Summary

Summary
Cell adhesion is a fundamental event in the microbial life cycle. It allows survival in
different ways and it is mediated by molecular entities, which are present on the cell surface, ready
to interact with other cellular counterparts or, in general, with external substrates. In many cases,
adhesion is mediated by cell-surface proteins, whose structure and extracellular localization allows
them to readily interact with other proteins, carbohydrates or even abiotic surfaces, such as plastic
or metal.
Yeast cells, common organisms found in human environments and also in the human body,
take advantage of these interactions either for ‘’self-defense’’, in conditions that are not favorable
for life, or for opportunistic ‘’offense’’, aimed to the invasion and colonization of their host. This
may result, for example, in the formation of large cell aggregates in liquid environments in the case
of self-defense (survival), or in the adhesion to host tissues in the case of offense. Yeasts of the
Saccharomyces genus and, in particular, S. cerevisiae are well known for their wide utilization in
bakery as well as wine and beer brewing processes. The ability of brewer’s yeast to form cell
clumps and separate from the liquid phase at the end of the beer fermentation, also known as
‘’flocculation’’, is an appreciated characteristic by brewers, since it allows the easy separation of
yeast cells from the beer product by simple sedimentation. On the contrary, the yeasts of the
Candida genus represent an emerging clinical concern, especially the opportunistic yeasts C.
albicans and C. glabrata. Although they are part of the microbial flora of every healthy individual,
they are also able to cause a wide range of infectious diseases in case of immune system failure,
since they are able to efficiently adhere to cells and tissues, including epithelial and endothelial
tissues.
The mentioned adhesion processes, both in Saccharomyces and Candida yeast families, are
mediated by glycosylphosphatidylinositol - anchored cell-wall proteins (GPI-CWPs), which extend
from the cell wall towards the extracellular environment and can specifically interact with
carbohydrate molecules. These ligands are present on the surface of yeast adhesion counterparts as
glycans of varying length, composition and connectivity.
In S. cerevisiae and the closely related S. pastorianus, the expression of FLO (from
flocculation) genes leads to the production of different GPI-CWP adhesins, or flocculins, endowed
with a calcium-dependent lectin activity, and which are able to bind mannose and mannosecontaining glycans, such as cell-wall mannans. On the other hand, in C. glabrata the EPA genes
(from epithelial adhesin) encode a large set of GPI-CWP proteins which mostly recognize
galactose-containing molecules and especially mucin-type glycans.
Although Flo and Epa proteins are characterized by different carbohydrate specificities – as
they promote two different in vivo behaviors – they share a common structural feature, which
resides in the N-terminal regions of their amino acid sequence. In these regions, the PA14 domains
play a major role in carbohydrate recognition. The PA14 domains are found in both Flo and Epa
adhesin families and have moderate sequence homology. Furthermore, these are widespread in
nature, since they involved in carbohydrate recognition, as parts of a large number of diverse
proteins from both eukaryotic and prokaryotic organisms.
In this work, a combined structural and functional study of the N-terminal PA14 domains
from Flo and Epa adhesins (N-Flo-p and N-Epa-p) was performed. The production and
crystallization of N-Flo1p from S. cerevisiae, N-Lg-Flo1p from S. pastorianus and N-Epa1p from C.
glabrata are described and the 3D-structures of these carbohydrate-binding domains in complex
with their carbohydrate ligands are presented and linked to their respective biological functions. It
is shown that these Flo and Epa N-terminal lectin domains have a β-sandwich topology, which is a
characteristic of the PA14 family, and a unique calcium-binding DcisD peptide, which establishes
interactions both with calcium and the carbohydrate ligand. In all considered structures, calcium is
directly involved in the binding mechanism.
In the case of Flo proteins, an in-depth analysis of the flocculation mechanism is performed,
by defining the carbohydrate specificities of N-Flo-p and N-Epa-p and by investigating with a
multidisciplinary approach the self-interactions of mannosylated N-Flo1p and mannans
themselves. The obtained results elucidate the role played by glycosylated flocculins and glycans
in yeast cell-cell adhesion processes. Two types of interactions are possible between yeast
flocculins: protein-glycan interactions, based on the recognition of mannans by N-Flo1p and N-LgFlo1p carbohydrate-binding sites, and glycan-glycan interactions, which take place between
flocculin mannose-containing N-glycans. Calcium is fundamental in both types of interactions.
