dan 22 uur in
basilicum, terwijl dit ten minste acht dagen was indien de Salmonella Newport zich op de
bladeren bevond. Er werd tevens een significant verschil waargenomen in de hoeveelheid
Salmonella Newport tussen boven -en onderzijde van het basilicumblad in de eerste drie
dagen van de overlevingsstudie, met de hoogste aantallen op de onderzijde. Nadien werd geen
significant verschil meer waargenomen en daalde de hoeveelheid Salmonella Newport tot een
gelijk niveau. Acht dagen na inoculatie, resulteerde dit in een afname van 5 log kve/g aan
beide zijden. Het verschil in de eerste drie dagen kon onder andere te wijten zijn aan de
hogere afscheiding van antimicrobiële componenten op de bovenzijde. De temperatuur van de
omgeving bedroeg gedurende de studie 12 °C tot 30 °C.
Salmonella Typhimurium kwam significant meer voor op de bladeren van Romeinse sla, rode
sla, peterselie, basilicum en tomaten in tegenstelling tot de hoeveelheid pathogeen in de
bladeren. Voor ijsbergsla en rucolasalade werd geen verschil waargenomen. Het verschil van
de hoeveelheid pathogeen in basilicum in vergelijking met ijsbergsla en rucola, zou te
verklaren zijn door de aanwezige antimicrobiële componenten van basilicum, die tevens
Salmonella Typhimurium inhiberen (Golberg et al., 2011).
Campbell et al. (2001) nam een stijging van 3 log kve/g waar van Salmonella Thompson bij
versneden koriander na één dag bewaren bij 26 °C, terwijl er geen stijging waargenomen
werd bij niet versneden koriander na drie dagen bewaren. Na één dag werd bederf
waargenomen van de gesneden koriander indien bewaard werd bij 26 °C. Men scheidde de
bedorven blaadjes van de niet bedorven en bewaarde verder gedurende 1 dag bij 26 °C.
Hieruit volgde dat Salmonella Thompson in grotere mate groeide op de bedorven, gesneden
koriander bewaard bij 26 °C in vergelijking met de niet bedorven, gesneden koriander. De
16
oorzaak die toegekend werd, was het in grotere mate vrijkomen van nutriënten bij de
bedorven koriander.
Uit onderzoek van Aruscavage et al. (2008) volgt dat VTEC O157:H7, geïnoculeerd op sla, in
hogere mate aanwezig blijft bij bewaring gedurende tien dagen bij 20 °C tot 25 °C op
beschadigde planten (gekraakte hoofdnerf) in vergelijking met de niet beschadigde. Bij de
onaangetaste sla werd na tien dagen bij dezelfde bewaarcondities een daling van 3 log kve/g
waargenomen.
Uit de studie van Brandl (2008) volgt dat VTEC O157:H7 het meest toeneemt bij
versnipperde stukken sla (1,0 log kve/g), gevolgd door grote stukken gesneden sla (0,7 log
kve/g) en mechanisch gekneusde sla (0,6 log kve/g) na 4 uur bij 28 °C. Bij onbeschadigde sla
veranderde de hoeveelheid VTEC O157:H7 niet. De hoogste toename bij versnipperde sla is
te verklaren doordat de sla bij deze behandeling het meest beschadiging heeft ondergaan
waardoor dus het meeste nutriënten vrijkomen.
Voor basilicum kan besloten worden dat er geen groei optreedt bij 4 °C, met uitzondering van
Salmonella Senftenberg. De groei van Salmonella spp. en VTEC O157 treedt op vanaf 12 °C
en bij escarole en rucolasalade zelfs vanaf 7 °C (Tabel 3).
17
Tabel 3: Invloed van de temperatuur op de overleving van Salmonella spp. en VTEC op bladgroenten en kruiden
Geen verandering betekent dat de waarde met 0,5 log kve/g of minder gestegen/gedaald is gedurende de overlevingstudie (Sant'Ana et al., 2012).
1
Slechts 19 bewaardagen door de onaanvaardbare visuele kwaliteit van koriander, bieslook en basilicum. Bij basilicum was de visuele kwaliteit niet meer acceptabel door het voorkomen van schimmels en
het uittreden van water.
Levensmiddel
Pathogeen
Bewaarcondities:
Resultaat
Referentie
4 °C (3 dagen)
+ 0,9 log kve/g
(Kisluk et al., 2013)
25 °C (3 dagen)
+ 2,9 log kve/g
4 °C (3 dagen)
Geen verandering
25 °C (3 dagen)
+ 2,0 log kve/g
4 °C (24 dagen)
- 0,8 tot - 1,6 log kve/g
Temperatuur (tijd)
Basilicum
Salmonella Senftenberg
Salmonella Typhimurium
Gesneden
oregano,
VTEC O157:H7
peterselie, rozemarijn
Salmonella spp.
Gesneden
VTEC O157:H7
koriander,
bieslook, basilicum
Salmonella spp.
Gesneden koriander
Salmonella Thompson
4 °C (19 dagen)1
- 0,9 tot - 1,0 log kve/g
- 0,7 tot - 0,8 log kve/g
2 °C (3 dagen)
Geen verandering
26 °C (1 dag)
+ 3,0 log kve/g
VTEC O157:H7 en
4 °C (14 dagen)
- 1,0 log kve/g voor beide pathogenen
Salmonella Typhimurium
22 °C (3 dagen)
+ 3,0 log kve/g voor beide pathogenen
Gesneden Romeinse sla
VTEC O157:H7 en
4 °C (15 dagen)
- 1,0 log kve/g voor VTEC O157:H7 op beide slasoorten
en ijsbergsla
Salmonella Typhimurium
Gesneden ijsbergsla
(Hsu et al., 2006)
- 1,2 tot - 1,4 log kve/g
(Campbell et al., 2001)
(Chang & Fang, 2007)
(Tian et al., 2012)
- 0,8 log kve/g voor Salmonella Typhimurium op ijsbergsla en geen
verandering voor Romeinse sla
Gesneden sla met onder
VTEC O157: H7
andere Romeinse sla en
15 °C (1 dag)
+ 2,0 log kve/g op beide slasoorten voor beide pathogenen
5 °C (8 dagen)
Geen verandering
12 °C (8 dagen)
+ 2,0 tot 3,0 log kve/g voor ¾ van de testen
ijsbergsla
Geen verandering bij ¼ van de testen
Escarole, collard green,
spinazie,
rucola,
(Luo et al., 2010)
Salmonella spp.
7 °C (6 dagen)
waterkers,
verandering bij sla, spinazie, waterkers en afname bij kool (- 0,9 log
sla (Romeinse
sla en botersla) en kool
Groei bij escarole (+ 1,0 log kve/g) en rucola (+ 2,0 log kve/g), geen
kve/g) en collard green (- 0,7 log kve/g)
15 °C (6 dagen)
Groei bij escarole (+ 2,8 log kve/g), collard green (+ 2,6 log kve/g),
spinazie (+ 1,7 log kve/g), waterkers (+2,4 log kve/g), sla (+ 2,6 log
kve/g) en rucola (+ 4 log kve/g) en geen verandering bij kool
(Sant'Ana et al., 2012)
2 Proefopzet
Het praktisch deel betreft twee centrale onderzoeksvragen, die beantwoord zullen worden via
verschillende onderzoeksdoelstellingen. Een overzicht van de proefopzet is aanwezig als
bijlage 1.
1. Waaruit bestaat de natuurlijke microbiële populatie aanwezig op basilicum?
 Analyse van basilicum op de aanwezigheid van E. coli, coliformen en de
pathogenen EHEC en Salmonella spp.
 Karakterisatie van de microbiële gemeenschap aanwezig op basilicum met de
cultuuronafhankelijke
moleculaire
methoden
denaturatie
gradiënt
gelelektroforese (DGGE) en next-generation sequencing (NGS).
2. In welke mate stijgt/daalt het aantal log kve/g van Salmonella (Thompson en
Typhimurium, 1:1) en een E. coli O157 mix (1:1) op basilicum en bladgroenten
(kropsla, spinazie en baby leaves) gedurende bewaring bij verschillende
temperaturen? En is er een verschil tussen de groei/overleving van deze pathogenen
op basilicum en bladgroenten?
 Invloed van de bewaartemperatuur (7 °C, 15 °C of 22 °C) en de tijd (dag 0 tot en
met dag 10) nagaan op de overleving van Salmonella (Thompson en
Typhimurium, 1:1) en een E. coli O157 mix (1:1) op basilicum.
 Invloed van de bewaartemperatuur (7 °C, 15 °C of 22 °C) en tijd (dag 0 tot en
met dag 3) nagaan op de overleving van Salmonella (Thompson en
Typhimurium, 1:1) en een E. coli O157 mix (1:1) op kropsla, spinazie en baby
leaves.
Aan de hand van het praktisch deel, zal een antwoord geformuleerd worden op de
verschillende onderzoeksvragen.
19
3 Materiaal en methoden
In dit hoofdstuk worden de protocollen en technieken toegelicht die nodig zijn voor de
uitvoering van de proeven. Vervolgens wordt ook de keuze van de statistische testen
gemotiveerd.
3.1 Natuurlijke microbiële populatie aanwezig op basilicum
3.1.1 Analyse van basilicum op de aanwezigheid van E. coli, coliformen en
de pathogenen EHEC en Salmonella spp.
De aanwezigheid van de hygiëne-indicatoren E. coli en coliformen en van de pathogenen
(EHEC en Salmonella spp.) werd nagegaan op basilicumstalen afkomstig uit België, Cyprus
en Israël. Binnen het kader van Veg-i-Trade werden 100 stalen geanalyseerd afkomstig per
land van herkomst. De analyse gebeurde volgens het oogstseizoen (juni tot september voor
België, ganse jaar door voor Cyprus en Israël) volgens de methode afgebeeld in Figuur 5.
Slechts 39 stalen (21 van Cyprus en 18 van Israël) van de 300 vielen binnen het bestek van
deze thesis. De stalen werden telkens geanalyseerd op de dag van ontvangst, waarbij de
resultaten de dag erna bekomen werden, met uitzondering van de pathogenen. De DNAextracten werden in de diepvries bewaard (- 20 °C) totdat er voldoende stalen waren om te
analyseren.
25 g basilicum + 225 ml BPW
E. coli
coliformen
EHEC en Salmonella spp.
1 ml op
petrifilm
gietplaten
+ deklaag
(10-1 - 10-4) met
VRBL
incuberen
(18 - 24 uur bij
37 °C)
incuberen
(24 uur ± 3 uur
bij 37 °C)
tellen
incuberen
(24 uur ± 2 uur
bij 37 °C)
tellen
DNA-extractie
+ GeneDisc
(qPCR)
aan -of
afwezigheid
per 25 g
bevestiging
positieve
resultaten
Figuur 5: Proefopzet analyse basilicum
21
3.1.1.1 Beoordeling van de visuele kwaliteit
De stalen werden opgehaald op de dag van de analyse. Voor alle basilicumstalen werd gestart
met een visuele controle. Dit om een algemeen beeld te krijgen van de kwaliteit van het
monster. Hiervoor werden zes parameters nagegaan, namelijk koudeschade, bederf, gebroken
blaadjes, versheid, proper snijoppervlak en ten slotte het zwartkleuring aan de top van het
kruid. Deze categorieën werden niet via een score, maar algemeen beoordeeld.
3.1.1.2 Microbiologische analyse
Voor de microbiologische analyse werd 25 g van het staal afgewogen in een
filterstomacherzak en tien keer verdund met 225 ml Buffered Peptone Water (BPW; Oxoid,
Engeland). Vervolgens werd dit staal gehomogeniseerd gedurende één minuut in een
stomacher (Led Techhno, België) (Figuur 5).
3.1.1.2.1
E. coli
De hoeveelheid aanwezige E. coli werd bepaald door 1 ml van de 1/10 verdunning op een
selectieve petrifilm voor E. coli (Select E. coli petrifilm, 3M) te brengen. Nadien werd deze
geïncubeerd bij 37 °C gedurende 24 uur ± 3 uur.
3.1.1.2.2
Coliformen
Voor de detectie van coliformen werd opnieuw vertrokken vanuit de 1/10 verdunning (Figuur
5). Daaropvolgend werd een verdunningsreeks aangemaakt tot en met 10-4 in Peptone
Physiological Salt Solution (PPS; 8,5 g/l NaCl (Sigma-Aldrich, Zwitserland) en 1 g/l
Neutralized Bacteriological Peptone (NBP; Oxoid, Engeland)). Van elke verdunning werd een
gietplaat gemaakt, waarbij 1 ml van de verdunningsvloeistof werd overgebracht in een lege
petriplaat. Daarbij werd vervolgens ongeveer 15 ml vloeibare Violet Red Bile Lactose Agar
(VRBL; Oxoid, Engeland) gegoten. Nadien werd nog een deklaagje (± 4 ml) gegoten, om de
facultatief anaërobe condities na te bootsen. Deze gietplaten werden bij 37 °C geïncubeerd
gedurende 24 uur ± 2 uur. De detectielimiet bedroeg voor deze platen 1 log kve/g.
3.1.1.2.3
Detectie van EHEC en Salmonella spp.
GeneDisc Cycler (qPCR)
Bij deze proefopzet werd de aanwezigheid van EHEC en Salmonella spp. bepaald per 25 g.
De pathogenen werden gedetecteerd aan de hand van de GeneDisc Cycler (Pall Corporation,
Frankrijk).
De
GeneDisc
analyse
is
gebaseerd
op
een
semi-kwantitatieve
polymerasekettingreactie (qPCR) en is een vorm van multiplex qPCR.
Eén GeneDisc plaat bevatte zes sectoren (één sector per staal) en per sector waren zes
welletjes aanwezig. De aanwezigheid van een bepaald DNA-fragment werd nagegaan per
welletje. De welletjes bevatten gedroogde primers en fluorescente probes. De probes werden
hiervoor gelabeld met 2 reportermoleculen, namelijk 6-FAM en ROX, die respectievelijk bij
22
490 – 520 nm en 580 – 620 nm zichtbaar zijn (Beutin, Jahn, & Fach, 2009). De platen die
werden gebruikt voor deze analyse spoorden Salmonella spp. en EHEC op. Meer specifiek
werd het voorkomen van vtx-1, vtx-2, eae en Salmonella spp. nagegaan. Daarnaast was ook
een negatieve controle en een inhibitiecontrole aanwezig. Vtx-2, Samonella spp. en de
negatieve controle werden opgespoord met de FAM-detector, terwijl vtx-1, eae en de
inhibitiecontrole met de ROX-detector werden aangetoond. Eén GeneDisc plaat maakte het
mogelijk om zes stalen in één keer te analyseren op al deze parameters.
Analyse
Na de microbiologische analyse van de E. coli en de coliformen, werd de rest van de 1/10
verdunning geïncubeerd bij 37 °C voor 18 tot 24 uur (Figuur 5). Deze filterzak werd nadien
gehomogeniseerd door kneden met de handen. Van de aangerijkte oplossing werd 50 µl in een
lyse tube gebracht, waarna de DNA-extractie plaatsvond. De lyse tube werd hiervoor verhit in
een verhittingsblok (Lab Line Instruments, Italië) gedurende 10 minuten bij 100 ± 5 °C. Na
deze stap kon het staal ingevroren worden bij - 20 °C, indien analyse niet mogelijk was de dag
zelf. Voor de analyse met de GeneDisc Cycler, werd het toestel aangelegd zodat het kon
opwarmen. Hiervoor werd de barcode van op de GeneDisc plaat en de mastermix ingescand.
Daarna werd het staal, indien nodig na ontdooien, gehomogeniseerd met behulp van een
vortex en gecentrifugeerd gedurende 2 minuten bij 10000 g (relatieve centrifugale kracht).
Vervolgens werd 36 µl van het supernatants van het gecentrifugeeerde staal in een
eppendorfbuisje
(Eppendorf,
Duitsland)
gebracht,
waaraan
ook
36
µl
van
een
verdunningsbuffer werd toegevoegd om ½ keer te verdunnen. Dit was nodig om inhibitie van
de PCR-reactie te voorkomen. Dit werd vastgesteld in een evaluatietest van het LFMFP labo.
Na homogeniseren van het verdunde DNA-extract (door op en neer te pipetteren), werd 36 µl
van de mastermix (bevat polymerase en deoxynucleotiden (dNTP)) toegevoegd in elke sector
van de GeneDisc, gevolgd door 36 µl van het verdunde staal. De volgende stappen van de
analyse gebeurden met behulp van het GeneDisc Cycler. De plaat werd hierbij eerst vacuüm
gezogen, door een pomp te bevestigen op de centrale opening van de sectoren. Hierdoor werd
de vloeistof naar de welletjes gebracht. Nadien werden per sector vier druppels minerale olie
toegevoegd. Vervolgens werd de plaat opnieuw vacuüm gezogen. Minerale olie werd
toegevoegd om de plaat af te sluiten en te voorkomen dat het staal zou verdampen tijdens de
PCR reactie (Beutin et al., 2009; Pall, 2013). Tenslotte werd de plaat in het opgewarmde
toestel gezet en werd de analyse opgestart voor 55 minuten waarin 45 cycli plaatsvonden
(Beutin et al., 2009). Bij real time PCR werd het fluorescentiesignaal van de FAM en ROX
reporters onmiddellijk gemeten en uitgezet ten opzichte van het aantal doorlopen cycli.
Hieruit werd de semi-kwantitatieve Ct-waarde afgeleid, waarbij het signaal van de target zich
onderscheidde van de achtergrond (Beutin et al., 2009; Postollec, Falentin, Pavan,
Combrisson, & Sohier, 2011). Een Ct-waarde ≥ 40 werd beschouwd als negatief resultaat.
23
Bovendien werd er slechts gesproken van een PCR-positief resultaat voor EHEC indien eae
aanwezig was in combinatie met vtx-1 of vtx-2.
Daarnaast werd 10 ml van het aangerijkte staal aangelengd met 30 % glycerol. Na goed
homogeniseren met behulp van een vortex, werd deze oplossing bewaard bij - 75 °C. Deze
werden bewaard voor verdere analyse (bevestiging) indien een PCR-positief resultaat
bekomen werd na het uitvoeren van de GeneDisc analyse. De positieve bevestigingen werden
uitgevoerd door het LFMFP labo.
3.1.2 Microbiële diversiteit aanwezig op basilicum
De diversiteit van de micro-organismen aanwezig op basilicum werd onderzocht met behulp
van uitplatingen (op Tryptone Soya Agar (TSA; Oxoid, Engeland), Xylose Lysine
Desoxycholate Agar (XLD; Oxoid, Engeland) en VRBL), via denaturatie gradiënt
gelelektroforese (DGGE) en next-generation sequencing (NGS) op twee verschillende
basilicumstalen, namelijk afkomstig uit België en Israël. De Belgische werd aangekocht als
plantje in een lokale supermarkt te Gent. Enkel de blaadjes werden gebruikt gedurende deze
studie. De basilicum uit Israël werd in plastiek dozen geleverd, waarbij de kruiden afgesneden
waren aan de basis van de tak.
Gedurende deze studie werd gewerkt met vijf verschillende basilicumpartijen (Tabel 4). De
bacteriën die van nature op basilicum voorkwamen werden bepaald voor basilicumbatch I, II
en III. Bovendien werd de populatie van bacteriën geëvalueerd tijdens een aanrijking in BPW
bij 37 °C en gedurende veertien dagen bewaren bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15
°C en 22 °C).
Tabel 4: Basilicumpartijen
Basilicumpartij
Herkomst
log kve/g
I
België
5,8
II
Israël
6 ,1
III
Israël
6,1
IV
België
5,0
V
Israël
6,7
De analyse startte telkens met de staalvoorbereiding, gevolgd door de DNA-extractie, PCR en
ten slotte DGGE. Voor sommige stalen werd ook NGS uitgevoerd (Figuur 6).
3.1.2.1 Staalvoorbereiding
3.1.2.1.1
Optimalisatie en karakteristisatie van bacteriën aanwezig op basilicum
Er werden verschillende staalvoorbereidingen toegepast voor het bepalen van de bacteriële
populatie aanwezig op basilicum (Figuur 6). Als eerste werden basilicumblaadjes gewassen in
een twintigvoud PPS en 1 % Tween®80 op een schudder (yellow line OS10 shaker IKA,
24
Duitsland) aan 200 tpm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Daarnaast werd
basilicum gedurende 1 minuut gehomogeniseerd in een tienvoud PPS of BPW met behulp van
een stomacher. Na wassen of stomacheren werd de vloeistof gefiltreerd over een papieren
voorfilter (Whatman®, Duitsland) om grotere plantendeeltjes te verwijderen, gevolgd door een
0,22 µm filter (Millipore, Ierland) om bacteriën te weerhouden tot de filter verzadigd was. De
0,22 µm filter werd ofwel direct geëxtraheerd, ofwel werd het gefilterde materiaal opnieuw
opgelost in PPS, waarna de DNA-extractie plaatsvond. Tenslotte vond ook een directe
extractie van gesneden basilicumblaadjes plaats. De fractie cultiveerbare bacteriën werd
bepaald door de kolonies bekomen na een uitplating van 100 µl verdunde basilicum op TSA,
VRBL en XLD af te wassen met PPS na 1 - 3 dagen bij 30 - 37 °C voor TSA en na 24 uur ± 3
uur bij 37 °C voor VRBL en XLD.
