2014_Richtlijn Moleculaire Diagnostiek

NVMM-richtlijn voor Moleculaire
Diagnostiek van Infectieziekten
Opgesteld door:
Werkgroep Moleculaire Diagnostiek van Infectieziekten
(WMDI) van de Nederlandse Vereniging voor Medische
Microbiologie (NVMM)
Versie 2.1 definitief na accordering ALV
16 april 2014
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
1/17
INHOUDSOPGAVE
1.
INTRODUCTIE
pagina 3
2.
PERSONEEL EN OPLEIDING
pagina 4
3.
LABORATORIUM
pagina 5
4.
ONDERHOUD EN SCHOONMAAK
pagina 9
5.
VALIDATIE
pagina 10
6.
CONTROLES EN KWALITEITSBORGING
pagina 13
7.
LITERATUUR
pagina 16
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
2/17
1.
INTRODUCTIE
De richtlijn voor Moleculaire Diagnostiek van Infectieziekten is een document dat
door de Werkgroep Moleculaire Diagnostiek van Infectieziekten (WMDI) van de
Nederlandse Vereniging voor Medische Microbiologie (NVMM) is opgesteld.
In 2006 is een eerste richtlijn getiteld “Basic requirements for reliable performance of
nucleic acid amplification based methods for diagnosis of infectious diseases”,
gepubliceerd door de WMDI . Binnen de huidige moleculaire diagnostiek volgen de
ontwikkelingen zich zodanig snel op, dat een revisie van voorgaande noodzakelijk is
geworden. Het opgestelde document richt zich op de moderne moleculaire
diagnostiek en is gebaseerd op de expertise vanuit de Nederlandse praktijk.
Moleculaire technieken, in het bijzonder nucleïnezuur amplificatie- en detectie
methoden, zijn een wezenlijk onderdeel van medisch microbiologische laboratoria.
Het betreft hoofdzakelijk op PCR-gebaseerde methoden, maar kan ook RNA
amplificatie (TMA, NASBA) omvatten. Daarnaast worden op hybridisatie en/of
sequentie analyse gebaseerde technieken breed ingezet voor de identificatie,
genotypering en resistentiebepaling van micro-organismen. Voor de leesbaarheid
wordt in dit document de term PCR gebruikt, maar worden ook de andere
detectiemethoden bedoeld.
In deze richtlijn worden aanbevelingen geformuleerd met betrekking tot personeel,
laboratorium infrastructuur, en de uitvoering van moleculaire testen waarmee
betrouwbare moleculaire diagnostiek kan worden gerealiseerd. De richtlijn betreft
laboratoriumdiagnostiek en geen “bedside testing” (diagnostiek bij de patiënt aan bed
buiten het laboratorium).
Dit stuk dient dan ook als leidraad voor laboratoria die moleculaire diagnostiek
toepassen of willen implementeren Het veld is zeer sterk in beweging en
ontwikkelingen binnen geautomatiseerde gesloten systemen zijn volop gaande.
Daarnaast komen er steeds meer IVD en/of CE-gemarkeerde, commerciële testen
beschikbaar, soms in combinatie met specifieke apparatuur. Afhankelijk van de
gebruikte apparatuur en diagnostische testen, kunnen werkwijzen en maatregelen t.a.v.
betrouwbare moleculaire diagnostiek verschillen per laboratorium. De richtlijn biedt
hiervoor een leidraad en onderschrijft het belang van benodigde expertise om de juiste
afwegingen en keuzes te kunnen maken m.b.t. noodzakelijke werkwijzen en
maatregelen.
Voor algemene aspecten ten aanzien van laboratoriumorganisatie, logistiek,
kwaliteitsmanagement, onderhoud, validatie, etc. wordt verwezen naar de CCKL
praktijkrichtlijn of de ISO17025:2005 of ISO15189:2012, naar gelang de accreditatie
van het laboratorium.
DOELSTELLING
Definiëren van aanbevelingen voor betrouwbare uitvoering van medisch moleculaire
laboratoriumdiagnostiek van infectieziekten.
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
3/17
2.
PERSONEEL EN OPLEIDING
De vakinhoudelijke verantwoordelijkheid voor de uitvoering van de moleculaire
diagnostiek ligt bij een vakspecialist in de moleculaire diagnostiek van infectieziekten,
zijnde een medisch moleculair microbioloog (MMM), dan wel een arts-microbioloog.