Concerning Epa proteins, a new method is presented to predict the binding receptors in the
human host. Binding of Epa1p to glycoproteins usually found in human tissues, such as
fibronectin and mucin, is evaluated. Affinities in the micromolar range are observed for the
interactions of the adhesins with both glycoproteins, and the glycan-mediated binding mechanism
is confirmed. Additionally, glycan specificities of different Epa proteins and also Als adhesins from
the pathogenic yeast C. albicans are analyzed in a ‘’glycomics interaction network’’. This is a novel
network strategy, which has the purpose to link experimental lectin-glycan interaction data with
glycoproteomics online databases, and to discover the potential glycoprotein ligands mediating
Candida adhesion to human tissues. Moreover, engineering of the N-Epa1p carbohydrate binding
site, performed to enhance the adhesin binding affinity towards fibronectin, is reported. It is
demonstrated how single amino acid changes in key regions for carbohydrate recognition can
sensibly affect both interaction strength and specificity. N-Epa1p variants, able to recognize
sulfated glycans, are therefore described as results of the adhesin engineering.
In the last part of this thesis, we describe for the first time the antiviral activity of another
mannose-specific adhesin, i.e. the FimH adhesin from Escherichia coli. We demonstrate that the
lectin domain of FimH (FimH-Ld) from bacterial fimbriae can bind the HIV gp120 envelope
protein and possesses in vitro anti-HIV activity. These results suggest the potential application of
this lectin domain as a compound for anti-HIV prophylaxis, and stimulate the study of the
antiviral properties of other carbohydrate-binding adhesins.
Samenvatting
Celadhesie is een belangrijke gebeurtenis in de microbiële levenscyclus. Het laat overleving toe en
wordt bewerkstelligd door moleculen op het celoppervlak, die met andere cellulaire componenten
of met externe substraten kunnen interageren. In veel gevallen wordt adhesie gemedieerd door
celoppervlakte-eiwitten, die dankzij hun structuur en extracellulaire lokalisatie gemakkelijk
kunnen interageren met andere eiwitten, koolhydraten of abiotische oppervlakken zoals kunststof
of metaal.
Gistcellen, die veel voorkomen in een menselijke omgeving en ook in het menselijk
lichaam, profiteren van deze interacties hetzij voor ''zelfverdediging'' in ongunstige
omstandigheden of voor opportunistische acties gericht op de invasie en kolonisatie van hun
gastheer. Dit leidt bijvoorbeeld tot de vorming van grote celaggregaten in vloeibare milieus bij
“zelfverdediging” (overleving), of tot de hechting aan gastheerweefsels bij “aanval”. Gisten van
het geslacht Saccharomyces, en in het bijzonder S. cerevisiae, staan bekend om hun gebruik in de
bakkerij evenals in gistingsprocessen (wijn- en bierproductie). Het vermogen van de gistcellen om
te klonteren en zo gescheiden te worden van de vloeibare fase aan het einde van de gisting
(flocculatie), is een gewaardeerd kenmerk voor brouwerijen, aangezien het een eenvoudige
scheidingsmethode is om de gistcellen uit het bier te verwijderen. Integendeel, de gist van het
Candida-geslacht (vooral de opportunistische gisten C. albicans en C. glabrata) betreft een
opkomende klinische bedreiging. Hoewel ze deel uitmaken van de darmflora van ieder gezond
individu, kunnen ze ook diverse infectieziekten veroorzaken bij immuundeficiënte patiënten,
omdat ze kunnen hechten aan cellen en weefsels, waaronder epiteel- en endoteelweefsel.
De bovenstaande adhesieprocessen, zowel in de Saccharomyces- en Candida-gistfamilies,
worden gemedieerd door glycosylfosfatidylinositol-verankerde celwandeiwitten (GPI-CWP), die
zich uitstrekken van de celwand naar het extracellulaire milieu en kunnen specifiek interageren
met carbohydraten. Deze liganden bevinden zich op het oppervlak van gistcellen onder de vorm
van glycanen met variabele lengte, samenstelling en verbindingen.
In S. cerevisiae en de nauw verwante S. pastorianus, leidt de expressie van FLO- (van
flocculatie) genen tot de productie van verschillende GPI-CWP-adhesinen of flocculinen. Zij
bezitten een calciumafhankelijke lectineactiviteit, en kunnen mannose en mannosebevattend
glycanen binden: zoals mannanen van het celoppervlak. Anderzijds, in C. glabrata coderen de EPAgenen (van epitheleeladhesine) voor een grote set van GPI–CWP. Deze eiwitten herkennen meestal
galactosebevattende moleculen en vooral mucineachtige glycanen.