Figuur 6: Staalvoorbereiding van basilicum voor DGGE en NGS
25
3.1.2.1.2
Evolutie bacteriële diversiteit
Gedurende een aanrijking in BPW bij 37 °C
De verandering van de bacteriële populatie van gestomacherde basilicum I (België) en II
(Israël) in BPW werd nagegaan. Op tijdstip nul werd een 1/10 verdunning gemaakt van
basilicum in BPW en bewaard bij 37 °C. Na 5 uur, 20,5 uur en 28 uur (basilicum II) en na 3
dagen (basilicum I) werd deze aanrijking geanalyseerd (zie 3.1.2.1.1).
Gedurende veertien dagen bewaring bij drie temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C)
De evolutie van de bacteriële diversiteit op basilicum werd nagegaan gedurende veertien
dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). Hiervoor werd gebruik
gemaakt van basilicumpartij IV (België) en V (Israël). De stalen (30 g/staal) werden op dag
nul verpakt in zakjes van 15 x 15 cm met een doorlaatbaarheid van 4600 ml O2/m² d atm (bij
7 °C; Amcor flexibles, België) en bewaard onder lucht bij de correcte temperatuur (7 °C, 15
°C of 22 °C).
Op dag nul, na vier, na zeven, na elf en na veertien dagen werden de stalen geanalyseerd door
de basilicumblaadjes te wassen met Tween®80 in PPS (zie 3.1.2.1.1). Van het waswater werd
tevens een uitplating gedaan op TSA. Na 24 uur ± 3 uur bewaren bij 30 °C werden de platen
afgewassen met PPS. Ook de visuele kwaliteit werd gequoteerd op dezelfde manier dan
beschreven bij de overlevingsstudie van VTEC O157 en Salmonella Thompson en
Typhimurium op basilicum (zie 3.2.1.4).
3.1.2.2 DNA-extractie
3.1.2.2.1
Fastprep 96TM
De DNA-extractie met behulp van de fastprep 96TM (MP biomedicals, Belgium) is gebaseerd
op een mechanische lysis van de bacteriecellen met behulp van glasparels en een lysebuffer.
Het protocol van deze methode is aanwezig als bijlage 2.
3.1.2.2.2
NucliSENS®EasyMAG®
Met de NucliSENS®EasyMAG® (BioMérieux, Frankrijk) worden de bacteriecellen
stukgemaakt met behulp van een lysebuffer, waarna de vrijgekomen nucleïnezuren binden aan
magnetische silica. Na enkele wasstappen, worden de nucleïnezuren gescheiden van de silica
en terug vrijgegeven in een eluaat. Het protocol van deze extractie is aanwezig als bijlage 3.
3.1.2.3 Controle extracten op gel
Na de extractie werden de stalen gecontroleerd via gelelektroforese op een agarosegel (1,2
%). De gel werd aangemaakt door 0,6 g agarose (Invitrogen, USA) te mengen met 50 ml van
de TAE-buffer (20 mM Tris, 10 mM acetaat, 0,5 mM EDTA pH 7,4; AplliChem, Duitsland)
en op te warmen gedurende ongeveer 1 minuut. Bij de stalen werd laadbuffer gebracht in een
verhouding van 1/5 op het staalvolume. De hoeveelheid van de ladder bedroeg 2,5 µl
26
(MassRuler Mix; ThermoScientific). Ten slotte werd 2,5 µl tot 6 µl van het staal geladen
afhankelijk van de grootte van de uitsparingen. De elektroforese werd uitgevoerd met behulp
van Mupid®-ExU (Advance CO, Japan) voor 20 minuten bij 100 V. Nadien werd de gel 10
minuten in een gesloten bad met ethidiumbromide (Sigma-Aldrich, Duitsland) gebracht,
waarna het resultaat gevisualiseerd werd met de Proxima AQ-4 (Isogen Life Science,
Nederland).
3.1.2.4 Polymerasekettingreactie (PCR)
De PCR werd uitgevoerd van alle geëxtraheerde staaltjes. Elke welletje bevatte hierbij 24 µl
mastermix (samenstelling zie Tabel 5) en 1 µl staal (DNA-extract). De samenstelling van de
mastermix bij DGGE wijkt wat af van deze bij NGS. Voor beide methoden werden ander
primers gebruikt in een andere concentratie. Het temperatuursprofiel bestond uit 5 minuten bij
94 °C, gevolgd door 30 cycli van 1 minuut bij 95 °C, 1 minuut bij 53 °C en tenslotte 2
minuten bij 72 °C. Nadien werden de staaltjes nog 10 minuten warm gehouden bij 72 °C en
uiteindelijk werd afgekoeld tot 4 °C. Voor de evolutie van de bacteriële diversiteit van
basilicum gedurende veertien dagen werd gebruik gemaakt van 35 cycli, door een te zwak
resultaat na 30. De stalen werden voor de PCR steeds onverdund, vaak 10 keer verdund en
soms 100 keer verdund geanalyseerd.
Er werd steeds een negatieve controle uitgevoerd door water in plaats van DNA sjabloon toe
te voegen. Nadien werd de amplificatie gecontroleerd op gel (zie 3.1.2.3)
Tabel 5: Samenstelling van de mastermix voor één staal
Concentratie
Hoeveelheid van
werkoplossing
de werkoplossing
(µl) voor 1 staal
Water (Sigma-Aldrich Life Sciences, USA) (DGGE/NGS)
18,54/18,06
MgCl2 (ThermoScientific)
1,5 mM
1,44
Taq buffer met KCl (ThermoScientific)
50 mM
2,40
dNTP's (ThermoScientific)
10 mM
0,48
Voorwaartse primer (DGGE/NGS)
10 µM
0,48/0,72
Terugkerende primer (DGGE/NGS)
10 µM
0,48/0,72
Taq Polymerase (ThermoScientific)
5 U/µl
0,12
Bovine Serum Albumine (BSA; Roche Diagnostics, Duitsland)
20 mg/ml
0,06
Totaal volume mastermix
24 µl
27
3.1.2.5 Denaturatie Gradiënt Gelelektroforese (DGGE)
Er werd een PCR uitgevoerd met twee universele primers voor de 16S rRNA regio. De
sequenties van de primers zijn voor de voorwaartse primer (338) met de GC-klem 5' CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG ACT CCT ACG GGA
GGC AGC AG - 3' en voor de terugkerende primer (518) 5' - ATT ACC GCG GCT GCT GG
- 3' (Muyzer, de Waal, & Uitterlinden, 1993). Het doelwit van de primers was het 16S rRNA
gen, meer bepaald de variabele regio V3 die tussen de geconserveerde gebieden van de vooren achterwaartse primers ligt. De PCR werd nadien gecontroleerd met behulp van
gelelektroforese (zie 3.1.2.3). Indien er sprake was van een amplificatie, werd de DGGE
uitgevoerd.
De DGGE analyse werd volbracht met INGENYphorU (Ingeny International BV, Nederland)
voor de evolutie van de bacteriepopulaties aanwezig op basilicum gedurende veertien dagen.
Bio-Rad (USA) werd gebruikt voor alle andere stalen. DGGE werd uitgevoerd met een 8 m/V
% polyacrylamidegel. Er werd gebruik gemaakt van een gradiënt met de 45 % en 60 %
denaturatiebuffer. De analyse duurde 16 uur bij 60 °C en een voltage van 120 V voor
INGENY en 38 V voor Bio-Rad. Bij het laden van de stalen, werden steeds enkele merkers,
verspreid over de gel, meegenomen met als doel om nadien verschillende gels onderling te
kunnen vergelijken (Callewaert et al., 2013).
De bandjes werden gevisualiseerd met behulp van SYBR Green (life technologies, USA).
Tenslotte werden de resultaten geanalyseerd met BioNumerics software 5.10 (Applied Maths,
Belgium). De laantjes werden gedefinieerd en de gels werden genormaliseerd door de
gebruikte merkers te standaardiseren. Dit hield in dat de bandjes van de merkers op gelijke
hoogte werden gebracht. De merkers maakten het dus mogelijk om stalen aanwezig op
verschillende gels te vergelijken met elkaar. Het protocol van deze techniek is aanwezig als
bijlage 4 en was gebaseerd op Muyzer et al. (1993).
3.1.2.6 Next-Generation Sequencing (NGS)
De PCR werd uitgevoerd met twee universele primers voor de 16S rRNA regio. De sequenties
van deze primers zijn voor de voorwaartse primer (27) 5' - AGA GTT TGA TCC TGG CTC
AG - 3' en voor de terugkerende primer (533) 5' - TTA CCG CGG CTG CTG GCA C - 3'
(Lane, 1991; Weisburg, Barns, Pelletier, & Lane, 1991). De PCR werd gecontroleerd via
gelelektroforese (zie 3.1.2.3). Nadien werd een zuiveringsstap uitgevoerd met behulp van een
zuiveringskitje (PureLink® PCR Purification Kit; Life Technologies, België). Bovendien werd
de concentratie van het DNA gemeten met de Qubit® dsDNA HS Assay Kit, (Life
Technologies, België). De 454 pyrosequencing werd uitgevoerd door Beckman Coulter
Genomics (USA) met behulp van het GS FLX systeem (Roche, Duitsland).
28
Om meerdere stalen te kunnen analyseren in één sequeneringsrun, werd een multiplex
identificeerder (TCMID) met een grootte van tien basenparen (bp) aan het PCR-product
gehangen om de sequenties afkomstig van verschillende stalen nadien weer te scheiden en
apart te analyseren. De verschillende stalen werden onderscheiden doordat bij elk staal een
gekende, maar verschillende TCMID gebonden was aan het 5' - uiteinde van beide primers
(Penaud, Dimova, Tirrell, & de Leeuw, 2013). Deze primers vermenigvuldigen hetzelfde
variabele gebied V3 van het 16S rRNA gen in vergelijking met DGGE, samen met de V1 en
V2, in totaal ongeveer 500 bp. De hogere lengte geeft later een hogere betrouwbaarheid aan
de identificatie en taxonomische classificatie.
3.2 Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en
Typhimurium
Het doel van de overlevingsstudie was om de groei van E. coli O157 en van Salmonella
Thompson en Typhimurium na te gaan op basilicum en dit te vergelijken met de overleving
van deze pathogenen op niet versneden, volledige bladeren van kropsla, jonge spinazie en
baby leaves (mengeling van jonge salade, bijvoorbeeld gouden franje, mizuna, rucola,...). Er
werd gebruik gemaakt van een mix van twee Salmonella stammen, nl. Salmonella Thompson
en Typhimurium in de verhouding 1:1. Eveneens voor E. coli O157 werden twee stammen
gebruikt (1:1). De groei van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium werd
nagegaan bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) gedurende tien dagen
voor basilicum en drie dagen voor de bladgroenten. Voor elke combinatie van tijd en
temperatuur werden drie herhalingen voorzien. Naast de microbiologische analyses werd
tevens de visuele kwaliteit beoordeeld gedurende de bewaring.
3.2.1 Basilicum
3.2.1.1 Opkweek E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium
stammen
Er werden twee Salmonella stammen (nl. Salmonella Thompson en Salmonella
Typhimurium) en twee E. coli O157 stammen gebruikt voor het overlevingsexperiment op
basilicum. Beide E. coli O157 stammen waren positief voor het eae-gen, maar negatief voor
de vtx-1 en vtx-2. De stammen van Salmonella en E. coli O157 waren afkomstig uit de
collectie van het labo voor levensmiddelenmicrobiologie en conservering (LFMFP,
Universiteit Gent) en werden er bewaard op parels in cryobuisjes bij - 75 °C.
E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium werden opgekweekt in 10 ml BHI
gedurende 24 uur ± 3 uur bij 37 °C en dit voor elke stam afzonderlijk. Voor E. coli O157,
resistent voor nalidixine zuur (nalidixine zuur; NA), werd NA (50 µg/ml) toegevoegd aan
BHI om de resistentiefunctie te behouden en in een latere fase, bij het uitplaten, de
29
achtergrondmicrobiota te onderdrukken door NA toe te voegen aan het medium. Vervolgens
werd een subcultivatie uitgevoerd van alle stammen, waarbij 100 µl van de 24 uur cultuur
werd overgebracht naar 10 ml BHI (met of zonder NA) en opnieuw bij 37 °C werd geplaatst
gedurende 24 uur ± 3 uur. Voor elke stam werd een slant aangemaakt van BHI + agar voor
Salmonella en BHI + NA (50 µg/ml) + agar voor E. coli O157. Nadien werden deze slants
bewaard bij 7 °C. In de overlevingsstudie van de bladgroenten kon dan van deze slants gestart
worden, door opnieuw een cultivatie en subcultivatie te laten plaatsvinden.
3.2.1.2 Inoculatie
De overlevingsstudie bestond uit verschillende stappen
cultivatie
subcultivatie
mix maken per pathogeen
verdunnen (1/10) en wassen
inoculum bewaren over het weekend
(15 °C)
(Figuur 7). Vooraleer de basilicum werd geïnoculeerd,
werden de twee stammen gemengd per pathogeen en
ontstond er een Salmonella mix (1:1) en de E. coli O157
mix (1:1). Deze werden tien keer verdund in PPS
alvorens te wassen om inoculum van 104 tot 105 kve/g
basilicum te bereiken. Elke pathogeen mix werd
gewassen om de invloed van de nutriënten, aanwezig in
BHI, te vermijden tijdens de overleving. Bij het wassen
dag 0
basilicum inoculeren
analyseren gewassen inoculum
analyse dag 0
werd telkens 1 ml van het ongewassen inoculum in een
effendorfeppendorfbuisje van 1,5 ml gebracht. De
buisjes werden gecentrifugeerd (1 minuut bij 14000
tpm), waarna de vloeistof werd verwijderd van de
dag 1 - dag 10
analyse dag zelf
aflezen resultaten van de dag ervoor
bekomen pellet. Vervolgens werd 1 ml steriel
(gedemineraliseerd) water toegevoegd aan de pellet,
gehomogeniseerd met behulp van een vortex en
Figuur 7: Proefopzet overlevingsstudie
basilicum
opnieuw gecentrifugeerd. Dit proces ging door tot de
pellet drie keer gewassen werd. Nadien werd opnieuw 1
ml steriel water toegevoegd aan de pellet, gehomogeniseerd en in een steriele falconbuis
(Meus, Italië) gebracht. Tenslotte werd dit gewassen inoculum bewaard bij 15 °C gedurende
het weekend.
De basilicum werd geleverd in schaaltjes van 25 g. Enkel stalen met een goede visuele
kwaliteit werden gebruikt voor het experiment. Hierbij werd vooral gelet op de afwezigheid
van schimmels en kapotte bladeren. Er werd er uitgegaan van de acceptatienormen van de
consument. Elk schaaltje van 25 g werd geïnoculeerd met 100 µl van het gewassen inoculum
zodat 104 - 105 kve/g werd bekomen. Deze 100 µl werd in vier stappen toegevoegd met
behulp van een multipipet (5 x 5 µl) om een goede verdeling van het inoculum op de
basilicum te waarborgen. Het gewassen inoculum werd verspreid tussen de basilicumbladeren
met behulp van een pincet en niet bovenop de bladeren zodat het inoculum niet in contact
30
gebracht werd met de verpakking. De basilicumbladeren werden voorzichtig vastgehouden
met het pincet om geen schade te veroorzaken en nutriëntvrijgave te voorkomen. Vervolgens
werden de verpakkingen gesloten en bewaard bij de aangegeven temperatuur (7 °C, 15 °C of
22 °C). De opvolging gebeurde gedurende tien dagen.
3.2.1.3 Microbiologische analyse
Vervolgens werd de microbiologische analyse uitgevoerd op dag 0 en na 1 tot en met 10
dagen bewaring door de basilicum (± 25 g) uit het schaaltje over te brengen in een
filterstomacherzak. Dit werd tien keer verdund door ± 225 ml PPS toe te voegen. Vervolgens
werd het staal gehomogeniseerd in de stomacher gedurende één minuut en werd een
verdunningsreeks aangemaakt in PPS. De juiste verdunning werd uitgeplaat op XLD voor
Salmonella Thompson en Typhimurium en op Chromocult Coliformen Agar + NA (50 µg/ml)
(CC + NA) voor E. coli O157. De strijkplaten werden nadien geïncubeerd bij 37 °C voor 24
uur ± 3 uur. Typische kolonies voor E. coli O157 waren roze kolonies op CC en voor
Salmonella Thompson en Typhimurium waren dit transparante kolonies met een zwarte kern
op XLD. De best telbare plaat (15-150 kve/strijkplaat) werd opgenomen als resultaat. Het
detectielimiet bedroeg 2 log kve/g. Vervolgens werd ook het aeroob mesofiel kiemgetal
geanalyseerd door drie blanco stalen te verdunnen in 225 ml PPS en vervolgens uit te platen
op TSA. Deze platen werden bewaard gedurende 24 uur ± 3 uur bij 37 °C. Het gewassen
inoculum werd tevens uitgeplaat op TSA om het startinoculum (kve/ml) te bepalen en zo de
verwachte aantallen op basilicum (kve/g) te kunnen schatten.
3.2.1.4 Beoordeling van de visuele kwaliteit
Naast de microbiële analyse, werd de visuele kwaliteit beoordeeld van elk geïnoculeerd staal.
Dit gebeurde op basis van het toekennen van scores voor acht parameters, namelijk
koudeschade (1 - 5), bederf (1 - 5), proper snijoppervlak (1 - 5), gekreukte blaadjes (1 - 5),
geelverkleuring (1 - 5), zwartkleuring aan de top van het kruid (1 - 5), versheid (1 - 5) en
tenslotte de algemene indruk (9 - 1). De acceptatielimiet lag voor de eerste zeven parameters
op 3 en voor de algemene indruk op 5, wat wilde zeggen dat de basilicum nog net
aanvaardbaar was. Een score van 5 voor de eerste zeven categorieën en een score van 1 voor
de algemene indruk, duidde op een onacceptabel product. Als een score van 1 en 9 werd
respectievelijk toegekend aan de eerste zeven parameters en de laatste, dan betekende een
onveranderd, acceptabel staal.
3.2.1.5 Dataverwerking
De resultaten werden verwerkt met IBM® SPPS® Statistics versie 22. Er werd gebruik
gemaakt van twee niet-parametrische testen, namelijk de Kruskall-Wallistest en Mann31
Whitney U test afhankelijk van het aantal te vergelijken klassen. Er werd geen parametrische
test uitgevoerd omdat de normaliteit zeer onnauwkeurig berekend zou worden door een te
laag aantal herhalingen. Voor elke combinatie van temperatuur en tijd waren drie herhalingen
aanwezig. Er was één afhankelijk variabele, namelijk het aantal log kve/g van E. coli O157 of
Salmonella Thompson en Typhimurium. Voor de meeste testen werd gebruik gemaakt van
een log reductie, wat wilde zeggen dat het aantal log kve/g van dag 1, dag 2, ..., dag 10 werd
verminderd met het aantal log kve/g bekomen bij dag 0. Naast de afhankelijk variabele, waren
er twee factoren, meer bepaald temperatuur en tijd. De factor temperatuur werd onderverdeeld
in drie klassen, namelijk 7 °C, 15 °C en 22 °C. De tijd werd opgesplitst in tien afleesdagen,
namelijk log reductie dag 1, log reductie dag 2, ... en tenslotte log reductie dag 10. De log
reductie werd niet toegepast bij het nagaan van een significante stijging/daling van het aantal
log kve/g van basilicum geïnoculeerd met E. coli O157 of Salmonella Thompson en
Typhimurium op het einde van de houdbaarheid ten opzichte van dag nul.
Als na het uitvoeren van een Kruskall-Wallistest test bleek dat er een significant verschil
aanwezig was, dan werd nagegaan waar dit verschil lag met behulp van de Mann-Whitney U.
Hiervoor werden de hypothesen twee aan twee met elkaar vergeleken en werd een bonferronicorrectie uitgevoerd. Hierbij werd het significantieniveau (0,05) gedeeld door het aantal
hypothesen. De besluiten werden genomen op basis van een 5 % significantieniveau en 95 %
betrouwbaarheid.
3.2.2 Bladgroenten: kropsla, jonge spinazie en baby leaves
3.2.2.1 Opkweek E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium
stammen
Het opkweken van de stammen werd eerder beschreven voor basilicum (3.2.1.1).
3.2.2.2 Inoculatie
De kropsla, jonge spinazie en baby leaves werden vers aangekocht bij een locale
handelaar/supermarkt te Gent. De stalen werden dezelfde dag (dag 0) verpakt en geïnoculeerd
waarbij drie herhalingen werden voorzien per combinatie van tijd en temperatuur. Bij de
kropsla werd de krop ontdaan van de buitenste bladeren, vuile en niet intacte delen.
Vervolgens werden bruikbare, niet beschadigde bladeren voorzichtig afgesneden aan de basis
met behulp van een scalpel. De kropsla werd verpakt in zakjes van 15 x 15 cm onder lucht en
een doorlaatbaarheid van 4600 ml O2/m² d atm (bij 7 °C). Voor spinazie en baby leaves
werden zakjes gemaakt uit een hoge barrière film van 18 x 18 cm met een doorlaatbaarheid
van 2,0 ml O2/m² d atm (bij 22 °C; Eural Pack, België). Dit werd gedaan omdat uit een test
bleek dat de verpakkingen van de kropsla een te grote daling van het zuurstofgehalte en een te
grote stijging van het koolstofdioxidegehalte tot gevolg hadden bij spinazie en baby leaves.