De medische verantwoordelijkheid voor moleculaire diagnostiek van infectieziekten
ligt bij de arts-microbioloog.
De analisten zijn voldoende opgeleid, ingewerkt en bekwaam in de moleculaire
diagnostiek.
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
4/17
3.
LABORATORIUM
3.1 Algemeen
Gezien de hoge sensitiviteit van de moleculaire diagnostiek en het daarmee
samenhangende risico voor fout-positieve resultaten als gevolg van contaminatie,
vinden de moleculair diagnostische activiteiten plaats in verschillende van elkaar
gescheiden laboratoriumruimten, die zijn onder te verdelen in, maar niet noodzakelijk
als zodanig beschikbaar in elk laboratorium:
- Schone ruimte (Ruimte 1).
- Nucleinezuur isolatie ruimte en PCR set up (Ruimte 2). Hierin wordt DNA en RNA
geïsoleerd.
- PCR en Post-PCR analyse ruimte (Ruimte 3 of gescheiden in Ruimten 3a en 3b.
Ruimte 3a bevat gesloten amplificatiesystemen, terwijl in Ruimte 3b met onder andere
amplicons wordt gewerkt).
Er komen meer gesloten systemen op de markt die het hele proces van isolatie,
amplificatie en detectie combineren. Met deze CE/IVD gesloten systemen wordt hier
bedoeld het gebruik van één gesloten cartridge (bijvoorbeeld GeneExpert en
FilmArray), maar ook systemen die met een robotarm het proces uitvoeren
(bijvoorbeeld de COBAS AmpliPrep - COBAS TaqMan combinatie), of die beperkte
manuele handelingen vereisen maar toch de platen automatisch sealen (bijvoorbeeld
de COBAS4800 en LC480). Het is te verwachten dat meer van dit soort “all-in-one “
systemen de markt zullen bereiken. De ervaring hiermee is beperkt en het
laboratorium moet hier zelf een risico-inschatting voor maken.
Aanbevelingen:
Ruimten en apparatuur:
 Een laboratorium heeft een schone PCR ruimte (ruimte 1) waar stocks van de
primers en probes en de reagentia zijn opgeslagen en worden uitgevuld.
 Indien niet met zogenaamde gesloten systemen wordt gewerkt, is het aan te
bevelen om tenminste 3 afzonderlijke ruimten beschikbaar te hebben. Idealiter
wordt er in een één-directionele werkrichting van schone ruimte (ruimte 1)
naar monsteropwerking (ruimte 2) en (post)-PCR (ruimte 3a en 3b) gewerkt,
maar dit is afhankelijk van de risico inschatting van het laboratorium. Aantal
monsters, bepalingen, en prevalentie kunnen hierbij worden betrokken.
 In laboratoria waar met gesloten systemen gewerkt wordt waarin het hele
proces van isolatie tot en met amplificatie en detectie wordt uitgevoerd, kan
met 1 ruimte worden volstaan.
 In laboratoria waar met amplificatieproducten, virus-isolaten of
bacteriestammen gewerkt wordt, zijn 3 afzonderlijke ruimten beschikbaar. In
dit geval moet rekening gehouden worden met een verhoogd risico op
contaminatie.
 Elke ruimte is voorzien van eigen apparatuur, pipetten, centrifuge, koelkast en
vriezer.
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
5/17
Werkwijze:
 Er dienen maatregelen genomen te worden om fout-positieve resultaten te
voorkomen, zoals tenminste:
o Bij het inzetten van een PCR (bereiden reagentia, nucleïnezuurisolatie
en assay set-up) wordt met filtertips of ‘positieve displacement’ tips
gewerkt..
o Gebruik van handschoenen, handen wassen en gebruik van aparte
laboratoriumjassen per ruimte.
o Voor het schoonhouden van ruimtes zie paragraaf 4.2.
 Een goed gedocumenteerde instructie van de werkwijze moet plaatsvinden
alvorens medewerkers starten met het uitvoeren van moleculaire diagnostische
methoden.
 Er is een procedure waarin is vastgelegd hoe te handelen bij calamiteiten zoals
contaminatie.
Gewenst:
 De schone ruimte (ruimte 1) heeft overdruk, de post-PCR ruimte (ruimte 3b)
heeft onderdruk. In deze ruimte 3b wordt met amplificaten verder gewerkt.