Hoewel
Floen
Epa-eiwitten
worden
gekenmerkt
door
verschillende
koolhydraatspecificiteiten, delen ze een gemeenschappelijk structureel kenmerk, nl. hun Nterminale domeinen. In dit domein speelt het PA14-domein een belangrijke rol in de herkenning
van koolhydraten. De PA14-domeinen worden in zowel de Flo- als de Epa-adhesinefamilie
aangetroffen, en hebben een matige homologie. Voorts zijn deze wijdverspreid in de natuur,
omdat ze betrokken zijn bij koolhydraatherkenning als onderdeel van een groot aantal
verschillende eiwitten uit zowel eukaryote en prokaryote organismen.
Een gecombineerde structurele en functionele studie van de N-terminale PA14-domeinen
van Flo- en Epa-adhesinen (N-Flo-p and N-Epa-p) werd uitgevoerd. De productie en de
kristallisatie van N- Flo1p van S. cerevisiae, N-Lg-Flo1p van S. pastorianus en N-Epa1p van C.
glabrata zijn beschreven en de 3D-structuren van deze koolhydraatbindende domeinen in complex
met hun koolhydraatliganden worden beschreven en gekoppeld aan hun respectievelijke
biologische functies. Deze Flo- en Epa-N-terminale lectinedomeinen vertonen een βsandwichtopologie, die kenmerkend is voor de PA14-familie, alsook een uniek calciumbindend
peptide DcisD, dat verantwoordelijk is voor zowel interacties met calcium en als met de
koolhydraatliganden. In alle beschouwde structuren is calcium rechtstreek betrokken in het
bindingsmechanisme .
In het geval van de Flo-eiwitten werd een grondige analyse van het flocculatiemechanisme
uitgevoerd door het bepalen van de koolhydraatspecificiteiten voor N-Flo-p and N-Epa-p, alsook
het bestuderen van de zelf-interacties van gemannosyleerd N-Flo1p en N-Flo1p-glycanen. De
verkregen resultaten verduidelijken de rol van de geglycosyleerde flocculinen en van de glycanen
in de cel-celadhesieprocessen. Twee soorten interacties zijn mogelijk tussen flocculinen: eiwitglycaaninteracties, die gebaseerd zijn op de herkenning van mannanen door de
carbohydraatbindingsplaatsen van N-Flo1p en N-LgFlo1p, en glycaan-glycaaninteracties, die
plaatsvinden tussen de mannosebevattende N-glycanen. Calcium is essentieel in beide
interactietypes.
Een nieuwe methode, die de bindende receptoren van Epa-eiwitten in de menselijke
gastheer voorspelt, wordt gepresenteerd. De binding van Epa1p aan glycoproteïnen van
menselijke weefsels, zoals fibronectine en mucine, wordt geëvalueerd. Affiniteiten in het
micromolaire gebied werden waargenomen voor de interacties van de adhesines met beide
glycoproteïnen, en het glycaan-gemedieerde bindingsmechanisme wordt bevestigd. Daarnaast
worden de glycaanspecificiteiten van verschillende Epa-eiwitten en ook Als-adhesines van de
pathogene gist C. albicans geanalyseerd in het “glycomicsinteractienetwerk”. Deze nieuwe strategie
heeft
als
doel
om
experimentele
lectine-glycaaninteracties
te
koppelen
aan
glycoproteomicadatabanken, en om de potentiële liganden, die de Candida-hechting aan menselijke
weefsels kunnen bewerkstelligen, te ontdekken. Bovendien werd de N-Epa1pkoolhydraatbindingsplaats geëngineerd zodat de affiniteit voor fibronectine werd verhoogd. Er
werd aangetoond dat de verandering van afzonderlijke aminozuren in de belangrijkste regio's
voor de herkenning van koolhydraten in de bindingsite, zowel de interactiesterkte als de affiniteit
kan beïnvloeden. N-Epa1p-varianten werden bekomen, die in staat zijn om gesulfateerde glycanen
te herkennen.
In het laatste deel van dit proefschrift wordt voor het eerst de antivirale activiteit van een
mannose-specifiek adhesine, nl. het FimH-adhesine van Escherichia coli, beschreven. Het lectinedomein van FimH (FimH-Ld) van bacteriële fimbriae kan met het gp120-enveloppe-eiwit van HIV
binden, en bezit een in vitro anti-HIV-activiteit. Deze resultaten suggereren de mogelijke
toepassing van dit lectinedomein als “entry inhibitor”, en stimuleren de studie van de antivirale
eigenschappen van andere koolhydraatbindende adhesinen.

Download Report