32
De bladgroenten werden niet gewassen voor de analyse. Per staal werd 25 g afgewogen en
geïnoculeerd met 100 µl van het gewassen inoculum. Daaropvolgend werden de verpakkingen
gesloten onder lucht en bewaard bij de aangegeven temperatuur (7 °C, 15 °C of 22 °C). Voor
kropsla werden de zakjes volledig dichtgemaakt, terwijl spinazie en baby leaves een
luchttunnel gemaakt werd zodat de O2/CO2-samenstelling niet te drastisch zou veranderen. De
verpakkingen werden opgevolgd gedurende drie dagen na inoculeren.
3.2.2.3 Microbiologische analyse
De microbiologische analyse van de stalen gebeurde op dezelfde manier zoals bij basilicum
(3.2.1.3). Voor spinazie en baby leaves werd gebruik gemaakt van resistente stammen voor
NA voor Salmonella Thompson en Typhimurium om de achtergrondmicrobiota te
onderdrukken, omdat tijdens een test vastgesteld werd dat de achtergrondflora het aflezen van
de XLD platen bemoeilijkte. Hiervoor werd dan ook gebruik gemaakt van XLD + NA (50
µg/ml). De (sub)cultivatie van de stammen vond plaats in BHI + NA.
3.2.2.4 Beoordeling van de visuele kwaliteit en bepaling O2/CO2-gehalte
De evaluatie van de visuele kwaliteit bestond hier slechts uit drie parameters, namelijk
bruinkleuring (1 - 5), versheid (1 - 5) en de algemene indruk (9 - 1). Bij bruinkleuring en
verscheid betekende een score van 1 dat er geen verandering plaatsvond ten opzichte van dag
0. De acceptatielimiet bedroeg 3 en bij een score van 5 was het product onacceptabel. Voor de
algemene indruk betekenden de scoren 9, 5 en 1 respectievelijk een onveranderd product, de
acceptatielimiet en een onacceptabel product. Bovendien werd van elk staal de O2/CO2concentratie bepaald met behulp van de PBI dansensor (Gullimex, België).
3.2.2.5 Dataverwerking
De verwerking van de data vond op dezelfde wijze plaats zoals beschreven voor basilicum
(zie 3.2.1.5). Het enige verschil was dat de onafhankelijke variabele tijd, bestond uit drie
klassen betreffende de drie bewaardagen.
33
4 Resultaten
In dit onderdeel worden de resultaten van de verschillende onderzoeken weergegeven en
besproken. De aantallen worden steeds uitgedrukt in log10 kve/g. Om rekening te houden met
de onzekerheid (0,5 log kve/g) van de microbiologische methoden, wordt slechts gesproken
van groei/afsterving vanaf een stijging/daling van ≥ 0,5 log kve/g (Sant'Ana et al., 2012).
4.1 Natuurlijke microbiële populatie aanwezig op basilicum
4.1.1 Analyse van basilicum op de aanwezigheid van E. coli, coliformen en
de pathogenen EHEC en Salmonella spp.
Binnen het kader van Veg-i-Trade werden 100 stalen basilicum geanalyseerd per land (België,
Cyprus en Israël). Daarvan werden er 21 afkomstig van Cyprus en 18 afkomstig van Israël
geanalyseerd gedurende deze thesis. Enkel hiervan worden de resultaten weergegeven (Figuur
8).
E. coli Cyprus
E. coli Israël
Coliformen Cyprus
Coliformen Israël
8
7
log kve/g
6
5
4
3
2
1
34
36
37
38
39
40
41
42
43
Tijd (weken)
Aantal stalen (n) per
3
3
3
3
0
0
3
3
3
meetmoment
2
2
2
2
2
2
2
2
2
n
3
3
3
3
0
0
3
3
3
coliformen
positief
voor
2
2
2
2
2
2
2
2
2
n positief voor E. coli
1
3
0
0
0
0
1
3
0
2
1
0
0
0
0
0
0
0
n PCR-positief voor
0
0
0
0
0
0
0
2
0
Salmonella spp.
0
0
0
0
0
0
0
0
0
n PCR-positief voor
0
0
0
0
0
0
0
0
0
EHEC
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Figuur 8: Analyse van basilicum afkomstig van Cyprus (blauw) en Israël (oranje) in de periode van 2 oktober 2013 (week
34) tot en met 4 december 2013 (week 43). Het aantal coliformen (log kve/g) wordt afgebeeld via een lijndiagram en het
aantal E. coli (log kve/g), indien aanwezig, door middel van een staafdiagram. De standaardafwijking wordt weergegeven
met behulp van foutbalken. Onderaan de figuur wordt via een tabel aangegeven hoeveel stalen geanalyseerd werden per
meetmoment, bij hoeveel er coliformen en E. coli aangetroffen werden en of er sprake was van PCR-positieve Salmonella of
EHEC. De detectielimiet bedraagt 1 log kve/g.
35
De coliformen waren steeds aanwezig binnen de grenzen van 3,5 en 6,5 log kve/g. E. coli
daarentegen, werd niet bij alle stalen gedetecteerd (Figuur 8). Bij stalen met een gehalte aan
E. coli boven de doelwaarde van 2 log kve/g en de tolerantiegrens van 3 log kve/g
(Uyttendaele, Jacxsens, De Loy-Hendrickx, Devlieghere, & Debevere, 2010), werd een goede
visuele kwaliteit waargenomen. Deze week niet noodzakelijk af van de andere stalen. Ook bij
stalen met een mindere visuele kwaliteit (bijvoorbeeld minder vers uitzicht), werden geen
hogere aantallen E. coli waargenomen.
In week 42 werd met de GeneDisc Cycler aangetoond dat twee van de drie basilicumstalen
afkomstig van Cyprus PCR-positief waren voor Salmonella spp. Deze PCR-positieve stalen
werden nadien bevestigd door het LFMFP labo met behulp van klassieke methoden. Hieruit
volgde dat beide stalen Salmonella bevatten, namelijk Salmonella species enterica subspecies
salamae. Voor de andere stalen werden geen positief resultaat bekomen Salmonella spp.
Er werd geen PCR-positief resultaat bekomen voor EHEC met behulp van de GeneDisc
Cycler omdat eae niet in combinatie met vtx-1 of vtx-2 werd gedetecteerd. Bij geen enkel staal
werden verocytotoxinen waargenomen, maar wel eae, namelijk in 12 van de 21 gevallen bij
Cyprus en 11 van de 18 bij Israël.
De prevalentie van de PCR-positieve pathogenen, werd bepaald op het totaal aantal
geanalyseerde stalen voor Cyprus (n = 21) en Israël (n = 18) volgens de Wilson-methode
(Wilson, 2013). De bovenste limiet ligt tamelijk hoog. Dit is te verklaren door het lage aantal
geanalyseerde stalen (Tabel 6).
Tabel 6: Prevalentie PCR-positieve Salmonella spp. en EHEC
Cyprus
Israël
Prevalentie PCR-positieve Salmonella spp.
9,52 %
0%
Onderste limiet (95 %)
2,65 %
0%
Bovenste limiet (95 %)
28,91 %
17,59 %
Prevalentie PCR-positieve EHEC
0%
0%
Onderste limiet (95 %)
0%
0%
Bovenste limiet (95 %)
15,46 %
17,59 %
4.1.2 Microbiële diversiteit aanwezig op basilicum
De diversiteit van de bacteriën werd onderzocht van twee soorten basilicum, namelijk
afkomstig uit België en Israël. Gedurende het onderzoek werd gewerkt met vijf verschillende
partijen, waarbij I en IV afkomstig waren van België en II, III en V van Israël (Tabel 4).
36
4.1.2.1 Optimalisatie staalvoorbereiding
Voorafgaand aan een onderzoek, dient er steeds een optimalisatie uitgevoerd te worden. Er
werden verschillende staalvoorbereidingen getest (wassen, stomacheren en directe extractie
van basilicum). Daarnaast werd de fractie cultiveerbare bacteriën bepaald na afwassen van de
platen. De stalen werden daarna onderworpen aan een DNA-extractie. Hiervoor werd gebruik
gemaakt van twee verschillende extractiemethoden (Fastprep en EasyMAG). De methode met
het beste resultaat werd dan uiteindelijk verkozen voor het nagaan van de evolutie van de
bacteriële diversiteit aanwezig op basilicum gedurende veertien dagen bij drie verschillende
temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C).
De minder relevante figuren worden weergegeven in bijlage 4 om een te omslachtig werk te
vermijden. Het belang van de merkers bij DGGE werd eerder besproken (zie 3.1.2.5). De
merkers werden genormaliseerd, want dit was nodig om stalen op verschillende gels te
vergelijken. Via een clusteranalyse werd aangetoond dat de merkers voor minstens 80 %
overeenstemden (bijlage 5, Figuur 26 en Figuur 27).
Er werden verschillende staalvoorbereidingen toegepast, namelijk wassen en stomacheren van
basilicum en de directe extractie van gesneden basilicumblaadjes. Daarnaast werd de fractie
cultiveerbare bacteriën bepaald na afwassen van de platen. Na de extractie van DNA werd een
controle uitgevoerd op gel (zie 3.1.2.3). In het begin was dit resultaat op gel weinig effectief
en als reden werd gedacht aan een te lage hoeveelheid aanwezig bacterieel DNA. Dit omdat
de positieve controle (pure cultuur van Salmonella of E. coli) wel een goed resultaat
opleverde na gelelektroforese. Daarom werd nadien gestart met meer staal en werd bovendien
een filtratie over een 0,22 µm filter toegepast om het bacteriële DNA te concentreren. De
filtratie had geen invloed op het resultaat op DGGE (Figuur 9). Ook de papieren voorfilter,
die zorgde voor een primaire filtratie vooraleer het waswater of de gestomacherde oplossing
werd gefiltreerd met de 0,22 µm filter, had geen invloed op het DGGE resultaat. Doch werd
deze voorfiltratie toegepast om verstopping van de 0,22 µm filter te voorkomen.
Na het toepassen van de grotere hoeveelheid staal en de filtratie (voorfilter + 0,22 µm filter)
werd een goed resultaat bekomen na gelektroforese van de DNA-extracten van de
gestomacherde basilicum, de afgewassen kolonies en de aanrijking van basilicum in BPW bij
37 °C. Voor de gewassen basilicum en de direct geëxtraheerde basilicum was dit steeds
negatief. Ook na het uitvoeren van een PCR was de gestomacherde basilicum veel effectiever
dan de gewassen variant. Bij deze laatste was de amplificatie na PCR zwakker in vergelijking
met gestomacherde basilicum. Mits de weinig belovende resultaten werd de gewassen
basilicum toch meegenomen bij de DGGE analyse. De direct geëxtraheerde basilicumblaadjes
werden niet meer meegenomen als potentiële monstervoorbereiding.
37
De gestomacherde en gewassen stalen bevatten een gemeenschappelijke, dominante band.
Doch heerst er een verschil (> 40 %) tussen beiden. Bovendien leverde het gebruik van
Tween®80 bij het wassen meer bandjes op in vergelijking zonder (Figuur 9). Om mogelijke
inhibitie tijdens de PCR te onderdrukken, werd naast het onverdunde staal meestal een
Pearson correlation [17.4%-97.2%]
DGGE biorad 16b
DGGE biorad 16b
tienvoudige verdunning en soms een honderdvoudige verdunning meegenomen. Verdunnen
100
90
80
70
60
van de stalen had geen invloed op de vingerafdrukken bij DGGE (zie bijlage 5, Figuur 28).
.
Basil
I wash
.
washing
without Tween + filtration
.
.
Basil
I wash
.
washing
+ filtration
.
.
Basil
I stomacher
.
stomachering
+ filtration with prefiltration
.
.
Basil
I stomacher
.
stomachering
+ filtration
.
.
Basil
I stomacher
.
stomachering
without filtration
.
Figuur 9: Optimalisatie van de staalvoorbereiding. De eerste vier stalen ondergingen een Fastprep extractie en het laatste
staal een extractie met behulp van de EasyMAG.
In het begin werd steeds geëxtraheerd met Fastprep omdat dit behoorde tot het
standaardprotocol van het Laboratorium voor microbiologische ecologie en technologie
(LabMet). Doch werd één staaltje getest met een andere extractiemethode, namelijk de
EasyMAG. De DNA-extracten waren niet zichtbaar op de agarosegel. Dit ging om een
gestomachered staaltje dat niet gefiltreerd werd, waardoor de bacteriën niet geconcentreerd
werden.
Bij
het
toepassen
van
Fastprep
extractie
op
dit
staal
met
dezelfde
staalvoorbereidingen, maar dan gevolgd door een filtratiestap, werd een zwak resultaat
waargenomen op gel. Na PCR was er wel sprake van een amplificatie, maar deze was minder
uitgesproken dan na de extractie met Fastprep. Op DGGE was het resultaat na extractie met
EasyMAG voor maar liefst 99 % gelijk met de Fastprep (zie laan 4 en 5 in Figuur 9).
Daaropvolgend werden de verschillende staalvoorbereidingen getest met EasyMAG en
Fastprep, waarvan het resultaat nadien werd vergeleken op DGGE. Opnieuw waren de
amplificaties
na PCR
veel
voor de EasyMAG extracten in vergelijking met deze na
DGGE biorad 16b
DGGE
bioradzwakker
16b
Pearson correlation [17.4%-97.2%]
een Fastprep extractie. Na extractie met de EasyMAG was de opbrengst lager, maar dit
100
50
0
-50
leverde de zuiverste resultaten op.
.
Basil
III wash
fastprep
.
.
Basil
III colonies TSA
easymag
.
.
Basil
III colonies VRBL
easymag
.
.
Basil
III colonies XLD
easymag
.
.
Basil
III colonies XLD
fastprep
.
.
Basil
III colonies TSA
fastprep
.
.
Basil
III colonies VRBL
fastprep
.
.
Basil
III stomacher
fastprep
.
.
Basil
III stomacher
easymag
.
.
Basil
I stomacher
easymag
.
.
Basil
I stomacher
fastprep
.
.
Basil
III wash
easymag
.
Figuur 10: Vergelijking van twee extractiemethoden (Fastprep en EasyMAG) voor gefiltreerde gewassen en gestomacherde
basilicum en na afwassen van de kolonies op TSA, VRBL en XLD.
38
Er werd geen verschil waargenomen tussen de Fastprep en EasyMAG voor gestomacherde,
gefiltreerde basilicum en voor de kolonies op TSA, XLD en VRBL. Gewassen basilicum
werd afzonderlijk geclusterd voor de beide extractiemethoden. De differentie was vooral
gelegen ter hoogte van de dominante band. Met behulp van de EasyMAG lag de dominante
band ter hoogte van deze na stomacheren. Indien gebruik gemaakt werd van de FastPrep,
stemde het patroon bekomen voor de gewassen basilicum meer overeen met dat van de
afgewassen kolonies (Figuur 10).
Na deze optimalisatie van de monstervoorbereiding werd bepaald welke methode gebruikt
zou worden voor het nagaan van de evolutie van de natuurlijke microbiota aanwezig op
basilicum bewaard bij drie temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) gedurende veertien dagen. De
voorkeur ging uit naar gewassen basilicum met Tween®80 omdat een meer divers resultaat
bekomen werd met DGGE in tegenstelling tot de gestomacherde. Vervolgens werd ook
gefiltreerd over een 0,22 µm filter in combinatie met een voorfilter om het bacterieel DNA te
concentreren. Tenslotte werd gekozen voor de EasyMAG omdat de geëxtraheerde staaltjes
zuiverder
waren.
Deze
extractiemethode
was
bovendien
meer
betrouwbaar
en
gebruiksvriendelijker, nam veel minder tijd in beslag en gebeurde voor het grootste deel
automatisch.
4.1.2.2 Natuurlijke microbiële gemeenschap
4.1.2.2.1
Uitplatingen
Het aeroob mesofiel kiemgetal bedroeg voor basilicum afkomstig van België gemiddeld 5,4 ±
0,6 log kve/g en van Israël gemiddeld 6,3 ± 0,3 log kve/g. Bij partij II en III werd ook de
aanwezigheid van Salmonella spp. en de hoeveelheid coliformen nagegaan. Hieruit volgde dat
de coliformen een groot deel van het totaal aeroob mesofiel kiemgetal bepalen. Bovendien
werd Salmonella spp. niet teruggevonden op XLD (Tabel 7).
Tabel 7: Resultaten uitplatingen van de verschillende basilicumpartijen.
Basilicumpartij
Herkomst
TSA
XLD
VRBL
log kve/g
log kve/g
log kve/g
I
België
5,8
-
-
II
Israël
6,1
0,0
5,6
III
Israël
6,1
0,0
5,3
IV
België
5,0
-
-
V
Israël
6,7
-
-
39
4.1.2.2.2
DGGE
De basilicumpartijen I, II en III stemmen voor ongeveer 70 % overeen. Er werd een grotere
diversiteit van de
bandjes
waargenomen bij de gewassen basilicum met Tween®80 in
DGGE
biorad 16b
Pearson correlation [17.4%-97.2%]
DGGE biorad 16b
100
80
60
40
vergelijking met de gestomacherde (Figuur 11).
.
Basil
I stomacher
.
.
Basil
III stomacher
.
.
Basil
II stomacher
.
.
Basil
I wash
.
.
Basil
III wash
.
Figuur 11: Natuurlijke microbiota op basilicum I, II, III na wassen met Tween ®80 en/of stomacheren
4.1.2.2.3
NGS
Het doel van de sequencing was het karakteriseren van de natuurlijke microbiota op basilicum
I, II en III na wassen met Tween®80 of stomacheren, na een aanrijking in BPW bij 37 °C en
na het afwassen van de kolonies op TSA, XLD en VRBL.
Het aandeel aan eukaryoten was bij de staaltjes groter dan de hoeveelheid bacteriën en
varieerde van 55,35 % tot 98,56 % bij gewassen en gestomacherde basilicum (Tabel 8).
Bovendien was de opbrengt van de bacteriën hoger bij gewassen basilicum in tegenstelling tot
de gestomacherde, namelijk de opbrengst van bacteriën bij partij I en partij III was
respectievelijk 5,2 keer en 3,7 keer hoger na wassen (Tabel 8). De hoeveelheid bacteriën werd
opnieuw geschaald op 100 %, want dit maakte het mogelijk om de staaltjes onderling te
vergelijken.
Na stomacheren, bestonden de bacteriën voornamelijk (van 71,13 % tot 85,69 %) uit een
dominante groep, namelijk Novosphingobium spp. Bij gewassen basilicum was dit genus in
een veel mindere mate aanwezig (van 4,30 % tot 8,56 %). Bovendien was er een verschil
aanwezig tussen de gewassen basilicum I (België) en III (Israël). Bij Belgische basilicum was
voornamelijk Pseudomonas (39,67 %) aanwezig, gevolgd door Enterobacter (15,27 %),
Klebsiella (11,19 %) en Pantoea (6,03%). Bij de Israëlische variant was dit vooral
Sphingobacterium (55,97 %) en Flavobacterium (10,87 %). De staalvoorbereiding had dus
een grote impact op de aanwezige bacteriën in het waswater of de BPW/PPS na stomacheren.
Via de monstervoorbereiding werd dus al een eerste selectie gemaakt van de aanwezige
bacteriën (Tabel 8).
Na cultivatie op TSA, XLD en VRBL werd geen eukaryoot DNA meer teruggevonden en was
er dus sprake van een bacteriële DNA opbrengst van meer dan 91,86 %. Bovendien werd de
dominante groep Novosphingobium spp. niet meer teruggevonden. Bij basilicum afkomstig
40
van Israël (partij II en III) bestond de bacteriepopulatie op zowel TSA, XLD en VRBL uit
meer dan 97 % Gammaproteobacteria. De Belgische basilicum I bevatte naast 83,25 %
Gammaproteobacteria ook 12,45 % Actinobacteria. Bij basilicum I bestond de
Gammaproteobacteria
voornamelijk
uit
Acinetobacter
(45,01
%)
gevolgd
door
Enterobacteriaceae (22,68 %) op TSA. Basilicum II (Israël) bevatte meer dan 84,02 %
Enterobacteriaceae op zowel TSA, XLD als VRBL. Bij basilicum III (Israël) was dit aandeel
veel lager, met uitzondering van de kolonies op VRBL (36,32 %). Partij III vertoont vooral (>
31,23 %) Aeromonas op zowel TSA, XLD als VRBL (Tabel 9).
Pearson correlation [17.4%-97.2%]
16b
DGGE biorad
16bafgewassen kolonies van de drie basilicumbatchen I, II en
OokDGGE
na biorad
DGGE
wordt gezien
dat de
100
50
0
III een afzonderlijke cluster vormen (Figuur 12).
.
Basil
III colonies TSA
.
.
Basil
III colonies VRBL
.
.
Basil
III colonies XLD
.
.
Basil
I colonies TSA
.
.
Basil
II colonies XLD
.
.
Basil
II colonies VRBL
.
.
Basil
II colonies TSA
.
Figuur 12: Resultaat afgewassen kolonies van basilicumpartijen I, II een III op TSA, XLD en VRBL. Alle stalen
ondergingen een Fastprep extractie.
41
Tabel 8: Resultaten na 16S rRNA sequencing van gewassen en/of gestomacherde basilicumstalen I, II en III. Het resultaat wordt weergegeven in de tabel vanaf een
concentratie van 1 %. Het aandeel aan bacteriën wordt opnieuw op 100 % geschaald. De dominante groepen worden per staal in het vet gedrukt.