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
6/17
Specifieke opmerkingen per ruimte:
Ruimte 1: Schone ruimte
Activiteiten:
- Opslag en aliquoteren van stock-reagentia, primers en probes
Aanbeveling:
- Uitvullen en opslag in batches
- Geen klinische materialen en geïsoleerd DNA of RNA en amplificaten bewaren
- Werk in PCR- of flowkasten
Ruimte 2: Nucleïnezuurisolatie en PCR set up
Activiteiten:
- Opslag van gebruiksoplossingen van primers, probes en PCR mixen voor
dagelijks gebruik.
- Opslag van klinische materialen en controles.
- Werken met klinisch materiaal in laminair flow kast (klasse II).
- Voorbehandeling van klinische materialen (bv proteïnase-K, bead-beating) .
- Nucleïnezuurextractie van klinische materialen.
- Toevoegen DNA/RNA aan PCR mix.
- Uitvoeren cDNA reactie en toevoegen cDNA aan mix.
- Toevoegen van interne, negatieve en positieve controles aan de PCR plaat.
Aanbeveling:
 In Ruimte 2 worden geen post-PCR handelingen verricht.
 Indien in ruimte 2 gebruik wordt gemaakt van een volledig gesloten systeem (het
gehele proces van isolatie tot en met amplificatie en detectie in één cartridge) dienen
de cartridges na gebruik ongeschonden en ongeopend vernietigd te worden.
 Het opwerken van viruskweek en bacteriestammen voor zowel moleculaire
diagnostiek en typering als voor gebruik als positieve of interne controle, dient bij
voorkeur in een andere fysiek gescheiden ruimte (aparte labruimte of speciaal
daarvoor gereserveerd PCR-kabinet) plaats te vinden. Na titratie van de controles tot
aanvaardbare (bv Cq > 30) loads (risico analyse) kunnen ze naar ruimte 2.
 Dit geldt ook voor cellijnen die hoog-positief zijn voor een bepaalde target, en
plasmide-constructen die als controles gebruikt worden.
Opmerking:
Volledig gesloten systemen kunnen geplaatst worden in ruimte 2, vooropgesteld dat deze na
amplificatie dicht blijven. Hetzelfde geldt voor NA extractieapparatuur die gekoppeld is met
assay set-up en gesloten amplificatie apparatuur. Men dient zich te realiseren dat van de
risico’s van deze systemen ten aanzien van fout-positiviteit nog weinig bekend is!
Ruimte 2 kan gecombineerd worden met een ruimte waarin ook andere niet moleculaire testen
worden uitgevoerd, zoals bijvoorbeeld serologie.
Ruimte 3 (PCR, Post-PCR): Ruimte 3a (PCR) en 3b (post-PCR) kunnen gescheiden zijn of
samengevoegd
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
7/17
Activiteiten:
Ruimte 3a (gesloten PCR apparatuur ruimte):
Amplificatie van nucleïnezuur geïsoleerd uit klinische monsters die plaats
vindt in gesloten PCR systemen. Na amplificatie worden de reactievaatjes niet
geopend.
Ruimte 3b (PCR + Post-PCR):
Amplificatie en analyse van nucleïnezuur. Na amplificatie kunnen de
reactievaatjes geopend worden voor nadere analyse.
Hier bevinden zich thermocyclers, apparatuur voor gel-electroforese,
hybridisatie en sequentieanalyse.
Ruimte 3a: Apparatuur voor amplificatie/detectie reacties in gesloten systemen.
Hierin wordt gesloten amplificatieapparatuur geplaatst en vinden geen post-PCR activiteiten
plaats. Post-PCR handelingen met PCR producten mogen alleen in ruimte 3b plaatsvinden!
Ruimte 3b: Amplificatie met post-PCR processing en/of detectie in open systemen.
Aanbeveling:
 Er dient een risico-inschatting gemaakt te worden van activiteiten in deze
ruimte om te bepalen of personeel werkzaamheden in ruimte 1 en/of 2 kan
uitvoeren na verblijf in een post-amplificatie ruimte. Dit is mede afhankelijke
van de werkzaamheden en de aard en de hoeveelheid van te analyseren
monsters en de prevalentie van positieve resultaten.