Staal
Totaal aantal gelezen sequenties
Gemiddelde lengte fragmenten (bp)
Niet toegewezen
Eukaryoten
Bacteriën (op 100 % gebracht)
Bacteroidetes
Arcicella
Chryseobacterium
Flavobacterium
Sphingobacterium
Bacilli
Alphaproteobacteria
Altererythrobacter
Novosphingobium
Sphingobium
Sphingomonas
Betaproteobacteria
Oxalobacteraceae
Herbaspirillum
Gammaproteobacteria
Rheinheimera
Acinetobacter
Pseudomonas
Enterobacteriaceae
Enterobacter
Erwinia
Klebsiella
Kluyvera
Pantoea
Rahnella
Raoultella
Basilicum I
(stomacher)
Basilicum I
(wassen)
Basilicum II
(stomacher)
Basilicum III
(stomacher)
Basilicum III
(wassen)
36887
473
0,08%
91,66%
8,27%
0,47%
40630
474
1,71%
55,35%
42,94%
0,62%
33794
473
0,15%
83,57%
16,28%
0,09%
64772
473
0,03%
98,56%
1,41%
1,21%
10772
473
0,06%
94,70%
5,24%
74,15%
1,25%
4,63%
10,87%
55,97%
1,60%
16,76%
1,78%
8,56%
1,07%
1,96%
0,17%
0,55%
87,09%
0,39%
4,66%
0,31%
83,35%
71,46%
85,69%
4,30%
81,46%
71,13%
1,04%
0,40%
0,17%
10,27%
6,12%
4,64%
4,02%
87,68%
0,64%
0,35%
0,15%
0,99%
0,30%
1,40%
7,66%
4,23%
39,67%
43,43%
15,27%
0,42%
11,19%
1,21%
6,03%
4,17%
2,38%
0,97%
2,94%
1,74%
15,77%
0,09%
3,59%
11,42%
1,63%
2,14%
0,66%
0,11%
6,42%
25,80%
1,43%
17,56%
4,50%
1,65%
5,35%
4,99%
Tabel 9: Resultaten na 16S rRNA sequencing van kolonies op TSA, XLD en VRBL. Het resultaat wordt weergegeven in de tabel vanaf een concentratie van 1 %. Het aandeel aan bacteriën
wordt opnieuw op 100 % geschaald. De dominante groepen worden per staal in het vet gedrukt.
Staal
Totaal aantal gelezen sequenties
Gemiddelde lengte fragmenten (bp)
Niet toegewezen
Eukaryoten
Bacteriën (op 100 % gebracht)
Actinobacteria
Arthrobacter
Kocuria
unclassified Actinobacteria
Bacteroidetes
Chryseobacterium
Betaproteobacteria
Comamonas
Gammaproteobacteria
Aeromonas
Alishewanella
Shewanella
Rheinheimera
Acinetobacter
Pseudomonas
Pseudomonas aeruginosa groep
Stenotrophomonas
Enterobacteriaceae
Aranicola
Citrobacter
Enterobacter
Erwinia
Klebsiella
Kluyvera
Pantoea
Pectobacterium
Raoultella
Basilicum I
TSA kolonies
Basilicum II
TSA kolonies
Basilicum III
TSA kolonies
13533
503
2,21%
47182
502
8,14%
39389
496
0,96%
23566
500
0,49%
97,79%
12,45%
7,84%
2,08%
2,10%
3,97%
3,48%
91,86%
99,04%
99,51%
0,05%
0,10%
83,25%
99,94%
45,01%
14,22%
0,06%
0,75%
22,68%
15,80%
3,14%
0,03%
84,02%
0,06%
5,46%
5,50%
4,31%
0,62%
3,49%
0,21%
1,58%
5,32%
13,33%
0,01%
0,60%
61,24%
3,35%
2,52%
2,46%
97,26%
37,73%
5,98%
0,22%
12,84%
16,70%
13,42%
0,57%
9,62%
0,20%
0,03%
0,85%
0,03%
0,02%
1,07%
6,68%
Basilicum II
Basilicum III
VRBL kolonies VRBL kolonies
99,94%
0,07%
6,12%
0,62%
1,46%
91,74%
0,02%
1,17%
11,29%
28,05%
5,14%
4,24%
41,10%
Basilicum II
XLD kolonies
Basilicum III
XLD kolonies
38841
496
1,83%
40201
499
0,56%
31964
503
0,62%
98,17%
99,44%
99,38%
2,31%
2,25%
97,67%
31,23%
0,06%
0,59%
0,12%
6,23%
22,97%
0,23%
36,32%
2,24%
0,49%
15,95%
0,06%
6,62%
0,06%
7,06%
0,41%
0,03%
99,98%
1,40%
98,56%
1,65%
11,02%
28,32%
6,41%
5,53%
44,56%
0,12%
0,12%
99,87%
36,41%
0,05%
1,36%
0,09%
0,18%
54,97%
0,23%
6,73%
0,31%
0,11%
2,97%
0,02%
0,16%
1,03%
0,11%
4.1.2.3 Evolutie bacteriële diversiteit
4.1.2.3.1
Gedurende een aanrijking in BPW bij 37 °C
De evolutie van de bacteriële diversiteit werd nagegaan van gestomacherde basilicum na een
aanrijking in BPW bij 37 °C. De verhouding bacterieel DNA ten opzichte van eukaryoot
DNA steeg naargelang de aanrijking vorderde. Bij basilicum II, werd bij het startpunt, na 5
uur aanrijken en na 28 uur aanrijken respectievelijk 83,57 %, 47,72 % en 0 % eukaryoot DNA
teruggevonden. Voor basilicum I werd geen eukaryoot DNA meer gevonden na drie dagen
bewaren ten opzichte van het startpunt (91,66 %).
Na vijf uur bewaren van de aanrijking in BPW bij 37 °C, was de vingerafdruk nog voor 90 %
gelijk met deze van tijdstip nul. Op het startpunt en na 5 uur aanrijken werd een
gemeenschappelijke dominante band waargenomen op dezelfde hoogte. Als de aanrijking
echter langer werd bewaard (20,5 uur of 28 uur), dan daalde de intensiteit van de dominante
Pearson correlation [17.4%-97.2%]
band
en 16b
steeg deDGGE
diversiteit
van het patroon. Bovendien was de dominante band volledig
DGGE biorad
biorad 16b
verdwenen na drie dagen. Hiermee werd aangetoond dat de dominante groep niet groeide
100
50
0
tijdens een aanrijking van gestomacherde basilicum in BPW bij 37 °C (Figuur 13).
.
Basil
II enrichment in BPW at 37°C for 28 h
.
1
.
Basil
II enrichment in BPW at 37°C for 20.5 h
.
2
.
Basil
I enrichment in BPW at 37°C for 3 days
.
3
.
Basil
II enrichment in BPW at 37°C for 5 h
.
4
.
Basil
II stomacher
.
5
.
Basil
I stomacher
.
6
Figuur 13: Gestomacherde basilicum I en II en hun aanrijking in BPW bij 37 °C na 5 uur, 20,5 uur en 28 uur voor basilicum
II en na drie dagen voor basilicum I. Alle stalen ondergingen een DNA-extractie met behulp van de Fastprep.
Net na stomacheren werd vooral Novosphingobium spp. teruggevonden als microbiota. Dit
was voor basilicum I en II respectievelijk 85,69 % en 81,46 % (Tabel 8). Dit genus was nog
slechts voor 4,95 % aanwezig na 5 uur aanrijken in BPW bij 37 °C en volledig verdwenen
indien meer dan 28 uur werd aangerijkt (Tabel 10). Novosphingobium spp. was dus niet in
staat om te groeien tijdens de aanrijking in BPW bij 37 °C. Na vijf uur aanrijken bestond de
populatie voornamelijk (94,09 %) uit Enterobacteriaceae. Dit aandeel daalde na 28 uur (54,52
%) en nog meer na drie dagen (34,26 %) bewaren in BPW bij 37 °C (Tabel 10). Bovendien
werd na 28 uur ook Pseudomonas (37,22 %) aangetroffen. Dit was niet zo na de aanrijking
van drie dagen bij basilicum I. Daar bestond de populatie naast de Enterobacteriaceae ook uit
Bacteroides (41,67 %).
44
Tabel 10: Resultaten na 16S rRNA sequencing van basilicumaanrijkingen van partij I en II in BPW bij 37 °C. Het resultaat
wordt weergegeven in de tabel vanaf een concentratie van 1 %. Het aandeel aan bacteriën wordt opnieuw op 100 %
geschaald. De dominante groepen worden per staal in het vet gedrukt.
Staal
Totaal aantal gelezen sequenties
Gemiddelde lengte fragmenten (bp)
Niet toegewezen
Eukaryoten
Bacteriën (op 100 % gebracht)
Actinobacteria
Arthrobacter
Kocuria
unclassified Actinobacteria
Bacteroidetes
Bacteroides
Macellibacteroides
Parabacteroides
Clostridia
Clostridium
Alphaproteobacteria
Novosphingobium
Betaproteobacteria
Comamonas
Gammaproteobacteria
Aeromonas
Acinetobacter
Pseudomonas
Pseudomonas aeruginosa groep
Stenotrophomonas
Enterobacteriaceae
Aranicola
Cedecea
Citrobacter
Enterobacter
Erwinia
Klebsiella
Kluyvera
Pantoea
Pectobacterium
Raoultella
Basilicum II
Basilicum II
Basilicum I
aanrijking in BPW aanrijking in BPW aanrijking in BPW
(5 uur, 37 °C)
(28 uur, 37 °C)
(3 dagen, 37 °C)
29757
494
6,67%
47,72%
45,61%
36872
500
6,22%
42705
509
4,28%
93,77%
95,71%
0,02%
0,64%
0,03%
55,13%
41,67%
2,69%
10,77%
6,03%
5,48%
5,14%
4,95%
94,81%
0,61%
94,09%
0,48%
10,44%
9,79%
1,43%
1,01%
69,61%
0,36%
5,72%
5,05%
93,18%
0,02%
0,86%
37,22%
6,34%
0,29%
54,52%
0,09%
2,13%
1,13%
14,61%
4,91%
7,22%
1,28%
20,77%
0,25%
38,44%
0,01%
3,60%
0,38%
34,26%
0,11%
0,03%
17,18%
8,39%
3,06%
0,18%
2,00%
0,99%
45
4.1.2.3.2
Gedurende veertien dagen bewaring bij drie temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C)
Het doel van deze studie was om de evolutie van de bacteriële diversiteit op te volgen
gedurende veertien dagen van basilicum bewaard bij drie verschillende temperaturen (7 °C,
15 °C en 22 °C).
Basilicum IV (België)
15 °C
22 °C
10
9
8
7
6
5
4
3
2
7 °C
log kve/g
log kve/g
7 °C
Basilicum V (Israël)
0
4
7
11
15 °C
10
9
8
7
6
5
4
3
2
14
0
4
Tijd (dagen)
7 °C
15 °C
7
11
14
Tijd (dagen)
22 °C
7 °C
9
8
8
7
7
6
6
score (9 -1)
score (9 -1)
9
22 °C
5
4
15 °C
22 °C
7
11
5
4
3
3
2
2
1
1
0
4
7
11
Tijd (dagen)
14
0
4
14
Tijd (dagen)
Figuur 14: Opvolgen van het aeroob mesofiel kiemgetal (boven) en de algemene visuele kwaliteit (onder) op basiliucm IV
(links) en basilicum V (rechts) gedurende veertien dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De
detectielimiet voor de opvolging van het kiemgetal bedraagt 2 log kve/g. De acceptatielimiet (5) van de algemene visuele
kwaliteit wordt weergegeven als stippenlijn in de grafiek. Score 9 en 1 betekenen respectievelijk een acceptabel en een
onacceptabel staal.
De diversiteit van de bacteriën was afhankelijk van de temperatuur en de tijd. Het aantal
bandjes nam toe bij het verhogen van de temperatuur en het verlengen van de bewaarduur
(Figuur 15). Met behulp van een eerste cluster werden twee groepen gevormd, namelijk stalen
die nog acceptabel waren voor consumptie en stalen waar bederf opgemerkt werd (Figuur 15).
Hierop waren er echter twee uitzonderingen (V 22°C 14d en IV 15 °C 7d), maar deze hadden
een score voor de visuele kwaliteit die net op de acceptatielimiet van 5 lag (Figuur 14).
46
Daarnaast was er een duidelijk verschil aanwezig tussen de twee basilicumpartijen. Bij
basilicum IV werd de acceptatielimiet al bereikt na zeven dagen bij 15 °C en 22 °C. Voor
basilicum V werd dit pas bereikt na veertien dagen bij 22 °C. De mindere algemene visuele
kwaliteit van de Belgische basilicum was vooral te wijten aan bederf en een daling van de
versheid. Na veertien dagen was er sprake van schimmelgroei bij 15 °C op partij IV.
Bovendien steeg ook het aeroob mesofiel kiemgetal in een grotere mate bij basilicum IV in
vergelijking met basilicum V. Er werd voor partij IV een stijging van respectievelijk 3,5 log
kve/g, 4,5 log kve/g en 4,2 log kve/g waargenomen na veertien dagen bewaren bij 7 °C, 15 °C
en 22 °C. Voor basilicum V was de stijging van het aantal het hoogst bij 22 °C (3,3 log
kve/g), gevolgd door 15 °C (2,2 log kve/g) en 7 °C (1,8 log kve/g) na veertien dagen ten
Pearson correlation [17.4%-97.2%]
DGGE biorad 16b
opzichte
van dagDGGE
nul biorad
(Figuur
16b 14). Beiden partijen werden afzonderlijk geclusterd bij DGGE,
mits twee uitzonderingen (IV 7 °C 14d en IV 15 °C 7 d) die meer leken op basilicum V
100
50
0
(Figuur 15).
. 7°C 14d
V
.
Acceptable
for consumption
. 22°C 11d
V
.
Acceptable
for consumption
. 22°C 14d
V
.
Spoiled
. 15°C 11d
V
.
Acceptable
for consumption
. 22°C 7d
V
.
Acceptable
for consumption
. 7°C 11d
V
.
Acceptable
for consumption
. 7°C 7d
V
.
Acceptable
for consumption
. 15°C 7d
V
.
Acceptable
for consumption
. 7°C 4d
V
.
Acceptable
for consumption
. 15°C 14d
V
.
Acceptable
for consumption
.
V
.
Acceptable
for consumption
. 22°C 4d
V
.
Acceptable
for consumption
. 7°C 14d
IV
.
Acceptable
for consumption
. 15°C 7d
IV
.
Spoiled
.
IV
.
Acceptable
for consumption
. 7°C 7d
IV
.
Acceptable
for consumption
. 7°C 11d
IV
.
Acceptable
for consumption
. 7°C 4d
IV
.
Acceptable
for consumption
. 22°C 4d
IV
.
Acceptable
for consumption
. 15°C 4d
IV
.
Acceptable
for consumption
. 22°C 7d
IV
.
Spoiled
. 15°C 14d
IV
.
Spoiled
. 22°C 14d
IV
.
Spoiled
. 15°C 11d
IV
.
Spoiled
. 22°C 11d
IV
.
Spoiled
Figuur 15: Resultaat DGGE van basilicum IV en V gedurende veertien dagen bewaren bij drie verschillende temperaturen (7
°C, 15 °C en 22 °C). Er wordt gesproken van bederf indien een score van 5 of minder werd bekomen voor de algemene
visuele kwaliteit. Er ontbreekt één staal, namelijk V 15 °C 4d.
De staaltjes van partij IV en V vertoonden een dominante band. Deze verminderden in
intensiteit indien basilicum IV 11 dagen bij 15 °C of 22 °C bewaard werd en wanneer
basilicum V bewaard werd gedurende 14 dagen bij 7 °C of 11 dagen bij 22 °C (Figuur 15).
47
4.2 Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en
Typhimurium
4.2.1 Basilicum
4.2.1.1 Visuele kwaliteit
Voorafgaand aan de analyse werd de aanwezigheid van schimmels steeds nagegaan op
basilicum. Indien een kleine schimmel waargenomen werd op één van de blaadjes, werd het
staal nog meegenomen in de overlevingsstudie. Als het product onaanvaardbaar was door
bijvoorbeeld volledige overwoekering met schimmels of bederf, werd het schaaltje uit de
studie gelaten en niet meer geanalyseerd. Hiervoor werd uitgegaan van het gedrag van de
consument, met andere woorden het ergste scenario. De overlevingsstudie werd na acht dagen
stopgezet bij gebrek aan acceptabele basilicum (= einde van de houdbaarheid).
7 °C
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=2
15°C
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=4
22 °C
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=6
n=2
n=0
9
8
Score (9-1)
7
6
5
7 °C
4
15 °C
22 °C
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tijd (dagen)
Figuur 16: Algemene visuele kwaliteit van basilicum geïnoculeerd met E. coli O157 (n = 3) of met Salmonella Thompson en
Typhimurium (n = 3) gedurende acht dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De acceptatielimiet
(5) wordt weergegeven als stippenlijn in de grafiek. Score 9 en 1 betekenen respectievelijk een acceptabel en een
onacceptabel staal. Bovenaan de figuur wordt het aantal geanalyseerde acceptabele stalen weergegeven voor elke temperatuur
afzonderlijk.
Figuur 16 geeft de algemene visuele kwaliteit weer gedurende de overlevingsstudie van de
basilicumstalen geïnoculeerd met E. coli O157 of met Salmonella Thompson en
Typhimurium en bewaard bij 7 °C, 15 °C of 22 °C. Het gaat hierbij om de visuele kwaliteit
van de acceptabele stalen. Met andere woorden, van de stalen die meegenomen werden in de
overlevingsstudie. In het algemeen trad schimmelvorming het eerst op na twee dagen bewaren
bij 22 °C, na drie dagen bij 15 °C en na zes dagen bij 7 °C.
48
Tabel 11: Frequentietabel van de belangrijkste parameters van de visuele kwaliteit van basilicum geïnoculeerd met E. coli O157 (n = 3) of met Salmonella Thompson en Typhimurium (n = 3)
gedurende acht dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De acceptatielimiet bedraagt 3 voor de eerste vier parameters en 5 voor de algemene kwaliteit. Een score van 1
en 5 voor de eerste vier parameters en van 9 en 1 voor de algemene visuele kwaliteit betekenen respectievelijk acceptabel en onacceptabel staal.
T (in °C)
7
15
22
Dag
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
1
6
1
1
2
0
0
0
0
0
6
5
3
0
2
0
0
3
3
6
6
6
5
1
1
0
koudeschade
1,5 2 2,5 3
0 0 0 0
5 0 0 0
5 0 0 0
4 0 0 0
2 4 0 0
2 4 0 0
1 1 2 2
2 2 1 1
2 0 0 0
0 0 0 0
1 0 0 0
2 1 0 0
3 3 0 0
3 1 0 0
5 0 0 0
5 0 0 1
1 0 0 0
2 1 0 0
0 0 0 0
0 0 0 0
0 0 0 0
1 0 0 0
3 1 1 0
0 1 0 0
0 0 0 0
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
6
6
6
4
3
2
0
0
0
6
6
2
6
6
0
1
0
6
5
2
6
6
0
2
0
bederf
1,5 2 2,5
0 0 0
0 0 0
0 0 0
2 0 0
0 3 0
3 1 0
2 4 0
4 2 0
2 0 0
0 0 0
0 0 0
3 1 0
0 0 0
0 0 0
4 1 0
4 1 0
4 0 0
0 0 0
1 0 0
1 2 1
0 0 0
0 0 0
5 1 0
0 0 0
0 0 0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
parameters
geelverkleuring
1 1,5 2 2,5 3 1 1,5
6 0 0 0 0 6 0
4 2 0 0 0 0 6
5 1 0 0 0 0 4
2 4 0 0 0 0 2
6 0 0 0 0 0 3
2 4 0 0 0 0 1
0 6 0 0 0 0 2
1 5 0 0 0 0 2
1 1 0 0 0 0 0
3 3 0 0 0 0 6
2 4 0 0 0 0 2
2 4 0 0 0 0 1
3 3 0 0 0 0 2
0 4 2 0 0 1 2
0 6 0 0 0 0 1
0 4 2 0 0 0 0
2 2 0 0 0 0 0
5 1 0 0 0 0 5
4 2 0 0 0 0 1
0 6 0 0 0 0 3
1 5 0 0 0 0 6
0 4 2 0 0 0 5
0 6 0 0 0 0 0
0 0 2 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0
versheid
2 2,5
0 0
0 0
2 0
4 0
3 0
3 2
4 0
3 0
2 0
0 0
4 0
2 1
2 1
3 0
4 1
0 1
0 1
1 0
5 0
3 0
0 0
1 0
5 1
2 0
0 0
n
algemene kwaliteit
3 3,5 9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5
0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 6
0 0 0 5 1 0 0 0 0 0 0 6
0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 6
0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 6
0 0 0 0 3 2 1 0 0 0 0 6
0 0 0 1 0 0 2 2 1 0 0 6
0 0 0 0 0 1 0 0 3 1 1 6
1 0 0 0 0 0 0 1 4 0 1 6
0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2
0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 6
0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 6
1 1 0 0 2 0 1 0 1 2 0 6
1 0 0 0 0 1 1 2 1 0 1 6
0 0 0 0 1 2 1 2 0 0 0 6
0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 3 6
5 0 0 0 0 0 0 0 0 1 5 6
3 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 4
0 0 0 5 0 1 0 0 0 0 0 6
0 0 0 0 0 5 1 0 0 0 0 6
0 0 0 0 2 1 2 0 0 0 1 6
0 0 0 0 5 1 0 0 0 0 0 6
0 0 0 0 1 4 1 0 0 0 0 6
0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 6
0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Er werd een dalende trend waargenomen van de visuele kwaliteit (Figuur 16). In deze figuur
werd enkel de algemene visuele kwaliteit weergegeven, terwijl er steeds acht parameters
beoordeeld werden per staal. Tabel 11 geeft de frequentie weer van de toegekende score van
de belangrijkste parameters bij de visuele evaluatie van basilicum. Dit gaat om koudeschade,
bederf, geelverkleuring en tenslotte versheid. De andere parameters (proper snijoppervlak,
gekreukte blaadjes en zwartkleuring aan de top van de basilicum) bepaalden in mindere mate
de algemene visuele kwaliteit, want deze kwamen beperkt voor of veranderden niet veel
gedurende de overlevingsstudie.
Bij dag 1 en 2 werden geen merkwaardige veranderingen in de kwaliteit waargenomen. De
acceptatielimiet voor de algemene visuele kwaliteit werd het eerst bereikt bij 22 °C, gevolgd
door 15 °C en tenslotte 7 °C na respectievelijk drie, vier en zes dagen. De oorzaak van de
daling van de algemene visuele kwaliteit verschilde naargelang de bewaartemperatuur. Bij 7
°C was deze daling voornamelijk te wijten aan koudeschade, bederf en dus een daling van de
versheid. Bij 15 °C en 22 °C ging dit eerder om bederf en een daling van de versheid. Zoals
eerder vermeld, werd de visuele kwaliteit van de stalen dagelijks gecontroleerd.
Onaanvaardbare stalen werden uit de studie gelaten vanaf twee dagen voor 22 °C, zes dagen
voor 15 °C en acht dagen voor 7 °C.
De overlevingsstudie stopte na zeven dagen voor 22 °C, voornamelijk door overwoekering
van schimmels. Bij 15 °C was de kwaliteit onacceptabel door schimmels en bederf, waardoor
de overlevingsstudie slechts tot dag acht kon doorgaan. Bij 7 °C werden schimmels het minst
vastgesteld, maar na acht dagen was de kwaliteit ook niet meer acceptabel bij deze laagste
bewaartemperatuur. Dit had vooral als oorzaak het uitdrogen van de basilicum en het optreden
van bederf.
4.2.1.2 Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium
Het doel was de overleving op te volgen gedurende tien dagen, maar de houdbaarheid
(bepaald via de visuele kwaliteit) van de basilicum werd beperkt tot zeven dagen bij 22 °C en
tot acht dagen bij 7 °C en 15 °C. Het gewassen inoculum van E. coli O157 bedroeg 5,7 x 107
kve/ml waaruit de verwachte waarde (2,28 x 105 kve/g) op dag nul kon berekend worden.
Voor Salmonella Thompson en Typhimurium bedroeg dit gewassen inoculum 1,1 x 108
kve/ml en werd 4,4 x 105 kve/g basilicum bekomen als geschatte waarde op dag nul. Deze
waarden sluiten aan bij de theoretische van 104 - 105 log kve/g basilicum.
Figuur 17 en Figuur 18 geven respectievelijk de overleving van E. coli O157 en Salmonella
Thompson en Typhimurium weer geïnoculeerd op basilicum. Het aeroob mesofiel kiemgetal
aanwezig op niet geïnoculeerde basilicum, bedroeg gemiddeld 5,1 ± 0,7 log kve/g op dag nul.
50
7 °C
8
15 °C
22 °C
7
log kve/g
6
5
4
3
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tijd (dagen)
Figuur 17: Overleving van E. coli O157 (n = 3) op basilicum gedurende acht dagen bij drie verschillende
temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De standaardafwijking wordt weergegeven met behulp van foutbalken.
Kruis = er is één herhaling te kort op dag zeven bij 22 °C. Vierkant = er zijn twee herhalingen te kort op dag
acht bij 15 °C.
7 °C
8
15 °C
22 °C
7
log kve/g
6
5
4
3
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tijd (dagen)
Figuur 18: Overleving van Salmonella Thompson en Typhimurium (n = 3) op basilicum gedurende acht
dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De standaardafwijking wordt weergegeven
met behulp van foutbalken. Kruis = er is één herhaling te kort op dag acht bij 7°C.
De bespreking van de resultaten bestaat uit twee verschillende onderdelen. Allereerst werd
nagegaan of er sprake was van een stijging/daling (≥ 0,5 log kve/g) van E. coli O157 of
Salmonella Thompson en Typhimurium op het einde van de houdbaarheid ten opzichte van
het startpunt (dag 0) na bewaren bij 7 °C, 15 °C of 22 °C. Bovendien werd nagegaan of deze
stijging/daling significant was.
51
Op het einde van de houdbaarheid werd een daling waargenomen van het aantal log kve/g E.
coli O157 bij basilicum bewaard bij 7 °C (1,2 log kve/g) en bewaard bij 15 °C (1,4 log kve/g).
Bij 22 °C werd geen stijging/daling (< 0,5 log kve/g) opgemerkt (Figuur 17). De daling van
het aantal log kve/g van E. coli O157 op basilicum bewaard bij 7 °C was significant (p =
0,046). Bij basilicum geïnoculeerd met E. coli O157 en bewaard bij 15 °C (p = 0,157) of 22
°C (p = 0,761) werd geen significant verschil waargenomen tussen het aantal log kve/g op het
einde van de houdbaarheid in vergelijking met dag nul.
Voor Salmonella Thompson en Typhimurium werd op het einde van de houdbaarheid een
stijging (0,7 log kve/g) bij basilicum bewaard bij 22 °C en een daling (0,7 log kve/g) bij
basilicum bewaard bij 7 °C waargenomen ten opzichte van dag nul. De stalen bij 15 °C
vertoonden aan het einde van de houdbaarheid geen stijging/daling (< 0,5 log kve/g) (Figuur
18). Statistisch gezien werd er een significant verschil (p = 0,046) gevonden tussen het aantal
log kve/g op het einde van de houdbaarheid in vergelijking met het startpunt voor basilicum
geïnoculeerd met Salmonella Thompson en Typhimurium en bewaard bij 22 °C. Voor
basilicum bewaard bij 7 °C (p = 0,076) en 15 °C (p = 0,507) werd geen significante stijging of
daling waargenomen.
Ten tweede werd getoetst of er een significant verschil heerste tussen de drie temperaturen (7
°C, 15 °C en 22 °C) op het einde van de houdbaarheid. Bij basilicum geïnoculeerd met E. coli
O157 werd geen significant verschil (p = 0,082) bekomen tussen de drie temperaturen na
zeven dagen. Bij basilicum geïnoculeerd met Salmonella Thompson en Typhimurium werd
getoetst na zes dagen omdat dag zes het einde van de houdbaarheid betekende voor
verpakkingen bij 22 °C. Om de drie temperaturen met elkaar te kunnen vergelijken, was dag
zes het laatste punt. Er werd geen significant verschil (p = 0,129) waargenomen tussen de drie
temperaturen na zes dagen.
Er werden dus geen extreem grote stijgingen of dalingen waargenomen. Doch was er sprake
van een significante daling bij basilicum geïnoculeerd met E. coli O157 en bewaard bij 7 °C
en een significante stijging bij basilicum geïnoculeerd met Salmonella Thompson en
Typhimurium en bewaard bij 22 °C. Deze data is echter niet optimaal voor statistische
analysen. Dit omdat veel klassen aanwezig zijn ten opzichte van de drie herhalingen, want de
test verloopt over acht dagen bij drie verschillende temperaturen. In het algemeen kan er dus
besloten worden dat de pathogenen kunnen overleven op basilicum gedurende acht dagen bij
7 °C en 15 °C en gedurende zeven dagen bij 22 °C.
52
4.2.2 Bladgroenten: kropsla, jonge spinazie en baby leaves
4.2.2.1 Visuele kwaliteit
De algemene visuele kwaliteit van kropsla, spinazie en baby leaves vertoont een dalende trend
(Figuur 19) gedurende de bewaring bij 7°C, 15°C en 22°C.
Kropsla
7 °C
15 °C
Spinazie
22 °C
7 °C
22 °C
7
5
3
1
7
5
1
2
3
Tijd (dagen)
15 °C
22 °C
0
1
2
7
5
3
3
1
1
0
7 °C
9
Score (9-1)
9
Score (9-1)
Score (9-1)
9
15 °C
Baby leaves
0
1
2
Tijd (dagen)
3
3
Tijd (dagen)
Figuur 19: Algemene visuele kwaliteit van kropsla (links), spinazie (midden) en baby leaves (rechts) geïnoculeerd met E. coli
O157 (n = 3) of met Salmonella Thompson en Typhimurium (n = 3) gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen
(7 °C, 15 °C en 22 °C). De acceptatielimiet (5) wordt weergegeven als stippenlijn. Score 9 en 1 betekenen respectievelijk
acceptabel en onacceptabel staal.
Uit de figuren kan afgeleid worden dat de verpakkingen bij 7 °C een betere visuele kwaliteit
bezitten dat deze bij 15 °C, gevolgd door 22 °C. De dalende kwaliteit is bij kropsla
voornamelijk te wijten aan bruinkleuring en een verminderde versheid door slapper worden
van de bladeren (Tabel 12). Bij spinazie en baby leaves is een afname van de algemene
kwaliteit vooral afkomstig door een daling van de versheid en in beperkte mate door
bruinkleuring (Tabel 13 en Tabel 14).
Tabel 12: Frequentietabel van de visuele kwaliteit van kropsla geïnoculeerd met E. coli O157 (n = 3) of met Salmonella
Thompson en Typhimurium (n = 3) gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De
acceptatielimiet bedraagt 3 bij bruinkleuring en versheid en 5 voor de algemene kwaliteit. Een score van 1 en 5 voor
bruinkleuring en versheid en van 9 en 1 voor de algemene visuele kwaliteit betekenen respectievelijk acceptabel en
onacceptabel staal.
Parameters
Bruinkleuring
Versheid
Algemene kwaliteit
9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 n
T (in °C) Dag 1 1,5 2 2,5 3 1 1,5 2 2,5 3
0
6 0
0
0 0 6
0 0
0
0
6
0 0
0
0 0
0 0
0 6
7 1
0 6
0
0 0 0
6 0
0
0
0
6 0
0
0 0
0 0
0 6
2
0 4
2
0 0 0
6 0
0
0
0
5 1
0
0 0
0 0
0 6
3
0 4
2
0 0 0
4 2
0
0
0
3 3
0
0 0
0 0
0 6
15 1
0 4
2
0 0 0
4 2
0
0
0
4 2
0
0 0
0 0
0 6
2
0 2
4
0 0 0
2 4
0
0
0
0 6
0
0 0
0 0
0 6
3
0 1
5
0 0 0
1 5
0
0
0
0 6
0
0 0
0 0
0 6
22 1
0 3
2
0 1 0
3 2
0
1
0
4 2
0
1 0
0 0
0 6
2
0 3
0
2 1 0
2 1
2
1
0
0 3
1
1 0
0 0
1 6
3
0 0
3
2 1 0
0 4
1
1
0
0 2
0
3 0
1 0
0 6
53
Tabel 13: Frequentietabel van de visuele kwaliteit van spinazie geïnoculeerd met E. coli O157 (n = 3) of met Salmonella
Thompson en Typhimurium (n = 3) gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De
acceptatielimiet bedraagt 3 bij bruinkleuring en versheid en 5 voor de algemene kwaliteit. Een score van 1 en 5 voor
bruinkleuring en versheid en van 9 en 1 voor de algemene visuele kwaliteit betekenen respectievelijk acceptabel en
onacceptabel staal.
T (in °C)
Dag
0
7
1
2
3
15
1
2
3
22
1
2
3
Bruinkleuring/bederf
1 1,5 2 2,5 3
6 0 0 0 0
6 0 0 0 0
6 0 0 0 0
6 0 0 0 0
6 0 0 0 0
6 0 0 0 0
4 2 0 0 0
6 0 0 0 0
2 4 0 0 0
0 6 0 0 0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Parameters
Versheid
1,5 2 2,5 3 9 8,5
6 0 0 0 0 0
5 1 0 0 0 0
5 1 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0
4 2 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0
2 4 0 0 0 0
4 2 0 0 0 0
0 6 0 0 0 0
0 6 0 0 0 0
Algemene kwaliteit
8 7,5 7 6,5 6
6 0 0 0 0
5 1 0 0 0
5 1 0 0 0
3 3 0 0 0
4 2 0 0 0
1 2 3 0 0
0 2 3 1 0
4 2 0 0 0
0 0 2 4 0
0 0 0 1 5
5,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
n
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Tabel 14: Frequentietabel van de visuele kwaliteit van baby leaves geïnoculeerd met E. coli O157 (n = 3) of met Salmonella
Thompson en Typhimurium (n = 3) gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De
acceptatielimiet bedraagt 3 bij bruinkleuring en versheid en 5 voor de algemene kwaliteit. Een score van 1 en 5 voor
bruinkleuring en versheid en van 9 en 1 voor de algemene visuele kwaliteit betekenen respectievelijk acceptabel en
onacceptabel staal.
Bruinkleuring/bederf
T (in °C) Dag 1 1,5 2 2,5 3
0
6 0 0 0 0
7 1
6 0 0 0 0
2
6 0 0 0 0
3
4 2 0 0 0
15 1
6 0 0 0 0
2
4 2 0 0 0
3
0 6 0 0 0
22 1
3 3 0 0 0
2
0 6 0 0 0
3
0 6 0 0 0
1
6
6
6
4
6
4
0
2
0
0
Parameters
Versheid
1,5 2 2,5 3 9 8,5
0 0 0 0 6 0
0 0 0 0 6 0
0 0 0 0 6 0
2 0 0 0 2 4
0 0 0 0 6 0
2 0 0 0 2 1
5 1 0 0 0 0
4 0 0 0 0 5
6 0 0 0 0 0
1 2 3 0 0 0
Algemene kwaliteit
8 7,5 7 6,5 6
0 0
0 0 0
0 0
0 0 0
0 0
0 0 0
0 0
0 0 0
0 0
0 0 0
2 1
0 0 0
0 5
1 0 0
1 0
0 0 0
1 4
1 0 0
0 1
0 2 3
5,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
n
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
4.2.2.2 Zuurstof- en koolstofdioxidegehalte
Figuur 20, Figuur 21 en Figuur 22 geven het zuurstof- en koolstofdioxidegehalte weer in de
verpakte bladgroenten (kropsla, spinazie en baby leaves) gedurende drie dagen bij de
verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De grootste daling van het zuurstofgehalte
en de grootste stijging van het koolstofdioxidegehalte vond plaats bij 22 °C. Daarnaast is de
daling van O2 en de stijging van CO2 het meest uitgesproken bij de verpakte spinazie (Figuur
21).
54
% O2 of CO2
20
15
7 °C
15 °C
22 °C
7 °C
15 °C
22 °C
10
5
0
0
1
2
3
Tijd (dagen)
Figuur 20: Opvolgen van het zuurstofgehalte (ruit) en het koolstofdioxidegehalte (kruis) bij
verpakte kropsla onder lucht geïnoculeerd met E. coli O157 (n = 3; volle lijn) of met
Salmonella Thompson en Typhimurium (n = 3; stippenlijn) gedurende drie dagen bij drie
verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De standaardafwijking wordt
weergegeven met behulp van foutbalken.
20
% O2 of CO2
15
7 °C
15 °C
22 °C
7 °C
15 °C
22 °C
10
5
0
0
1
2
3
Tijd (dagen)
Figuur 21: Opvolgen van het zuurstofgehalte (ruit) en het koolstofdioxidegehalte (kruis) bij
verpakte spinazie onder lucht geïnoculeerd met E. coli O157 (n = 3; volle lijn) of met
Salmonella Thompson en Typhimurium (n = 3; stippenlijn) gedurende drie dagen bij drie
verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De standaardafwijking wordt
weergegeven met behulp van foutbalken.
% O2 of CO2
20
15
7 °C
15 °C
22 °C
7 °C
15 °C
22 °C
10
5
0
0
1
Tijd (dagen)
2
3
Figuur 22: Opvolgen van het zuurstofgehalte (ruit) en het koolstofdioxidegehalte (kruis) bij
verpakte baby leaves onder lucht geïnoculeerd met E. coli O157 (n = 3; volle lijn) of met
Salmonella Thompson en Typhimurium (n = 3; stippenlijn) gedurende drie dagen bij drie
verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De standaardafwijking wordt
weergegeven met behulp van foutbalken.
De stijging van het zuurstofgehalte en de daling van het koolstofdioxidegehalte bleven
aanvaardbaar gedurende de drie dagen van de overleving. Via een test werd nagegaan of
dezelfde verpakking die gebruikt werd voor kropsla ook haalbaar was voor spinazie en baby
55
leaves. Bij deze twee bladgroenten was er sprake van een te grote daling van het
zuurstofgehalte en een te grote stijging van het koolstofdioxidegehalte als gebruik gemaakt
werd van verpakkingen met een doorlaatbaarheid van 4600 ml O2/m² d atm. Via een nieuwe
test werd beslist dat het O2/CO2-gehalte weinig veranderde voor verpakte spinazie en baby
leaves bij hoge barrièrezakken met een luchttunnel.
4.2.2.3 Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium
Het doel was de overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium op te
volgen gedurende drie dagen bij 7 °C, 15 °C en 22 °C op kropsla, spinazie en baby leaves en
deze te vergelijken met basilicum. Figuur 23, Figuur 24 en Figuur 25 geven respectievelijk de
overleving van E. coli O157 of Salmonella Thompson en Typhimurium weer op kropsla,
spinazie en baby leaves. Tijdens de overleving werden geen verpakkingen uit de studie
gelaten omdat ze allen een acceptabele visuele kwaliteit bezaten.
De bespreking van de resultaten vindt plaats voor elke bladgroente (kropsla, spinazie en baby
leaves) afzonderlijk en bestaat uit dezelfde onderdelen zoals beschreven voor basilicum (zie
4.2.1.2). Allereerst werd voor elke bladgroente nagegaan of er sprake was van een
stijging/daling (≥ 0,5 log kve/g E. coli O157 of Salmonella Thompson en Typhimurium) na
drie dagen bewaren bij 7 °C, 15 °C of 22 °C ten opzichte van dag nul. Bovendien werd ook
onderzocht of deze stijging/ daling significant was voor elke temperatuur afzonderlijk (7 °C,
15 °C of 22 °C°). Tenslotte werd voor elke bladgroente afzonderlijk getoetst of er een
significant verschil heerste tussen de drie temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) na drie dagen
bewaren.
Kropsla
Voor kropsla bewaard bij 22 °C gedurende drie dagen werd een stijging waargenomen van E.
coli O157 (1,1 log kve/g) en van Salmonella Thompson en Typhimurium (0,8 log kve/g). Bij
7 °C en 15 °C was er geen sprake van een duidelijke stijging/daling (< 0,5 log kve/g) (Figuur
23). Statistisch gezien was er sprake van een significante stijging tussen dag nul en dag drie
voor kropsla bewaard bij 22 °C en geïnoculeerd met E. coli O157 (p = 0,046). Voor kropsla
geïnoculeerd met Salmonella Thompson en Typhimurium lag het resultaat net op het
significantieniveau (p = 0,05) indien bewaard werd bij 22 °C. Er werd geen significante
stijging/daling (p ≥ 0,05) bekomen bij kropsla geïnoculeerd met E. coli O157 of Salmonella
Thompson en Typhimurium bewaard bij 7 °C en 15 °C.
56
Tenslotte was er sprake van een
8
significant verschil tussen de drie
7
bewaartemperaturen (7 °C, 15 °C
kropsla geïnoculeerd met E. coli
O157
(p
=
0,032)
Salmonella
of
met
Thompson
en
Typhimurium (p = 0,038). Bij
welke temperatuur het verschil
15 °C
5
4
3
2
0
1
met
de
2
3
Tijd (dagen)
gelegen was, kon niet worden
aangetoond
22 °C
6
log kve/g
en 22 °C) na drie dagen voor
7 °C
Mann-
Whitney U, door het lage aantal
herhalingen.
Figuur 23: Overleving van E. coli O157 (n = 3; volle lijn) en Salmonella
Thompson en Typhimurium (n =3; stippenlijn) op kropsla gedurende drie
dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). De
standaardafwijking wordt weergegeven met behulp van foutbalken. Kruis
= er zijn twee resultaten te kort op dag 1 (bij 22 °C bij E. coli O157 en
bij 15 °C bij Salmonella. Ruit = er is één herhaling te kort op dag 2 bij E.
coli O157 bij 22 °C. De dedectielimiet bedraagt 2 log kve/g.
Spinazie
Er werd geen duidelijke stijging/daling (< 0,5 log kve/g) waargenomen voor zowel E. coli
O157 als Salmonella Thompson en Typhimurium na drie dagen bewaren bij 7 °C, 15 °C of 22
°C (Figuur 24).
8
7 °C
15 °C
Statistisch gezien was er geen sprake van
22 °C
een significante stijging/daling (p ≥ 0,05)
7
van het aantal log kve/g van dag drie ten
opzichte
log kve/g
6
van
dag
geïnoculeerd met
5
nul
bij
spinazie
E. coli O157
of
Salmonella Thompson en Typhimurium.