3.2
Andere niet-diagnostische activiteiten
Vanwege het hoge risico op contaminatie dienen werkzaamheden voor niet
diagnostische doeleinden, zoals studies met gekweekte micro-organismen voor
epidemiologische doeleinden of hoge concentraties van gekloneerde fragmenten in
plasmiden in ruimte 3b of andere ruimtes buiten de moleculair diagnostische
laboratoriumruimtes te worden uitgevoerd.
3.3
Ruimte voor extra amplificatiestappen
Bij het uitvoeren van extra amplificatiestappen, bijvoorbeeld bij een zogenaamde
nested-PCR of bij pre-amplificatie voor MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification) bestaat altijd een verhoogd contaminatierisico. Indien men een
dergelijke techniek uitvoert dient de tweede stap na de eerste ronde amplificatie, te
worden uitgevoerd in een fysiek (van ruimte 1 en 2) gescheiden ruimte. Dit kan een
aparte labruimte zijn, maar ook een daartoe toegewezen PCR kabinet binnen ruimte 3b
met o.a. eigen pipetten en apparatuur. Een risico analyse is hierbij een hulpmiddel.
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
8/17
4.
ONDERHOUD EN SCHOONMAAK
4.1
Apparatuur
Aanbeveling:
Thermocyclers, extractieapparatuur, pipetten, pipetteerrobots en dergelijke, worden
regelmatig gekalibreerd en onderhouden. Voor real-time PCR dient zowel een
thermische als een optische kalibratie te worden verricht.
4.2
Schoonmaak
Aanbeveling:
Er dienen met het schoonmaakpersoneel afspraken gemaakt te worden betreffende het
unidirectioneel betreden van en het schoonmaken van vooral vloeren en
werkoppervlakken in moleculaire diagnostiek ruimtes. Leg dit vast in een
(laboratorium brede) schoonmaak procedure en bij voorkeur in een DVO (DienstVerlenings-Overeenkomst).
- (Tafel)oppervlakken, buizenrekken en dergelijke, na gebruik en bij voorkeur 1x per
week schoonmaken met een hiervoor geschikt middel (zoals hypochloriet en Extran).
- Het uitvoeren van veegtesten kan een hulpmiddel zijn om te bepalen of er
amplificaten aanwezig zijn.
Opmerkingen:
- Let op, kleine fragmenten zoals gebruikelijk bij real-time PCR blijven ook na
bv. chloorbehandeling nog amplificeerbaar.
- Gebruik van 0,1 N HCl werkt heel goed om nucleïnezuren af te breken maar is
erg corrosief. Direct naspoelen met water.
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
9/17
5.
VALIDATIE
5.1
Algemeen
Alvorens een test in gebruik te nemen in de laboratoriumdiagnostiek, worden de aan
de methode gerelateerde parameters, zoals specificiteit, sensitiviteit, precisie,
accuraatheid en reproduceerbaarheid onderzocht. Hiervoor dient volgens de CCKL
praktijkrichtlijnen of andere ISO normen, een validatieplan opgesteld te worden met
gestelde acceptatiecriteria. De resultaten worden in een validatieverslag vastgelegd.
Bruikbare procedures zijn onder andere beschreven in Nolte et al, 2006 en Rabenau et
al, 2007.
5.2
Commerciële testen
5.2.1. CE/IVD testen
- Bij commerciële CE/IVD (In Vitro Diagnostics) testen zijn de karakteristieken
zoals sensitiviteit en specificiteit reeds gevalideerd door de fabrikant. Hierover
dienen rapporten en/of ‘peer reviewed’ literatuur beschikbaar en opvraagbaar te zijn
bij de fabrikant.
- Het laboratorium dient voor de invoering van de test een verificatie uitvoeren
om te onderzoeken of de test en/of het apparaat na installatie beantwoordt aan de
verwachtingen. Gebruik hiervoor bij voorkeur bekende, goed gedefinieerde
materialen, zoals internationale standaarden en kwaliteitspanels (hoewel deze
laatste per definitie niet gebruikt dienen te worden voor validatie en verificatie).
- Indien modificaties aan een CE/IVD test aangebracht zijn, gelden de validatierichtlijnen van de in-house ontwikkelde testen. Bij afwijking van de aanbevelingen
van de fabrikant (bv. een andere nucleïnezuurextractie), moet aangetoond worden
dat de nieuwe werkwijze een gelijke dan wel betere performance heeft dan de
aanbevolen methode.
5.2.2. CE testen
Voor CE testen (niet-IVD) gelden dezelfde richtlijnen als CE/IVD testen indien de
fabrikant beschikbare studies verricht heeft om de testkarakteristieken vast te stellen.
Voor CE-testen waarmee door de fabrikant geen verdere studies zijn verricht, gelden de
validatie-richtlijnen zoals voor “in-house” ontwikkelde testen (zie 5.3).
5.2.3. Overige testen
Voor overige testen gelden dezelfde richtlijnen als voor “in-house” ontwikkelde testen
(zie 5.3).
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
10/17
5.3
‘In house’ ontwikkelde testen
5.3.1 Zelf ontwikkelde testen (Nolte et al., 2006; Bustin et al., 2009; Rabenau et al., 2007)
Aanbevelingen:
Het laboratorium heeft een validatieprocedure beschreven met hierin (een of meerdere van) de
volgende aandachtspunten:
-
-
-
In silico analyse van primers en probes m.b.t. specificiteit
Optimaliseer de efficiëntie van de PCR met behulp van verdunningsreeksen van een
positief materiaal.
Bepaal de analytische detectielimiet (Lower Limit of Detection, LLOD) van de
bepaling, bij voorkeur op een gestandaardiseerd materiaal.
Bepaal de specificiteit van de primers en probes door analyse van de kruisreactiviteit
met DNA (of RNA) van relevante microorganismen die in de te testen klinische
materialen verwacht kunnen worden. Zowel stammen als klinisch materiaal dienen
als uitgangsmateriaal.
Optimaliseer het voorbehandelen en NA extractiemethode voor de klinische
materialen waarin het target moet worden aangetoond.
Valideer de klinische prestaties van de test:
o Gebruik klinische materialen. Het aantal is afhankelijk van de beschikbaarheid
(zeldzame materialen) en de prevalentie.
o Vergelijk de resultaten met de huidige diagnostiek op basis van vooraf vastgestelde
criteria (zoals sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde en negatief
voorspellende waarde)
Andere mogelijkheden:
o monsters uit een erkend kwaliteitsprogramma worden getest
o bij afwezigheid van klinische materialen kan het target in de te testen matrix
worden gespiked.
5.3.2 In-house test door een ander laboratorium ontwikkeld
Aanbevelingen:
- Indien de test is gevalideerd in het laboratorium dat de test heeft ontwikkeld, kan
het validatierapport of de daaruit voortgekomen wetenschappelijke publicatie
opgevraagd worden en volstaat een beperkte validatie waarbij wordt aangetoond
dat de assay in het eigen lab aan de verwachte specificaties voldoet. Externe
rondzendingen kunnen hierbij een goed hulpmiddel zijn. Daarnaast moeten een
beargumenteerd aantal klinische materialen bij een dergelijke validatie getest
worden.
- Indien geen validatierapport of publicatie beschikbaar is, zal de test volgens 5.3.1.
moeten worden gevalideerd.
- Indien wijzigingen aangebracht zijn aan de oorspronkelijke test, zoals bijvoorbeeld
het toevoegen van een extra target, dan moet uitgebreider gevalideerd worden
conform zelf ontwikkelde testen (zie 5.3.1.)
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
11/17
5.4.
Kwantitatieve analyses
Aanbevelingen:
- Voor kwantitatieve analyses gelden dezelfde eisen als voor kwalitatieve testen zoals
beschreven onder 5.2. en 5.3. Daarnaast wordt verwezen naar de MIQE richtlijnen
(Bustin, 2009). Zowel de LLOD als upper-LOD dienen vastgesteld te worden. Er is
specifieke aandacht noodzakelijk voor de gebruikte standaarden (ijklijn) op basis
waarvan gekwantificeerd wordt. Indien beschikbaar dienen hiervoor internationaal
geaccepteerde standaarden gebruikt te worden (bijvoorbeeld WHO standaarden voor
HIV-1, HBV, HCV, CMV, EBV en dergelijke). Eigen standaarden kunnen ook
gebruikt worden, maar dienen dan op de internationale standaard te zijn
gekalibreerd. Kwantitatieve data uit andere laboratoria, voor bijvoorbeeld
behandeling en monitoring, kunnen niet zonder kalibratie naar de eigen test vertaald
worden, tenzij de uitslagen in beide laboratoria op basis van een internationale
standaard worden gegenereerd.