4
Er
werd
een
significant
verschil
waargenomen tussen de drie temperaturen
3
(7 °C, 15 °C en 22 °C) op dag drie voor
2
0
1
Tijd (dagen)
2
3
spinazie geïnoculeerd met Salmonella
Thompson en Typhimurium (p = 0,042),
Figuur 24: Overleving van E. coli O157 (n = 3; volle lijn) en
Salmonella Thompson en Typhimurium (n = 3; stippenlijn) op
spinazie gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen
(7 °C, 15 °C en 22 °C). De standaardafwijking wordt
weergegeven met behulp van foutbalken. De dedectielimiet
bedraagt 2 log kve/g
maar niet voor spinazie geïnoculeerd met
E. coli O157 (p = 0,772). Waar het
verschil gelegen was tussen de drie
temperaturen
kon
niet
worden
aangetoond.
57
Baby leaves
Er werd geen duidelijke stijging/daling (< 0,5 log kve/g) waargenomen voor baby leaves
geïnoculeerd met E. coli O157 of met Salmonella Thompson en Typhimurium bij de drie
temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) na drie dagen, met uitzondering van E. coli O157 bij 15
°C. Hierbij trad een daling van 1,1 log kve/g op na drie dagen. Voor dit punt werd echter een
grote variatie waargenomen omdat er één van de drie herhalingen sterk afweek (Figuur 25).
De visuele kwaliteit week niet af van de stalen bewaard bij 15 °C bij dag 3 (Tabel 14).
De p-waarde van baby leaves
geïnoculeerd met E. coli O157 en
bij
geïnoculeerd
15
met
°C
bewaard bij 7 °C of 15 °C lag net
op het significantieniveau van
0,05. Daarnaast werd er geen
5
4
3
0,05) waargenomen van baby
2
leaves geïnoculeerd met E. coli
O157 en bewaard bij 7 °C en 22
Salmonella
geïnoculeerd
Thompson
22 °C
6
significante stijging/daling (p ≥
of
15 °C
7
Salmonella
Thompson en Typhimurium en
°C
7 °C
of
log kve/g
bewaard
8
met
en
0
1
Tijd (dagen)
2
3
Figuur 25: Overleving van E. coli O157 (n = 3; volle lijn) en Salmonella
Thompson en Typhimurium (n = 3; stippenlijn) op baby leaves
gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en
22 °C). De standaardafwijking wordt weergegeven met foutbalken. De
detectielimiet bedraagt 2 log kve/g.
Typhimurium en bewaard bij 22
°C.
Bovendien was er ook sprake van een significant verschil tussen de drie bewaartemperaturen
na drie dagen voor baby leaves geïnoculeerd met E. coli O157 (p = 0,027), maar niet voor
baby leaves geïnoculeerd met Salmonella Thompson en Typhimurium (p = 0,058). Er kon
niet worden aangetoond welke temperatuur afweek van de andere.
Er werden geen extreem grote stijgingen of dalingen waargenomen van het aantal log kve/g
van kropsla, spinazie of baby leaves geïnoculeerd met E. coli O157 of Salmonella Thompson
en Typhimurium. Deze test is niet optimaal voor statistische analysen omdat er veel klassen
(dag 0, dag 1, dag 2, dag 3 en 7 °C, 15 °C en 22 °C) aanwezig zijn ten opzichte van de drie
herhalingen. In het algemeen kan er dus besloten worden dat de pathogenen kunnen overleven
op kropsla, spinazie en baby leaves gedurende drie dagen bij 7 °C, 15 °C en 22 °C.
58
4.2.3 Vergelijking basilicum en bladgroenten
De toename/afname van het aantal log kve/g van E. coli O157 of Salmonella Thompson en
Typhimurium na drie dagen bewaren, werd vergeleken voor basilicum, kropsla, spinazie en
baby leaves voor elke temperatuur apart (7 °C, 15 °C of 22 °C).
Bij 7 °C werd een afname waargenomen van beide pathogenen geïnoculeerd op basilicum na
drie dagen. Bij de andere bladgroenten werd geen verschil (< 0,5 log kve/g) waargenomen.
Ook bij 15 °C werd een daling gezien van beide pathogenen op basilicum en een daling van
E. coli O157 op baby leaves na drie dagen. Tenslotte werd bij 22 °C enkel een stijging
waargenomen bij beide pathogenen op kropsla. Bij de andere bladgroenten en basilicum werd
geen verschil (< 0,5 log kve/g) waargenomen na drie dagen bewaring.
Bovendien werd aangetoond, in het geval van E. coli O157, dat er een significant verschil
heerste tussen de levensmiddelen na bewaren bij 15 °C (p = 0,030) in tegenstelling tot 7 °C (p
= 0,070) en 22 °C (p = 0,066). Voor 15 °C kon niet worden aangetoond met de MannWhitney U tussen welke producten het verschil gelegen was. Bij de overlevingsstudie van
Salmonella Thompson en Typhimurium werd een significant verschil (p = 0,042)
waargenomen tussen de aantallen in kve/g op kropsla, spinazie, baby leaves en basilicum na
drie dagen bewaren bij 22 °C. Bij 7 °C (p = 0,059) en 15 °C (p = 0,101) werd geen significant
verschil waargenomen. Ook hier kon niet worden aangetoond welke producten een
verschillende log kve/g hadden na bewaren bij 22 °C.
Tot slot werd ook nagegaan of er een verschil heerste tussen de groei/afsterving van E. coli
O157 ten opzichte van Salmonella Thompson en Typhimurium van dag drie ten opzichte van
dag nul voor elk levensmiddel (basilicum, kropsla, spinazie en baby leaves) afzonderlijk per
temperatuur (7 °C, 15 °C of 22 °C) via een Mann-Whitney U test. Dit omdat de onafhankelijk
variabele 'pathogeen' slechts bestond uit twee factoren (E. coli O157 en Salmonella
Thompson en Typhimurium). Hieruit kon geconcludeerd worden dat er gedurende de
overlevingsstudie geen significante verschillen (p ≥ 0,05) teruggevonden werden tussen de
groei/afsterving van beide pathogenen.
59
5 Discussie
In dit hoofdstuk worden de resultaten bediscussieerd en aan de gevonden literatuur gekoppeld.
Hierbij wordt een antwoord geformuleerd op de twee onderzoeksvragen van deze studie.
Waaruit bestaat de natuurlijke microbiële populatie aanwezig op basilicum?
Gedurende de screening van verse basilicum werd E. coli waargenomen, maar niet bij alle
stalen. Ook Salmonella spp. werd teruggevonden op twee stalen basilicum geïmporteerd uit
Cyprus gedurende de analyse van de kruiden. Deze pathogeen is ongewenst en dient afwezig
te zijn per 25 g verse basilicum (Uyttendaele et al., 2010). Doch werd Salmonella spp. eerder
al geassocieerd met uitbraken bij dit koningskruid (Pakalniskiene et al., 2009; Pezzoli et al.,
2008). Volgens het RASFF zijn de aanwezigheid van Salmonella spp. en een te hoog gehalte
aan E. coli de meest voorkomende meldingen met betrekking tot verse basilicum (RASFF,
2014).
Een hoog gehalte aan E. coli kan als indicator dienen voor fecale contaminatie. Bovendien
treedt dit op als indexorganisme voor de aanwezigheid van pathogenen zoals Salmonella spp.
(Baylis et al., 2011; Elviss et al., 2009). Indien het aantal van E. coli hoger was dan de
doelwaarde van 2 log kve/g en zelfs dan de tolerantiewaarde van 3 log kve/g (Uyttendaele et
al., 2010), leidde niet noodzakelijk tot de aanwezigheid van Salmonella spp. of EHEC
gedurende de screening. Bij geen enkel staal werd vtx-1 of vtx-2 gedetecteerd. Het eae-gen
werd wel gevonden bij respectievelijk 57 % en 61 % van de stalen van Cyprus en Israël. In de
literatuur kon ook geen direct verband gevonden worden tussen de aanwezigheid van E. coli
en het voorkomen van Salmonella spp. (Elviss et al., 2009).
De prevalentie van Salmonella spp. bedroeg 9,52 % voor Cyprus en 0 % voor Israël bij de
screening van basilicum. Een positieve bevestiging door het LFMFP labo toonde aan dat het
bij de twee gevallen ging om Salmonella species enterica subspecies salamae. In de literatuur
werd een prevalentie van 1,3 % gevonden, waarbij Salmonella spp. werd gedetecteerd bij 9
van de 674 stalen verse basilicumblaadjes. Dit ging in acht gevallen om het serotype
Senftenberg (Salmonella enterica subspecies enterica) op basilicum, geïmporteerd uit Israël.
Bij het overige staal werd Salmonella Javiana (Salmonella enterica subspecies enterica)
waargenomen, waarbij het land van import onbekend was. Bij deze stalen bleven de aantallen
van E. coli in zes van de negen gevallen onder de doelwaarde van 2 log kve/g, in twee
gevallen onder de tolerantiegrens van 3 log kve/g. Bij het staal besmet met Salmonella
Javiana werd 3,58 log kve/g aan E. coli waargenomen (Elviss et al., 2009).
61
Tijdens de karakterisatie van de natuurlijke microbiota aanwezig op basilicum werd besloten
dat de staalvoorbereiding een grote impact had op de aanwezigheid van de bacteriën. Via de
monstervoorbereiding werd al een eerste selectie gemaakt in de aanwezige microbiota. De
opbrengst van bacterieel DNA was gemiddeld 4,5 keer hoger na wassen met Tween®80 in
vergelijking met stomacheren op tijdstip nul. Dit fenomeen kent twee mogelijke verklaringen.
Enerzijds zou het hoger gehalte aan eukaryoot DNA afkomstig van planten bij stomacheren,
waarbij de basilicum een grote mechanische belasting ondergaat, verklaard kunnen worden
door het ontstaan van de kapotte blaadjes tijdens de homogenisatie. Bij gewassen basilicum
blijven de blaadjes volledig intact en is er geen sprake van een zware fysische belasting.
Anderzijds zou Tween®80 kunnen instaan voor de hogere opbrengst van bacterieel DNA bij
sequencen. Dit detergent werd altijd gebruikt na de optimalisatie bij het wassen van de
basilicumblaadjes en zou een mogelijke invloed kunnen hebben op het losmaken van de
aanwezige bacteriën op dit kruid. In eerder onderzoek werd reeds gebruik gemaakt van
Tween®80 om bacteriën los te maken van spinaziebladeren (Carder, 2010). Tween®80 kan
dus ook instaan voor de hogere opbrengst van bacterieel DNA bij gewassen basilicum.
In een vervolgstudie zou een vergelijking gemaakt kunnen worden van gestomacherde
basilicum met en zonder het gebruik van Tween®80.
Daarnaast verschilt ook de samenstelling van de bacteriën bij gewassen en gestomacherde
basilicum na NGS. Doch wordt een gemeenschappelijke dominante band gedetecteerd na
DGGE bij beide staalvoorbereidingen. Indien de gestomacherde basilicum aangerijkt werd in
BPW bij 37 °C, dan verminderde de intensiteit van de dominante groep na 20,5 uur bewaren.
Bovendien was dit bandje volledig verdwenen na drie dagen aanrijken. Na sequencen werd
het genus Novosphingobium spp. waargenomen als dominante groep bij gestomacherde
basilicum op tijdstip nul. Na een aanrijking in BPW bij 37 °C, nam deze groep af met 76,5 %
na vijf uur en was deze volledig verdwenen indien langer dan 28 uur werd aangerijkt. Bij de
afgewassen kolonies op TSA, VRBL en XLD werd Novosphingobium spp. niet
waargenomen. Dit genus behoort tot de natuurlijke microbiota van planten (Stenmark &
Nordlund, 2003), maar groeide niet gedurende de aanrijking in BPW bij 37 °C en werd niet
meer waargenomen na incubatie bij 37 °C van gestomacherde basilicum op TSA, VRBL en
XLD. Een mogelijke verklaring zou zijn dat het geslacht Novosphingobium niet kan groeien
bij temperaturen ≥ 37 °C.
In de literatuur worden verschillende artikels teruggevonden waarbij de groeitemperaturen
van Novosphingobium aangegeven worden. Deze waarden verschillen naargelang het species,
maar over het algemeen wordt teruggevonden dat de optimale groei plaatsgrijpt tussen 23 °C
en 30 °C. Bovendien wordt 30 °C tot 37 °C als maximale temperatuur opgegeven waar groei
mogelijk is (Addison, Foote, Reid, & Lloyd-Jones, 2007; Baek, Lim, Jin, Lee, & Lee, 2011;
62
Kämpfer, Reinhardwitzenberger, Busse, & Neef, 2002; Liu, Wang, Liu, & Lium, 2005;
Matsuyama, Kamesaki, Sasaki, Minami, & Yumo, 2003; Tiirola, Busse, Kämpfer, &
Männistö, 2005). Sommigen tonen aan dat groei bij 37 °C niet meer mogelijk is (Addison et
al., 2007; Kämpfer et al., 2002).
Bij gewassen basilicum werd Novosphingobium spp. in mindere mate aangetroffen (4,30 %
tot 8,56 %). Dit genus wordt dus minder geëxtraheerd dan de andere genera na het wassen.
Een mogelijke verklaring voor dit fenomeen zou zijn dat Novosphingobium spp. in hogere
mate aangetroffen wordt na het ondergaan van een zwaardere mechanische belasting.
Om te weten wat de dominante groep is na DGGE, zou dit bandje uitgesneden en gesequencet
moeten worden. De uitgevoerde DGGE en NGS zijn niet één aan één vergelijkbaar omdat
gewerkt wordt met een groter target-DNA fragment geamplificeerd door andere primerparen
bij NGS in vergelijking met DGGE.
In de studie van Wetzel et al. (2010) wordt Enterobacter teruggevonden als meest
voorkomende genus op aangerijkte basilicum in BHI bij 37 °C. Enterobacter was gedurende
de huidige studie voor 1,63 % aanwezig bij basilicum II op tijdstip nul. Indien echter
aangerijkt werd gedurende 5 uur, was Enterobacter voor 10,44 % aanwezig. Na 28 uur, steeg
deze hoeveelheid nog tot 14,61 %. Voor basilicum I was er ook sprake van een stijging (8,39
%) van Enterobacter na drie dagen aanrijken in BPW bij 37 °C. Tijdens de karakterisatie in
het kader van dit onderzoek, werd Salmonella spp. bij geen enkel staal waargenomen. Dit in
tegenstelling tot de literatuur waarbij Salmonella Typhimurium waargenomen bij één van de
tien stalen van conventioneel geteelde basilicum na een aanrijking in BHI bij 37 °C (Wetzel et
al., 2010). In de studie van Wetzel et al. (2010) werd gebruik gemaakt van het primerpaar
27F/1512R, was er sprake van een grotere mechanische belasting (stomacheren gedurende
twee minuten) en werd aangerijkt in BHI. BHI is gekend al voedzaam aanrijkingsmedium
voor veeleisende micro-organismen, terwijl BPW eerder gebruikt wordt voor een
aanrijkingsstap van Salmonella spp. uit voedingsmiddelen (Oxoid, 2014a, 2014b).
De visuele kwaliteit van basilicum werd nagegaan gedurende veertien dagen bij drie
verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C). Deze was duidelijk slechter voor
basilicum afkomstig van België in tegenstelling tot deze afkomstig van Israël. Dit onderzoek
was slechts gebaseerd op één batch stalen per land. Binnen het bestek van dit onderzoek
werden de stalen afkomstig van België (basilicum IV) en Israël (basilicum V) niet meer
gesequencet. Om een schatting te maken van de aanwezige microbiota, kan gekeken worden
naar de resultaten van gesequeneerde gewassen basilicum I (België) en gewassen basilicum
63
III (Israël). Deze ondergingen een volledig identieke staalvoorbereiding zoals de partijen IV
en V.
Na het wassen werd een verschil waargenomen in de bacteriepopulaties van basilicum
afkomstig van België (basilicum I) en basilicum afkomstig van Israël (Basilicum III).
Allereerst was de bacteriële opbrengst van bacteriën 8,2 keer groter bij gewassen Belgische
basilicum in vergelijking met de Israëlische variant. Ook werd een verschil waargenomen in
de dominante groepen.
Bij Belgische basilicum was voornamelijk Pseudomonas (39,67 %) aanwezig, gevolgd door
Enterobacter (15,27 %), Klebsiella (11,19 %) en Pantoea (6,03%). De laatste drie groepen
behoren allen tot de Enterobacteriaceae, meer specifiek tot de groep van de coliformen
(Baylis et al., 2011; Stevens, Ashbolt, & Cunliffe, 2003). Uit de analyse van basilicum uit
Cyprus en Israël volgt, dat coliformen steeds in een hoeveelheid van 3,5 log kve/g tot 6,5 log
kve/g aanwezig zijn.
Bij de Israëlische basilicum werd voornamelijk Sphingobacterium (55,97 %) waargenomen,
gevolgd door Flavobacterium (10,87 %) en tenslotte ook Novosphingobium (8,56 %).
Pseudomonas wordt beschreven als een micro-organisme dat pectine afbreekt bij rauwe
groenten (Devlieghere, Debevere, Jacxsens, Uyttendaele, & Vermeulen, 2011). Bij Belgische
basilicum werd Pseudomonas in hoge mate (39,67 %) aangetroffen. Dit zou een rol kunnen
spelen bij de afbraak van basilicum, waardoor nutriënten vrijkomen. Uit de literatuurstudie
blijkt dat het vrijkomen van deze nutriënten de groei van micro-organismen bevordert. Bederf
zou op deze manier in de hand gewerkt kunnen worden. Bovendien kunnen
Enterobacteriaceae goed groeien bij een hoge aw zoals bij verse kruiden, waardoor bederf ook
opgetreden kan zijn door deze groep (Baylis et al., 2011).
Via DGGE werd een onderscheid gemaakt tussen basilicum waar bederf opgetreden was
(score algemene visuele kwaliteit < 5) en acceptabele basilicum (score algemene visuele
kwaliteit ≥ 5). Hieruit volgde dat Belgische basilicum koel (< 7°C) bewaard moest worden
om bederf te voorkomen. Op die manier was de basilicum acceptabel voor consumptie
gedurende veertien dagen. Na elf dagen was er wel sprake van koudeschade bij 7 °C. Dit
strookt niet met de verwachte kwaliteit van basilicum, waarbij aangeraden wordt om het kruid
te bewaren bij 12 tot 15 °C om koudeschade te voorkomen. (Elviss et al., 2009). Echter,
indien basilicum bewaard werd bij 15 °C, trad al bederf op na vier dagen bewaren en werd de
acceptatielimiet bereikt na zeven dagen.
Bij geïmporteerde basilicum uit Israël, was bewaren bij een lage temperatuur (< 7 °C) niet
noodzakelijk om bederf te voorkomen, want deze bleef tot dag veertien acceptabel voor
consumptie indien bewaard werd bij 15 °C. Bij 15 °C was er geen sprake van bederf in
tegenstelling tot de Belgische basilicum. Koudeschade kon op die manier voorkomen worden.
64
In welke mate stijgt/daalt het aantal log kve/g van Salmonella (Thompson en
Typhimurium, 1:1) en een E. coli O157 mix (1:1) op basilicum en bladgroenten (kropsla,
spinazie en baby leaves) gedurende bewaring bij verschillende temperaturen? En is er een
verschil tussen de groei/overleving van deze pathogenen op basilicum en bladgroenten?
Uitbraken werden reeds gemeld waarbij pathogenen aanwezig zijn op sla of spinazie. Deze
planten produceren geen hoge gehalten aan antimicrobiële componenten zoals basilicum
(Kisluk et al., 2013). Van de antimicrobiële componenten van basilicum (linalool, estragol en
methyl chavicol) is gekend dat ze een remmend effect vertonen ten opzichte van de bacteriën
(Da Silva et al., 2005; Suppakul et al., 2003). De essentiële oliën van basilicum vertoonden
eerder al een inhibitie ten opzichte van de groei van Salmonella spp. en VTEC O157:H7 (Hsu
et al., 2006). Er zou dus verwacht worden dat de overleving van de pathogene Salmonella spp.
en E. coli O157 moeizamer plaatsgrijpt op basilicum in vergelijking met de bladgroenten
kropsla, spinazie en baby leaves. Uit de studie van Kisluk et al. (2013) werd al aangetoond dat
Salmonella Typhimurium sneller afgedood wordt op het bladoppervlak van basilicum in
vergelijking met peterselie (Kisluk et al., 2013). Bovendien zou de overleving van Salmonella
spp. op verse basilicum ook afhankelijk zijn van het serotype. Zo is Salmonella Senftenberg,
de veroorzaker van een uitbraak met basilicum in 2007, beter bestand tegen deze
antimicrobiële componenten in vergelijking met Salmonella Typhimurium. Een betere
overleving zou te wijten zijn aan de lagere gevoeligheid voor deze componenten van
basilicum (Kisluk et al., 2013).
Gedurende dit onderzoek werd de overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en
Typhimurium na drie dagen bij 7 °C, 15 °C of 22 °C vergeleken voor basilicum en de
bladgroenten kropsla, spinazie en baby leaves. Bij 7 °C en 15 °C werd een beperkte daling
van beide pathogenen waargenomen op basilicum na drie dagen. Dit was niet zo bij de
bladgroenten, met uitzondering van baby leaves geïnoculeerd met E. coli O157 en bewaard bij
15 °C. Bovendien was er sprake van een geringe stijging van beide ziekteverwekkers bij
kropsla na drie dagen bij 22 °C. Bij basilicum, spinazie of baby leaves werd bij deze
temperatuur geen verandering (< 0,5 log kve/g) waargenomen.