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
12/17
6.
CONTROLES EN KWALITEITSBORGING
6.1
Algemeen
Aanbevelingen:
- Conform de praktijkrichtlijn CCKL of vergelijkbare normen die in Nederlandse
laboratoria worden gehanteerd, zoals:
- Gebruikte reagentia en ook de oorsprong en validatie van “home-made”
reagentia (inclusief ontvangen primers en probes) moeten herleidbaar zijn.
o Registreer lotnummers, data van houdbaarheid en datum van bereiding van
kritische reagentia. Een lijst van kritische componenten dient te zijn
vastgesteld.
- Elke nieuwe ‘batch’ van primers, probes, buffers, enzymen of amplificatiemix
moet worden getest ten opzichte van de oude ‘batch’ middels een vastgelegd
protocol waarin acceptatiecriteria zijn beschreven. Deze ingangscontrole kan bij
commercieel verkregen (en geteste) reagentia ook via de acceptatiecriteria van
de controles plaatsvinden.
- Om achteruitgang door vriesdooi stappen te beperken en om het risico van
contaminatie te verkleinen, is het raadzaam om adequate gebruikshoeveelheden
uit te vullen.
6.2
Controles
Aanbevelingen:
- Bij elke test moet tenminste een positieve controle, een negatieve controle en
een interne controle worden meegenomen. Voor genotyperingstesten is een
remmingscontrole niet vereist.
- Testen worden als valide aangemerkt op basis van acceptatiecriteria die zijn
vastgelegd voor de vastgestelde Cq waarden van zowel de positieve controle
(PCR bepaling is valide) als de (interne) remmingscontrole (valide negatief
resultaat van het betreffende materiaal).
- Er dienen procedures te zijn waarin is vastgelegd hoe men handelt als de
verschillende controles niet aan de acceptatiecriteria voldoen.
6.2.1 Positieve controles
-Als positieve controle wordt een positieve opwerkingscontrole (POC) gebruikt,
bestaande uit positief materiaal (gekweekt of klinisch materiaal) met een vastgestelde
hoeveelheid van het betreffende target, dat de hele analyseprocedure mee doorloopt.
Op deze wijze wordt zowel de PCR reactie als de targetspecifieke extractieprocedure
gecontroleerd.
- Indien het target niet te kweken is en klinisch materiaal schaars is:
- is het gebruik van een positieve DNA controle (PDC), i.e. een DNA/RNA
controle van het specifieke target (bijvoorbeeld plasmide of run-off transcripten)
vaak de enige mogelijkheid om als positieve controle te dienen. Dit is echter
alleen een amplificatiecontrole.
-Bij kwantitatieve bepalingen wordt de pathogeen load bepaald op basis van een (bij
voorkeur Internationale) Standaard. Indien deze standaard vooraf is bepaald en de
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
13/17
load op basis daarvan wordt berekend dienen een Hoog Positieve en Laag Positieve
controle meegenomen te worden. Deze dienen binnen vastgelegde acceptatiecriteria te
liggen en er moet een procedure beschikbaar zijn die beschrijft hoe te handelen bij
afwijkingen.
Opmerkingen:
- Gebruik van een PDC naast een POC geeft bij afwijkingen direct informatie over de
oorzaak van de afwijking (extractie of amplificatie).
- Monitoring van de POC (door het loggen van de Cq waarden) is een belangrijk
instrument om reproduceerbaarheid van de test te controleren. Logging van de Cq
waardes van de POC maakt periodieke trendanalyse mogelijk om de
reproduceerbaarheid van de test in de tijd te vervolgen.
6.2.2. Negatieve controles
Aanbevelingen:
Omdat contaminatie tijdens de voorbehandeling op kan treden is er altijd tenminste
één negatieve controle per run nodig die de gehele opwerking en amplificatie
doorloopt (negatieve opwerkingscontrole, NOC). Bij grote runs (aantal door het lab te
bepalen) kunnen meerdere negatieve controles verspreid tussen de klinische monsters
gebruikt worden. Naast een NOC kan ook een negatieve DNA controle (NDC)
meegenomen worden, zodat in geval van afwijkende resultaten direct achterhaald kan
worden of dit het gevolg is van contaminatie in de PCR of extractie-procedure.
6.2.4 Interne controle op remming en correcte NA isolatie
Een interne controle (IC) is een target dat in een vaste concentratie aan het monster
wordt toegevoegd en de extractie en amplificatie/detectiestappen doorloopt.