Over het algemeen kan er dus besloten worden dat de pathogenen E. coli O157 en Salmonella
Thompson en Typhimurium kunnen overleven op basilicum, kropsla, spinazie en baby leaves
gedurende drie dagen indien bewaard wordt bij 7 °C, 15 °C of 22 °C.
Echter, de overlevingsstudie voor basilicum duurde zeven dagen bij 22 °C en acht dagen bij 7
°C en 15 °C. Indien basilicum bewaard werd bij 7 °C, werd een daling van 1,2 log kve/g E.
coli O157 waargenomen na zeven dagen en een daling van 0,7 log kve/g Salmonella
65
Thompson en Typhimurium na acht dagen. Ook in de literatuur werd een afsterving van E.
coli O157 en Salmonella spp. waargenomen indien bewaard werd bij 4 °C, namelijk
respectievelijk 0,7 log kve/g en 0,9 log kve/g na 19 dagen bewaren (Hsu et al., 2006). In een
andere studie werd aangetoond dat geen verandering (< 0,5 log kve/g) optrad bij basilicum,
geïnoculeerd met Salmonella Typhimurium en bewaard bij 4 °C gedurende drie dagen. Dit
was wel het geval indien dit koningskruid geïnoculeerd was met Salmonella Senftenberg. Hier
was sprake van een stijging van 0,9 log kve/g indien bewaard werd bij 4 °C gedurende drie
dagen (Kisluk et al., 2013). In de literatuurstudie werd aangehaald dat een bewaartemperatuur
van 7 °C aangeraden wordt om de groei van pathogenen te controleren (Baylis et al., 2011;
Delaquis & Dinu, 2007).
Een bewaring bij 15 °C kende een daling van 1,4 log kve/g E. coli O157 na acht dagen. Doch,
na zeven dagen was er geen verschil waar te nemen (< 0,5 log kve/g). De daling na acht dagen
dient met enige voorzichtigheid benaderd te worden. Deze waarde was slechts gebaseerd op
één herhaling door de onacceptabele visuele kwaliteit van de andere stalen op dag acht.
Basilicum, geïnoculeerd met Salmonella Thompson en Typhimurium vertoonde geen
verandering (< 0,5 log kve/g) na acht dagen bewaren bij 15 °C. In de literatuur werden geen
studies gevonden waarbij de overleving van pathogenen op basilicum werd nagegaan bij 15
°C.
Indien bewaard werd bij 22 °C, werd een stijging van 0,7 log kve/g van Salmonella
Thompson en Typhimurium waargenomen na zes dagen en geen verandering (< 0,5 log
kve/g) van het aantal E. coli O157 na zeven dagen. In de literatuur werd eerder al een studie
gedaan naar de overleving van basilicum geïnoculeerd met Salmonella Senftenberg of met
Salmonella Typhimurium. Er was sprake van een stijging van respectievelijk 2,9 log kve/g en
2,0 log kve/g voor Salmonella Senftenberg en Salmonella Typhimurium na drie dagen
bewaren bij 25 °C (Kisluk et al., 2013).
Over het algemeen kan er dus besloten worden dat de pathogenen E. coli O157 en Salmonella
Thompson en Typhimurium overleefden op basilicum gedurende zeven dagen bij 22 °C en
acht dagen bij 7 °C of 15 °C. Nadien was er geen sprake meer van acceptabele basilicum en
werd de analyse stopgezet.
Ook de visuele kwaliteit van alle geïnoculeerde basilicumstalen werd beoordeeld, waarbij een
goede visuele kwaliteit het best gewaarborgd bleef bij bewaren bij 7 °C. De basilicum bleef
bij deze temperatuur acceptabel gedurende acht dagen, maar koudeschade werd reeds na vier
dagen opgemerkt. Ook in de literatuur werd de visuele kwaliteit van de basilicum bestudeerd
gedurende een overlevingsstudie (na 1, 5, 11, 16, 19 en 24 dagen) bij 4 °C. Hieruit bleek dat
de visuele kwaliteit nog acceptabel was na elf dagen bewaring, mits een beetje koudeschade
66
en verkleuringen bij de verse basilicum. Deze studie werd vervroegd onderbroken op dag 19,
omdat er sprake was van veel koudeschade en het uittreden van vocht (Hsu et al., 2006).
In een vervolgstudie zou de invloed van de achtergrondmicrobiota, die gekarakteriseerd werd
met DGGE en NGS, nagegaan kunnen worden op de overleving van de pathogenen
Salmonella spp. en E. coli O157.
67
6 Besluit
De staalvoorbereiding is van groot belang bij de karakterisatie van de microbiële populatie
aanwezig op verse basilicum. Hierdoor wordt al een eerste selectie gemaakt van de microorganismen. Bovendien wijzigt de diversiteit van de bacteriën gedurende bewaren bij hogere
temperaturen, aanrijken in BPW en uitplaten op TSA, XLD of VRBL. Bij gestomacherde
basilicum wordt Novosphingobium teruggevonden als dominante genus, maar deze bacteriën
worden niet gedetecteerd na een standaard uitplating op TSA, XLD of VRBL bij 37 °C en na
aanrijking in BPW bij 37 °C, mogelijkerwijs door te hoge incubatietemperaturen. Gewassen
basilicum bevatte een grotere variatie aan dominante groepen, namelijk Sphingobacterium,
Flavobacterium, Pseudomonas, Enterobacter, Klebsiella en Pantoea.
De mogelijkheid bestaat er in dat basilicum besmet is met Salmonella spp. EHEC werd niet
teruggevonden op dit koningskruid. Indien verse basilicum besmet is met E. coli O157 of met
Salmonella Thompson en Typhimurium, kunnen deze ziekteverwekkers overleven gedurende
een normaal proces van transport, distributie en opslag door de consument. Mede omdat het
hier gaat om een kant-en-klaar product, dat niet verhit wordt voor consumptie, houdt de goede
overleving van deze pathogenen een risico op voedselinfecties in.
69
Referentielijst
Addison, S. L., Foote, S. M., Reid, N. M., & Lloyd-Jones, G. (2007). Novosphingobium
nitrogenifigens sp. nov., a polyhydroxyalkanoate-accumulating diazotroph isolated
from a New Zealand pulp and paper wastewater. International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology, 57, 2467-2471.
Aruscavage, D., Miller, S. A., Lewis Ivey, M. L., Lee, K., & LeJeune, J. T. (2008). Survival
and dissemination of Escherichia coli O157:H7 on physically and biologically
damaged lettuce plants. Journal of Food Protection, 71(12), 2384-2388.
Baek, S., Lim, J. H., Jin, L., Lee, H., & Lee, S. (2011). Novosphingobium sediminicola sp.
nov. isolated from freshwater sediment. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 61, 2464-2468.
Bauwens, P. (2006). Basilicum - botanisch, praktisch & culinair. Arnhem: Terra|Lannoo.
Baylis, C., Uyttendaele, M., Joosten, H., & Davies, A. (2011). The Enterobacteriaceae and
their significance to tho food industry. Brussels: ILSI International Life Sciences
Institut
Bell'Aroma. (2008). Verse kruiden - basilicum. Geraadpleegd op 23 februari 2014, op
http://www.bellaroma.eu/nl/verse-kruiden
Bell, C., & Kyriakides, A. (2002). Salmonella: A Practical Approach to the Organism and its
Control in Foods. London: Blackwell Science Ltd.
Berger, C. N., Sodha, S. V., Shaw, R. K., Griffin, P. M., Pink, D., Hand, P., & Frankel, G.
(2010). Fresh fruit and vegetables as vehicle for the trasmission of human pathogens.
Environmental microbiology, 12(9), 2385-2397.
Beutin, L., Jahn, S., & Fach, P. (2009). Evaluation of the 'GeneDisc' real-time PCR system for
detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O26, O103, O111, O145
and O157 strains according to their virulence markers and their O- and H-antigenassociated genes. Journal of Applied Microbiology, 106, 1122-1132.
Brandl, M. T. (2008). Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli
O157:H7 on postharvest lettuce. Environmental microbiology, 74(17), 5285-5289.
Brooks, J. T., Sowers, E. G., Wells, J. G., Greene, K. D., Griffin, P. M., Hoekstra, R. M., &
Strockbine, N. A. (2005). Non-0157 Shiga Toxin-Producing Escherichia coli
infections in the United States, 1983-2002. The Journal of Infectious Diseases, 192,
1422-1429.
71
Callewaert, C., Kerckhof, F.-M., Granitsiotis, M. S., Van Gele, M., Van de Wiele, T., &
Boon, N. (2013). Characterization of Staphylococcus and Corynebacterium Clusters in
the Human Axillary Region. Plos one, 8(8), 1-8.
Campbell, J. V., Mohle-Boetani, J., Reporter, R., Abbott, S., Farrar, J., Brandl, M., ... Werner,
S. B. (2001). An outbreak of Salmonella serotype Thompson associated with fresh
cilantro. The Journal of Infectious Diseases, 186, 984-987.
Carder, A. (2010). Microbial communities of spinach at various stages of plant growth from
seed to maturity. Onuitgegeven thesis Master of Science in Life Sciences. Virginia
Polytechnic Institute and State University.
CBI (2013).CBI Tradewatch spiced and herbs - Broadcasting your trade statistics.
Chang, J.-M., & Fang, T. J. (2007). Survival of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella
enterica serovars Typhimurium in iceberg lettuce and the antimicrobial effect of rice
vinegar against E. coli O157:H7. Food Microbiology, 24, 745-751.
Coburn, B., Grassl, G. A., & Finlay, B. B. (2007). Salmonella, the host and disease: a brief
review. Immunology and Cell biology, 85, 112-118.
Collins, C., & Green, J. A. (2010). A review of the pathophysiology and treatment of shiga
tixine producing E. coli infection. Practical Gastroenterology, 41-50.
Da Silva, F., Silva Santos, R. H., De Andrade, N. J., Almeida Barbosa, L. C., Dias Casali, V.
W., De Lima, R. R., & De Melo Passarinho, R. V. (2005). Basil conservation affected
by cropping season, harvest time and storage period. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, 40(4), 323-328.
De Geeter, H. (2004). Verrijk je keuken met verse kruiden. Nutrinews, 4, 8-11.
Deering, A. J., Mauer, L. J., & Pruitt, R. E. (2012). Internalization of E. coli O157:H7 and
Salmonella spp. in plants: a review. Food Research International, 45, 567-575.
Delaquis, P. B., S., & Dinu, L. D. (2007). Behavior of Escherichia coli O157:H7 in leafy
vegetables. Journal of Food Protection, 70(8), 1966-1974.
Devlieghere, F., Debevere, J., Jacxsens, L., Uyttendaele, M., & Vermeulen, A. (2011).
Levensmiddelenmicrobiologie en -conservering. Brugge: die Keure.
Doyle, M. P., & Erickson, M. C. (2008). Summer meeting 2007 - the problems with fresh
produce: an overview. Journal of Applied Microbiology, 105, 317-330.
FOD economie (2011). Definitieve resultaten van de landbouwtelling van mei 2010.
Geraadpleegd
op
25
november
2013
op
http://statbel.fgov.be/nl/modules/pressrelease/statistieken/economie/recensement_agri
cole_de_mai_2010.jsp
72
EFSA. (2011a). EFSA explains zoonotic diseases – Salmonella. Geraadpleegd op 13 februari
2014 op http://www.efsa.europa.eu/en/corporate/pub/factsheetsalmonella.htm
EFSA. (2011b). EFSA explains zoonotic diseases – Zoonotic E. coli. Geraadpleegd op 13
februari 2014 op http://www.efsa.europa.eu/en/corporate/pub/factsheetecoli.htm
EFSA. (2013). Scientific Opinion on VTEC-seropathotype and scientific criteria regarding
pathogenicity assessment. EFSA Journal, 11(4), 3238-3244.
EFSA, & ECDC. (2014). The European Union summery report: trends and sources of
zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2012. EFSA Journal, 12(2),
3547-3859.
EFSA, & NDA. (2009). Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to
Ocimum basilicum L. and improvement of diuretic function (ID 2314, 3465) pursuant
to Article 13(1) of Regulation (EC) No 1924/2006. EFSA Journal, 7(9), 1298-1309.
Elliot, E. J., & Robins-Brone, M. (2005). Hemolytic Uremic Syndrome. Curr Problem
Pediatric Adolescent Health Care, 35, 310-330.
Elviss, N. C., Little, C. L., Hucklesby, L., Sagoo, S., Surman-Lee, S., de Pinna, E., &
Threlfall, E. J. (2009). Microbiological study of fresh herbs from retail premises
uncovers an international outbreak of salmonellosis. International Journal of Food
Microbiology, 134, 83-88.
Ercolini, D. (2004). PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection of microbes in
food. Journal of Microbiological Methods, 56, 297-314.
FAVV., WIV., & CODA. (2011). Trends and sources 2010 - 2011: report on zoonotic agents
in Belgium.
Golberg, D., Kroupitski, Y., Belausov, E., Pinto, R., & S., S. (2011). Salmonella
Typhimurium internalization is variable in leafy vegetables and fresh herbs.
International Journal of Food Microbiology, 145, 250-257.
Gorbatsevich, E., Sela, S., Pinto, R., & Bernstein, N. (2013). Root internalization, transport
and in-plata survival of Salmonella enterica serovar Newport in sweet basil.
Environmental Microbiology reports, 5(1), 151-159.
Guzman-Herrador, B. R., Nilsen, E., Cudjoe, K. S., Jensvoll, L., Kvamme, J. M., Aanstad, A.
L., . . . Werner-Johansen, O. (2013). A Shigella sonnei outbreak traced to imported
basil - the importance of good typing tools and produce traceability systems, Norway,
2011. Infectious Diseases, 18(49), 15-21.
73
Heaton, J. C., & Jones, K. (2008). Microbial contamination of fruit and vegetables and the
behavior of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied
Microbiology, 104, 613-626.
Hsu, W., Simonne, A., & Pongphen, J. (2006). Fates of seedes Escherichia coli O157:H7 and
Salmonella on selected fresh culinary herbs during refrigerated storage. International
Association for Food Prevention, 69(8), 1997-2001.
Kämpfer, P., Reinhardwitzenberger, E. B. M., Busse, H., & Neef, A. (2002).
Novosphingobium hassiacum sp. nov., a New Species Isolated from an Aerated
Sewage Pond. Systematic and applied microbiology, 25 37-45.
Karagözlü, N., Ergönül, B., & Özcan, D. (2011). Determination of antimicrobial effect of
mint and basil essential oils on survival of E. coli O157:H7 and S. Typhimurium in
fresh-cut lettuce and purslane. Food Control, 22, 1851-1855.
Karmali, M. A. (2004). Infection by Shiga Toxin-Producing Eschericia coli. Molecular
Biotechnology, 26, 117-122.
Karmali, M. A., Gannon, V., & Sargeant, J. M. (2010). Verocytotoxin-producing Escherichia
coli (VTEC). Veterinary Microbiology, 140, 360-370.
Khattak, K. F. (2012). Microbiological quality assessment of commercially available
medicinal plants in peshawar city, Pakistan. Pakistan Journal of Botany, 44(4), 12031208.
Kisluk, G., Kalily, E., & Yaron, S. (2013). Resistance to essential oils affects survival of
Salmonella enterica serovars in growing and harvested basil. Environmental
microbiology, 15(10), 2787-2798.
Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In E. Stackebrandt, and Goodfellow, M.,
(Ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics (pp. 115-175). New York, NY:
John Wiley and Sons.
Liu, Z., Wang, B., Liu, Y., & Lium, S. (2005). Novosphingobium taihuense sp. nov., a novel
aromatic-compound-degrading
bacterium
isolated
from
Taihu
Lake,
China.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55, 1229-1232.
Luo, Y., He, Q., & McEvoy, J. L. (2010). Effect of storage temperature and duration on the
behavior of Escherichia coli O157:H7 on packaged fresh-cut salad containing romaine
and iceberg lettuce. Journal of Food Science, 75, 390-397.
Lynch, M. F., Tauxe, R. V., & Hedberg, C. W. (2009). The growing burden of foodborne
outbreaks due to contaminated fresh produce: risks and opportunities. Epidemiological
Infections, 137, 307-315.
74
Matsuyama, H., Kamesaki, T., Sasaki, R., Minami, H., & Yumo, I. (2003). Production of Two
Types of Exopolysaccharide by Novosphingobium rosa. Journal of Bioscience
ingeneering, 95(2), 152-156.
Muyzer, G., de Waal, E. C., & Uitterlinden, A. G. (1993). Profiling of complex microbial
populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain
reaction-amplified genes coding for 16S-rRNA. Applied Environmental microbiology,
59(3), 695-700.
Muyzer, G., & Smalla, K. (1998). Application of denaturing gradient gel electrophoresis
(DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology.
Antonie van Leeuwenhoek, 73, 127-141.
Nataro, J. P., Bopp, C. A., Fields, P. I., Kaper, J. B., & Strockbine, N. A. (2011). Escherichia,
Shigella, and Salmonella. Bacteriology, 35, 603-626.
Novais, R. C., & Thorstenson, Y. R. (2011). The evolution of Pyrosequencing® for
microbiology: From genes to genomes. Journal of Microbiological Methods, 86, 1-7.
Olaimat, A. N., & Holley, R. A. (2012). Factors influencing the microbial safety of fresh
produce: A review. Food Microbiology, 32(1), 1-19
Oxoid. (2014a). Dehydrated Culture Media. Buffered Peptone Water. Geraadpleegd op 14 mei
2014,
op
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0509&org=124
Oxoid. (2014b). Dehydrated Culture Media. Brain Heart Infusion Broth. Geraadpleegd op 14
mei
2014,
op
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM1135&org=133
Pakalniskiene, J., Falkenhorst, G., Lisby, M., Madsen, S. B., Olsen, K. E. P., Nielsen, E. M., .
. . Molbak, K. (2009). A foodborne outbreak of enterotoxigenic E. coli and Salmonella
Anatum infection after a high-school dinner in Denmark, November 2006.
Epidemiological Infections, 137, 396-401.
Pall. (2013). GeneDisc®: Rapid Microbiology System. geraadpleegd op 20 november 2013,
op http://www.pall.com/main/food-and-beverage/product.page?id=20120618145850
PCG. (2012). Gebruik van kruiden. Kruishoutem.
Pennington, H. (2010). Review: Escherichia coli O157. The Lancet, 376, 1428-1435.
Pezzoli, L., Elson, R., Little, C. L., Hopi, Y., Fisher, I., Yishai, R., . . . Threlfall, J. (2008).
Packed with Salmonella - Investigation of an international outbreak of Salmonella
75
senftenberg infection linked to contamination of prepacked basil in 2007. Foodborne
pathogens and disease, 5(5), 661-668.
Postollec, F., Falentin, H., Pavan, S., Combrisson, J., & Sohier, D. (2011). Review: Recent
advances in quantitative PCR (qPCR) applications in food microbiology. Food
Microbiology, 848-861.
RASFF (2014). RASFF Portal - Online searchable database. Geraadpleegd op 3 april 2014
http://ec.europa.eu/food/food/rapidalert/rasff_portal_database_en.htm
Ridderbos, G. J. A. (2006). Levensmiddelenhygiëne (Vol. 8). Maarsen: Elsevier.
Ronaghi, M., & Elahi, E. (2002). Pyrosequencing for microbial typing. Journal of
Chromotography B, 782, 67-72.
Sant'Ana, A. S., Barbosa, M. S., Destro, M. T., Landgraf, M., & Franco, B. D. G. M. (2012).
Growth potential of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in nine types of
ready-to-eat vegetables stored at variable temperature conditions during shelf-life.
International Journal of Food Microbiology, 157, 52-58.
Smith, H. N. (2013). Hydroponic Herb Production
Stenmark, P., & Nordlund, P. (2003). A prokaryotic alternative oxidase present in the
bacterium Novosphingobium aromaticivorans. FEBS Letters, 552, 189-192.
Stevens, M., Ashbolt, N., & Cunliffe, D. (2003). Review of Coliforms - As Microbial
Indicators of Drinking Water Quality. Canberra, Australië
Stopczynska, B. W., & Jadczak, D. (2007). The effect of freezing storage on microbiological
quality of some spice plants. Vegetable crops research bulletin, 66, 85-93.
Suppakul, P., Miltz, J., Sonneveld, K., & Biggers, S. W. (2003). Antimicrobial Properties of
Basil and Its Possible Application in Food Packaging. Journal of Agricultural and
food chemistry, 51, 3197-3207.
Tajkarimi, M. M., Ibrahim, S. A., & Cliver, D. O. (2010). Antimicrobial herb and spice
compounds in food Food Control, 21, 1199-1218.
Tarr, P. I., Gordon, C. A., & Chandler, W. L. (2005). Shiga-toxin-producing Escherichia coli
and haemolytic uraemic syndrome. The Lancet, 365, 1073-1086.
Tian, J.-Q., Young-Min, B., Na-Young, C., Dong-Hyun, K., Sunggi, H., & Sun-Young, L.
(2012). Survival and growth of foodborne pathogens in minimally processed
vegetables at 4 and 15 °C. Journal of Food Science, 71, 48-50.
Tiirola, M. A., Busse, H., Kämpfer, P., & Männistö, M. K. (2005). Novosphingobium lentum
sp. nov., a psychrotolerant bacterium from a polychlorophenol bioremediation process.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55, 583-588.
76
Tomàs-Callejas, A., Lopez-Velasco, G., Camacho, A. B., Artés, F., Artés-Hernandez, F., &
Suslow, T. V. (2011). Survival and distribution of Escherichia coli on diverse freshcut baby leafy greens under preharvest through postharvest conditions. International
Journal of Food Microbiology, 151, 216-222.