Indien de procedure accuraat is verlopen en geen remming optreedt, zal de Cq waarde
van de IC bij de monsters rond dezelfde Cq liggen.
Aanbevelingen:
- De toegevoegde IC mag niet of beperkt interfereren met de detectie-gevoeligheid
van het beoogde target en heeft altijd een bepaalde vastgestelde Cq in de gebruikte
klinische materiaalsoort.
- De Cq-waarde van de controle dient binnen een gedefinieerde grens te vallen. Indien
een, door opgestelde remmingscriteria bepaalde, afwijkende (hogere) Cq waarde
wordt gevonden is het monster geremd.
- Er dient een vastgelegde procedure te zijn die beschrijft wat te doen na het vinden
van een geremd materiaal.
6.3 Continue en externe kwaliteitscontrole van laboratoriumdiagnostiek
Aanbevelingen:
- Conform de praktijkrichtlijn CCKL of vergelijkbare normen die in Nederlandse
laboratoria worden gehanteerd wordt.
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
14/17
-
-
-
-
Periodiek deelgenomen aan externe kwaliteitsrondzendingen: deze worden bij
voorkeur verzorgd door professionele organisaties zoals QCMD, NEQAS en
INSTAND, maar eventueel ook door de beroepsorganisaties via SKML
Monitoren van Cq waardes van zowel positieve als remmingscontroles om
continuïteit van diagnostisch proces te borgen. Regelmatige trendanalyse is een
hiervoor een waardevol middel.
Als er geen externe kwaliteitsrondzending is voor bepaalde target, dan is het
raadzaam om samples uit te wisselen met een ander laboratorium of commerciële
materialen aan te schaffen.
Periodiek in silico checken van de specificiteit van primer- en probe-sequenties in
DNA database aan de hand van de meest recente sequentie-informatie van
mogelijk nieuwe strainvarianten, en indien nodig aanpassen
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
15/17
7.
LITERATUUR











Apfalter, P, U. Reischl, M.R. Hammerschlag. In house nucleid acid amplification
assays in research: how much quality control is needed before one can rely upon
the results? J.Clin.Microbiol. 2005;12;5835-5841.
Borst, A, A.T.A. Box, and A.C. Fluit. False-positive results and contaminations in
nucleic acid amplification assays, suggestions for a prevent and destroy strategy.
Eur.J.Clin.Microbiol. Infect.Dis. 2004;23:289-299.
Bustin et al, 2009 The MIQE guidelines: minimum information for publication of
quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 2009; 55:611-625.
CCKL Praktijkrichtlijnen, 4e uitgave 2005
Gunson, R.N., S. Bennett, A. Maclean, W.F. Carman. Running multiplex real time
PCR in order to streamline a routine diagnostic service. J. Clin. Virol. 2008; 43:
372-275.
Mitchell, P.S., J.J. Germer, and R. Patel. Nucleic Acid Amplification Methods:
Laboratory Design and Operations, p85-94. In: D.H. Persing (ed.) Molecular
microbiology, diagnostic principles and practice. 2004. ASM Press, Washington
DC.
Nolte, F.S. et al. Molecular diagnostic methods for infectious diseases : approved
guideline second edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, MM3-A2
vol. 26 no. 8, 2006. ISBN 1-56238-596-8.
Noordhoek G.T., S. Mulder, P. Wallace, A.M. van Loon. Multicenter quality
control study for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by
nucleic amplification methods. Clin.Microbiol.Infect. 2004; 10;295-301.
NVMM publicatie: Veilig werken met micro-organismen, parasieten en cellen in
laboratoria en andere werkruimten”. 3e druk 2009, ISBN 987-90-8559549-6.
Rabenau H.F., H. Kessler, M. Kortenbusch, A. Steinhorst, R.B. Raggam, and A.
Berger. Verification and validation of diagnostic laboratory tests in clinical
virology. J. Clin. Virol. 2007; 40:93-98.
Raymakers, M., R. Smets, B. Maes, and R. Cartuyvels. Checklist for optimization
and validation of real-time PCR assays. J. Clin. Lab Anal. 2009;23:145-151.
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
16/17
Laatste pagina, bewust blanco gelaten
Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari 2014
17/17

Download Report