Uyttendaele, M., Jacxsens, L., De Loy-Hendrickx, A., Devlieghere, F., & Debevere, J. (2010).
Microbiologische richtwaarden & wettelijke microbiologische criteria. Coupure links
653, B-9000 Gent
Veg-i-Trade. (2010). Veg-i-Trade. Safe food for a changing world. Geraadpleegd op 20 april
2014, op http://www.veg-i-trade.org/index.php
Verbeke, P. (2011). Beknopt marktoverzichtvoor biologische inheemse kruiden in Vlaanderen
en Europa.
Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., & Lane, D. J. (1991). 16S ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology, 173(2), 697-703.
Wetzel, K., Lee, J., Soo Lee, C., & Binkley, M. (2010). Comparision of microbial diversity of
edible flowers and basil grown with organic versus conventional methods. Canadian
Journal Of Microbiology, 56, 943-951.
Whittaker, P. J., Sopwith, W., Quigley, C., Gillespie, I., Willshaw, G. A., Lycett, C., . . .
Syed, Q. (2008). A national outbreak of verotoxin-producing Escherichia coli 0157
associated with consumption of lemon-and-coriander chicken wraps from a
supermarket chain Epidemiological Infections, 137, 375-382.
WHO, & FAO. (2008). Microbiological hazards in fresh leafy vegetables and herbs: meeting
report. Microbiological risk assessment series No 14. Rome.
Wilson, E. B. (2013). Probable Inference, the Law of Succession, and Statistical Inference.
Journal of the American Statistical Association, 22(158), 209-212.
Witkowska, A. M., Hickey, D. K., Alonso-Gomez, M., & Wilkinson, M. G. (2011). The
microbiological quality of commercial herb and spice preparations used in the
formulation of a chicken supreme ready meal and microbial survival following a
simulated industrial heating proces. Food Control, 22, 616-625.
Wojcik-Stopczynska, B., Jakubowska, B., & Reichelt, M. (2009). Microbiological
contamination of dried culinary herbs. Herba polonica, 55(3), 206-213.
Zweifel, C., & Stephan, R. (2012). Spices and herbs as source of Salmonella-related
foodborne diseases. Food Research International, 45, 765-769.
77
Lijst met afkortingen
A
APS
BHI
bp
BPW
BSA
C
CC
DAEC
DGGE
DNA
dATP
dCTP
dGTP
dNTP
dTTP
eae
EAEC
EEA
EHEC
EIEC
EPEC
ETEC
EU
G
GHP
HC
HUS
kve
LabMET
LFMFP
NA
NBP
NGS
Pi
PPi
PPS
(q)PCR
RASFF
RNA
T
TSA
VTEC/STEC
vtx
VRBL
XLD
YOPI
78
Adenine
Adenosinefosfosulfaat
Brain Heart Infusion Broth
Basenparen
Buffered Peptone Water
Bovine Serum Albumine
Cytosine
Chromocult Coliformen Agar
Difuus aanhechtende Escherichia coli
Denaturatie Gradiënt Gelelektroforese
Desoxyribonucleïnezuur
Deoxyadenosinetrifosfaat
Deoxycytidinetrifosfaat
Deoxyguanosinetrifosfaat
Deoxynucleotiden
Thymidinetrifosfaat
Enterocyte attachment effacement
Entero-aggregatieve Escherichia coli
Europese Economische Ruimte
Enterohaemorrhagische Escherichia coli
Entero-invasieve Escherichia coli
Enteropathogene Escherichia coli
Enterotoxigene Escherichia coli
Europese Unie
Guanine
Goede Hygiënische Praktijken
Haemorragische Colitis
Hemolytisch Uremisch Syndroom
Kolonievormende eenheden
Laboratorium voor microbiologische ecologie en technologie
Laboratorium voor levensmiddelenmicrobiologie en conservering
Nalidixine zuur
Neutralized Bacteriological Peptone
Next-generation sequencing
Fosfaat
Pyrofosfaat
Peptone Physiological Salt Solution
(Kwantitatieve) Polymerasekettingreactie
Rapid Alert System For Food and Feed
Ribonucleïnezuur
Thymine
Tryptone Soya Agar
Verocytotoxine producerende Escherichia coli/ Shigatoxine producerende
Escherichia coli
Verocytotoxine
Violet Red Bile Lactose Agar
Xylose Lysine Desoxycholate Agar
Jongeren, bejaarden, zwangere vrouwen en zieken
Lijst met figuren
Figuur 1: Tien grootste importeurs en exporteurs van kruiden en specerijen in 2012 in de Europese
Unie ......................................................................................................................................................... 4
Figuur 2: Samenstelling van de bacteriën aanwezig op biologisch en conventioneel geteelde basilicum
na 16S rRNA sequencing ........................................................................................................................ 5
Figuur 3: Principeschema pyrosequencing ............................................................................................ 6
Figuur 4: Overzicht Salmonella spp..................................................................................................... 12
Figuur 5: Proefopzet analyse basilicum ............................................................................................... 21
Figuur 6: Staalvoorbereiding van basilicum voor DGGE en NGS ...................................................... 25
Figuur 7: Proefopzet overlevingsstudie basilicum ............................................................................... 30
Figuur 8: Analyse van basilicum afkomstig van Cyprus en Israël in de periode van 2 oktober 2013
(week 34) tot en met 4 december 2013 (week 43). ............................................................................... 35
Figuur 9: Optimalisatie van de staalvoorbereiding .............................................................................. 38
Figuur 10: Vergelijking van twee extractiemethoden (Fastprep en EasyMAG) voor gefiltreerde
gewassen en gestomacherde basilicum en na afwassen van de kolonies op TSA, VRBL en XLD. ..... 38
Figuur 11: Natuurlijke microbiota op basilicum I, II, III na wassen met Tween®80 en/of stomacheren
............................................................................................................................................................... 40
Figuur 12: Resultaat afgewassen kolonies van basilicumpartijen I, II een III op TSA, XLD en VRBL
............................................................................................................................................................... 41
Figuur 13: Gestomacherde basilicum I en II en hun aanrijking in BPW bij 37 °C na 5 uur, 20,5 uur en
28 uur voor basilicum II en na drie dagen voor basilicum I .................................................................. 44
Figuur 14: Opvolgen van het aeroob mesofiel kiemgetal en de algemene visuele kwaliteit op
basiliucm IV en basilicum V gedurende veertien dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15
°C en 22 °C) .......................................................................................................................................... 46
Figuur 15: Resultaat DGGE van basilicum IV en V gedurende veertien dagen bewaren bij drie
verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) .............................................................................. 47
Figuur 16: Algemene visuele kwaliteit van basilicum geïnoculeerd met E. coli O157 of met
Salmonella Thompson en Typhimurium gedurende acht dagen bij drie verschillende temperaturen (7
°C, 15 °C en 22 °C). .............................................................................................................................. 48
Figuur 17: Overleving van E. coli O157 op basilicum gedurende acht dagen bij drie verschillende
temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) ..................................................................................................... 51
Figuur 18: Overleving van Salmonella Thompson en Typhimurium op basilicum gedurende acht
dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C)........................................................ 51
Figuur 19: Algemene visuele kwaliteit van kropsla, spinazie en baby leaves geïnoculeerd met E. coli
O157 of met Salmonella Thompson en Typhimurium gedurende drie dagen bij drie verschillende
temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) ..................................................................................................... 53
Figuur 20: Opvolgen van het zuurstofgehalte en het koolstofdioxidegehalte bij verpakte kropsla onder
lucht geïnoculeerd met E. coli O157 of met Salmonella Thompson en Typhimurium gedurende drie
dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C)........................................................ 55
79
Figuur 21: Opvolgen van het zuurstofgehalte en het koolstofdioxidegehalte bij verpakte spinazie
onder lucht geïnoculeerd met E. coli O157 of met Salmonella Thompson en Typhimurium gedurende
drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) ................................................ 55
Figuur 22: Opvolgen van het zuurstofgehalte en het koolstofdioxidegehalte bij verpakte baby leaves
onder lucht geïnoculeerd met E. coli O157 of met Salmonella Thompson en Typhimurium gedurende
drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) ................................................ 55
Figuur 23: Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium op kropsla
gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) ............................... 57
Figuur 24: Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium op spinazie
gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) ............................... 57
Figuur 25: Overleving van E. coli O157 en Salmonella Thompson en Typhimurium op baby leaves
gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) ............................... 58
Figuur 26: Merkers van stalen Bio-Rad ............................................................................................... 89
Figuur 27: Merkers van stalen INGENYphorU ................................................................................... 89
Figuur 28: Vergelijking resultaat verschillende verdunningen ............................................................ 90
80
Lijst met tabellen
Tabel 1: Overzicht geweigerde stalen en alarmerende stalen van basilicum van 01/01/2000 tot en met
01/04/2014 ............................................................................................................................................... 7
Tabel 2: Overzicht uitbraken Salmonella spp. bij basilicum .................................................................. 8
Tabel 3: Invloed van de temperatuur op de overleving van Salmonella spp. en VTEC op bladgroenten
en kruiden .............................................................................................................................................. 18
Tabel 4: Basilicumpartijen ................................................................................................................... 24
Tabel 5: Samenstelling van de mastermix voor één staal ..................................................................... 27
Tabel 6: Prevalentie PCR-positieve Salmonella spp. en EHEC ........................................................... 36
Tabel 7: Resultaten uitplatingen van de verschillende basilicumpartijen............................................. 39
Tabel 8: Resultaten na 16S rRNA sequencing van gewassen en/of gestomacherde basilicumstalen I, II
en III ...................................................................................................................................................... 42
Tabel 9: Resultaten na 16S rRNA sequencing van kolonies op TSA, XLD en VRBL. ....................... 43
Tabel 10: Resultaten na 16S rRNA sequencing van basilicumaanrijkingen van partij I en II in BPW
bij 37 °C ................................................................................................................................................ 45
Tabel 11: Frequentietabel van de belangrijkste parameters van de visuele kwaliteit van basilicum
geïnoculeerd met E. coli O157 of met Salmonella Thompson en Typhimurium gedurende acht dagen
bij drie verschillende temperaturen (7 °C, 15 °C en 22 °C) .................................................................. 49
Tabel 12: Frequentietabel van de visuele kwaliteit van kropsla geïnoculeerd met E. coli O157 of met
Salmonella Thompson en Typhimurium gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7
°C, 15 °C en 22 °C).. ............................................................................................................................. 53
Tabel 13: Frequentietabel van de visuele kwaliteit van spinazie geïnoculeerd met E. coli O157 of met
Salmonella Thompson en Typhimurium gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen (7
°C, 15 °C en 22 °C).. ............................................................................................................................. 54
Tabel 14: Frequentietabel van de visuele kwaliteit van baby leaves geïnoculeerd met E. coli O157 of
met Salmonella Thompson en Typhimurium gedurende drie dagen bij drie verschillende temperaturen
(7 °C, 15 °C en 22 °C) ........................................................................................................................... 54
Tabel 15: Samenstelling buffers DGGE ............................................................................................... 87
Tabel 16: Samenstelling gels DGGE .................................................................................................... 87
81
Bijlagen
Bijlage 1: Proefopzet
Bijlage 2: Protocol DNA-extractie Fastprep 96TM
Bijlage 3: Protocol DNA-extractie NucliSENS® EasyMAG®
Bijlage 4: Protocol DGGE met Bio-Rad en INGENY phorU
Bijlage 5: Resultaten DGGE
82
BIJLAGE 1:
Proefopzet
BIJLAGE 2:
Protocol DNA-extractie Fastprep 96TM
0,5 g staal in een lyse tube + 200 mg glasparels (0,10 - 0,11 mm diameter; Sartorius,
Duitsland) + 1 ml lysebuffer (100 mM Tris pH 8, 100 mM EDTA pH 8, 100 mM NaCl,
1 % polyvenylpyrrolidone, 2 % sodium dodecyl sulfaat, water)
Breng deze lysetubes over in de fastprep en laat twee keer schudden gedurende 40
seconden bij 1600 tpm
Centrifugeer de stalen gedurende 5 minuten aan de maximale snelheid (14680 tpm)
Breng het supernatans over in een nieuw effendorfbuisje van 2,0 ml en voeg 500 µl
fenol:chloroform (Sigma-Aldrich, Belgium) toe
Meng de stalen krachtig en vortex gedurende 1 minuut
Centrifugeer de stalen gedurende 1 minuut aan de maximale snelheid (14680 tpm)
Breng het supernatans over in een nieuw eppendorfbuisje van 2,0 ml en voeg 700 µl
chloroform (Analar Normapur, Frankrijk) toe
Meng de stalen krachtig
Centrifugeer de stalen gedurende 1 minuut aan de maximale snelheid (14680 tpm)
Breng het supernatans (< 900 µl) over in een nieuw eppendorfbuisje van 2,0 ml en voeg
90 µl natriumacetaat (3 M) toe, schud en voeg vervolgens 1,0 ml isopropyl alcohol (- 20
°C; Analar Normapur, Frankrijk) toe
Meng de eppendorfbuisjes door ze verschillende malen om te keren
84
Bewaar de stalen gedurende minimum 1 uur bij - 20 °C
Centrifugeer bij 4 °C gedurende 30 minuten aan de maximale snelheid (12700 tpm)
Droog de bekomen pellet door het eppendorfbuisje om te keren op papier en de buisjes
daarna enkele minuten open te laten staan aan de lucht
Los de pellet opnieuw op in 50 µl PCR water (Sigma-Aldrich Life Sciences, USA) en
homogeniseer het staal door enkele keren op en neer te pipetteren
85
BIJLAGE 3:
Protocol DNA-extractie NucliSENS® EasyMAG®
Schakel het toestel en ook de computer aan wanneer het lichtje van het toestel groen
kleurt
Stel het toestel in. Het protocol dat gebruikt wordt is het algemene protocol 2.0.1 (onboard lysis). Er wordt telkens gestart van een staalvolume van 500 µl en er wordt een
eluaat van 25 µl bekomen
Plaats de houders en de pippettips in het toestel
Scan de barcodes van het toestel, de houders en van de reagentia
Laad de stalen door 500 µl van elk staal in een houder te pipetteren
Sluit de kast en start het toestel. Wacht 10 minuten tot het eerste deel van de extractie
afgerond is
Voeg per houder 50 µl magnetische silica toe. Schud hierbij de silica zeer goed voor
gebruik
Meng de magnetische silica goed met het staal door enkele malen op en neer te
pipetteren tot een homogene vloeistof bekomen wordt
Start het toestel en wacht gedurende 40 minuten tot de DNA extractie vervolledigd is
Neem de 25 µl eluaat uit de houders en breng het in een gesterilliseerd eppendorfbuisje.
Let hierbij op dat de silicapartikels niet aangeraakt worden
86
BIJLAGE 4:
Protocol DGGE met Bio-Rad en INGENY phorU
1. Aanmaken buffers
Er is een 60 % en 0 % denaturatiebuffer nodig voor het aanmaken van de 60 % - 45 % gel.
Aan de hand van deze twee buffers (60 % en 0 %), kan ook een 45 % oplossing aangemaakt
worden. Tabel 16 geeft de samenstelling van de 60 % en 0 % buffer weer. De verschillende
verhoudingen van de componenten worden weergegeven in percentages.
Tabel 15: Samenstelling buffers DGGE
60 % denaturatiebuffer
0 % denaturatiebuffer
Acrylamide (40 %; Bio-Rad, China)
20 %
20 %
Bisacrylamide (2 %; Bio-Rad, USA)
5%
5%
Ureum (Sigma-Aldrich, Duitsland)
25 %
/
Formamide (AplliChem, Duitsland)
24 %
/
TAE
(50
X
stock;
AppliChem, 2 %
2%
Duitsland)
Milli-Q water
24 %
73 %
Naast de buffers, zijn er nog twee andere stoffen die nodig zijn voor het maken van een gel bij
DGGE, namelijk N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED; AppliChem, Duitsland)
en ammoniumpersulfaat (APS; Bio-Rad, Japan). De ammoniumpersulfaat wordt steeds vers
aangemaakt. Hiervoor wordt 0,1 g ammoniumpersulfaat afgewogen en aangelengd met 1 ml
Milli-Q-water.
2. Aanmaken gel
Het aanmaken van de gel gebeurt in drie stappen. Er wordt gestart met een bodem gel om het
geheel af te sluiten als de gradiënt gel er opgebracht wordt. Als laatste wordt nog een toplaag
gemaakt.
Tabel 16: Samenstelling gels DGGE
Bodem gel Gradiënt gel
INGENY
buffer
60 %
45 %
0%
APS
TEMED
1,5 ml
30 µl
1,5 µl
24 ml
24 ml
130 µl
10 µl
Top gel
5 ml
100 µl
5 µl
Bodem gel Gradiënt gel Top gel
BIO-RAD (Grote/ kleine welletjes)
1 ml/1,5 ml
-
20 µl/30 µl
1 µl/1,5 µl
10 ml/12 ml
10 ml/12 ml
1 ml/1,5 ml
41,6 µl/50 µl 20 µl/30 µl
4,16 µl/5 µl 1 µl/1,5 µl
87
Per plaat wordt bodem gel toegevoegd, samengesteld uit 60 % denaturatiebuffer, APS en
TEMED (Tabel 16) om de bodem af te dekken. Daarna wordt een stoltijd van 15 minuten
vereist.
Vervolgens wordt de gradiënt gel gemaakt met behulp van de 60 % en 45 %
denaturatiebuffer. De denaturatiebuffers (45 % en 60 %) met de APS en TEMED worden elk
in een reservoir van de gradiëntmaker gebracht. Met behulp van een pomp en wordt de
gradiënt opgebouwd en via een naald wordt de gel tussen de grote en de kleine plaat van de
DGGE-opstelling gebracht. Na deze stap wordt 1 tot 2 ml Milli-Q-water op de gel gebracht en
wordt de gel afgedekt gedurende 2 uur met aluminiumfolie.
Tenslotte wordt de top gel toegevoegd na verwijderen van het Milli-Q water tot de kammen
volledig onder staan met gel. Deze is samengesteld uit de 0 % denaturatiebuffer, APS en
TEMED. Nadien is opnieuw een stoltijd van 15 minuten noodzakelijk.
3. Laden
De tank moet minstens een uur op voorhand aangezet worden, zodat het toestel kan
opwarmen tot de starttemperatuur van 60 °C. In tussentijd wordt de gel geladen met de stalen
en merkers. Nadien wordt de opstelling met de gel in de tank gebracht voor 16 uur bij 60 °C
en 120 V (INGENY) of 38 V (Bio-Rad).
4. Visualisatie
Vervolgens worden de bandjes gevisualiseerd met behulp van SYBR Green (life technologies,
USA). De gel wordt hierbij 20 minuten in een bad met 200 ml TAE-buffer (1 X) en 14 µl
kleurstof gebracht. Tenslotte worden de resultaten geanalyseerd met BioNumerics software
5.10 (Applied Maths, Belgium). De verschillende laantjes worden gedefinieerd en alle gels
worden genormaliseerd door de gebruikte merkers te standaardiseren.
88
Pearson correlation [17.4%-97.2%]
DGGE biorad 16b
DGGE biorad 16b
100
95
Resultaten DGGE
90
85
80
BIJLAGE 5:
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
Pearson correlation [17.4%-97.2%]
DGGE biorad 16b
DGGE biorad 16b
.
Marker
.
Marker
100
95
90
85
Figuur 26: Merkers van stalen Bio-Rad
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
.
Marker
Figuur 27: Merkers van stalen INGENYphorU
89
Pearson correlation [17.4%-97.2%]
DGGE biorad 16b
100
50
0
-50
DGGE biorad 16b
.
Basil
I enrichment in BPW at 37°C for 3 days
.
tenfold
diluted
.
.
Basil
I enrichment in BPW at 37°C for 3 days
.
undiluted
.
.
Basil
I colonies TSA
.
tenfold
diluted
.
.
Basil
I colonies TSA
.
undiluted
.
.
Basil
II enrichment in BPW at 37°C for 28 h
.
hundredfold
diluted
.
.
Basil
II enrichment in BPW at 37°C for 28 h
.
tenfold
diluted
.
.
Basil
II enrichment in BPW at 37°C for 20.5 h
.
hundredfold
diluted
.
.
Basil
II enrichment in BPW at 37°C for 20.5 h
.
tenfold
diluted
.
.
Basil
II stomacher
.
hundredfold
diluted
.
.
Basil
II stomacher
.
tenfold
diluted
.
.
Basil
I stomacher
.
hundredfold
diluted
.
.
Basil
I stomacher
.
tenfold
diluted
.
.
Basil
I stomacher
.
undiluted
.
.
Basil
I stomacher
.
undiluted
.
.
Basil
I stomacher
.
tenfold
diluted
.
.
Basil
I stomacher
.
hundredfold
diluted
.
.
Basil
I wash
.
tenfold
diluted
.
.
Basil
I wash
.
undiluted
.
Figuur 28: Vergelijking resultaat verschillende verdunningen. Al deze stalen ondergingen een Fastprep extractie.
90

afhaalmenu - NakHon Thai

alc kaart serre restaurant herfstkaart 2014

Bekijk de menukaart

Juli 2014 - Booijink Veevoeders

menu ron den broeder

oktober 2014 menu Minipizza met gamba en pesto

Pippas strooifolder 13102014a-2

PRODUCTSPECIFICATIE