Diagnostiek in tuberculose pyrazinamide Sami Simons Radboud UMC, afdeling longgeneeskunde Pyrazinamide • Een stukje geschiedenis…. • Hoe werkt pyrazinamide eigenlijk? • Het bepalen van pyrazinamide resistentie Disclosure Statement for Conflicts of Interest I have no conflicts of interest to disclose Pyrazinamide Een stukje geschiedenis De ontdekking van pyrazinamide • 1936, synthese van pyrazinamide • 1945, vitamine B3 actief tegen tuberculose • 1952, Pyrazinamide meest potente nicotinamide analoog in vivo muismodel • 1952, meteen getest in patiënten…… Zhang 2003;7:6 De ontdekking van pyrazinamide • Walsh McDermott (1909-1981) • Als arts-in-opleiding pulmonale tuberculose (1935) • Lobectomie en thorocoplastiek vanwege bronchopleurale fistel (1950) Zhang 2003;7:6 De ontdekking van pyrazinamide • De eerste ontdekking: • Alleen actief in zuur milieu • De tweede ontdekking • Steriel na behandeling. Groei enkele dagen erna • basis voor huidige idee over dormant bacilli • Pyrazinamide actief tegen deze dormant bacilli Zhang 2003;7:6 Mijlpalen • Pyrazinamide aan de wieg van RCTs • PZA,R, of thioacetazon bij S+H behandeling • Meer sputumconversie op maand 2 • Pyrazinamide aan de wieg van DOTS • Z of R: duur TB behandeling van 12 naar 9 maanden • Z en R: behandeling van 12 naar 6 maanden • Pyrazinamide aan de wieg van toekomstige (MDR)TB behandelingen • Synergistisch met Bedaquiline en fluorochinolonen • Verkorting TB behandeling naar 4 maanden (PAMZ trials)? Hoe werkt pyrazinamide? De centrale rol van pyrazinamidase Klassieke theorie: nonspecifiek • Pyrazinamide als prodrug • Omzetting door pyrazinamidase enzym • Passieve diffussie (of actief transport?) cel uit • In zuur milieu als ongeladen HPOA cel weer in • Acidificatie van de cel Zhang 2003;7:6 Nieuwe inzichten: trans-translatie • Onder stress (pH, hypoxie?) ….stop mRNA translatie • Koppeling tmRNA waardoor hervatten translatie • Hiervoor ribosomaal proteine S1 noodzakelijk (rpsA) • POA bindt aan rpsA hierdoor geen trans-translatie meer mogelijk • Depletie ribosomen, ophoping defecte eiwitten Shi 2011:333;1630 Nieuwste inzichten; CoA • Whole genome sequencing van pyrazinamide resistente stammen • Mutaties in panD • panD betrokken bij synthese Coenzym-A • CoA betrokken oxidatie FFA en pyruvaat in citroenzuur cyclus • Rol panD en pyrazinamide? Zhang 2013;2:e34 Pyrazinamide resistentie Valkuilen in de diagnostiek Resistentiebepaling van pyrazinamide • Storende factoren in het bepalen van pyrazinamideresistentie • Fenotypische resistentiebepalingen • Moleculaire resistentiebepalingen • Voor de praktijk: stroomdiagrammen voor bepalen van pyrazinamideresistentie Resistentiebepaling van pyrazinamide • Storende factoren in het bepalen van pyrazinamideresistentie • Fenotypische resistentiebepalingen • Moleculaire resistentiebepalingen • Voor de praktijk: stroomdiagrammen voor bepalen van pyrazinamideresistentie Pyrazinamide • Pyrazinamide pas actief na conversie door pyrazinamidase • Activiteit pyrazinamide/pyrazinamidase afhankelijk van: 1. pH medium 2. Inoculumgrootte 3. Bovine serum albumine (BSA) 4. Groeifase M. tuberculosis? Pyrazinamide • Pyrazinamide pas actief na conversie door pyrazinamidase • Activiteit pyrazinamide/pyrazinamidase afhankelijk van: 1. pH medium 2. Inoculumgrootte 3. Bovine serum albumine (BSA) 4. Groeifase M. tuberculosis? Effect van pH • Het probleem in diagnostiek is: • Bij hoge pH pyrazinamidase niet actief • Bij lage pH geen groei M. tuberculose • Kritische concentratie (pH 5.5) = 50 μg/ml (= MIC90) Zhang 2003;7:6 Effect van pH • MIC afhankelijk van pH medium • Henderson-Hasselbach vergelijking pH = pKa + log[A-]/[HA] • Theorie: Bij PZA bepaalt fractie HA activiteit • Hogere pH, lagere HA fractie: dus hogere MIC • Op pH 6.0, theoretische MIC 156 μg/ml Zhang 2003;7:6 Pyrazinamide • Pyrazinamide pas actief na conversie door pyrazinamidase • Activiteit pyrazinamide/pyrazinamidase afhankelijk van: 1. pH medium 2. Inoculumgrootte 3. Bovine serum albumine (BSA) 4. Groeifase M. tuberculosis? inoculumgrootte • Inoculumgrootte > 107 neutraliseert pH medium >> pyrazinamidase inactief • Achtergrond: NH3 als bijproduct van omzetting pyrazinamide Zhang 2003;7:6 Pyrazinamide • Pyrazinamide pas actief na conversie door pyrazinamidase • Activiteit pyrazinamide/pyrazinamidase afhankelijk van: 1. pH medium 2. Inoculumgrootte 3. Bovine serum albumine (BSA) 4. Groeifase M. tuberculosis? Andere storende factoren • BSA • supplement in kweekmedia (0.5%, 7H9 medium) • 0.5%-2.0% BSA verhoogt MIC pyrazinamide • Werkingsmechanisme: • Verhoging pH • Binding aan POA• Groeifase M. tuberculosis? • Hogere kill 3 maanden ouder bacterie dan 4 dagen oude bacterie Zhang 2003;7:6 Resistentiebepaling van pyrazinamide • Storende factoren in het bepalen van pyrazinamideresistentie • Fenotypische resistentiebepalingen • Moleculaire resistentiebepalingen • Voor de praktijk: stroomdiagrammen voor bepalen van pyrazinamideresistentie Fenotypische resistentiebepaling • Testen pyrazinamide gevoeligheid in MGIT 960 systeem (pH 6.0) • CC = 100 μg/ml (fabrikant) • Sensitiviteit: 91-100% Specificiteit: 87-100% • zuur milieu: 4% geen groei • Wild type MIC distributie in MGIT 960 systeem Simons 2011; 17:2863 & Werngren 2012;56:1253 Fenotypische resistentiebepaling • MGIT 960 geeft hogere kans op vals-resistente uitslagen • 42-68% vals-resistent bij 1ste MGIT uitslag • Oorzaken: 1. Groter inoculum (0.5 ml) 2. Lagere kritische concentratie Simons 2012;50:428 Resistentiebepaling van pyrazinamide • Storende factoren in het bepalen van pyrazinamideresistentie • Fenotypische resistentiebepalingen • Moleculaire resistentiebepalingen • Voor de praktijk: stroomdiagrammen voor bepalen van pyrazinamideresistentie Moleculaire testen • Pyrazinamidase enzym centraal in werking pyrazinamide • Het pncA gen codeert voor pyrazinamidase • Morlock (1997) mutaties in het pncA gen geven pyrazinamide resistentie • Epidemiologische studies: 70%-98% van de pyrazinamide resistente M TB isolaten hebben een mutatie in het pncA gen Zhang 2003;7:6 Moleculaire testen • Mutaties in pncA zijn voorspellend voor optreden pyrazinamide resistentie • Geen hotspotregio, mutaties verspreid over het gen (558 bp) Chang 2011;55:4499 Moleculaire testen • Gebruik moleculaire testen afhankelijk van pyrazinamide prevalentie • Laag prevalentie: uitsluiten pyrazinamide resistentie • Hoog prevalentie: aantonen pyrazinamide Chang 2011;55:4499 Resistentiebepaling van pyrazinamide • Storende factoren in het bepalen van pyrazinamideresistentie • Fenotypische resistentiebepalingen • Moleculaire resistentiebepalingen • Voor de praktijk: stroomdiagrammen voor bepalen van pyrazinamideresistentie Diagnostiek algoritme • Diagnostiek afhankelijk van prevalentie pyrazinamide en MDR-TB • Laag-prevalentie landen: • Screening met fenotypische testen • Hoe om te gaan met valspositieve MGIT uitslagen? • Hoog-prevalentie landen: • Screening met moleculaire testen • Hoe moleculaire (snel)testen in te zetten? Algoritme in laagprevalentie landen • Prevalentie pyrazinamide resistentie in NL: 1% • Screening via MGIT 960 geeft veel valspositieven • Is het mogelijk deze te identificeren via mutaties in pncA? • 1,650 isolaten uit NL screening via MGIT pncA analyse indien resistent Simons 2012;50:428 Algoritme in laagprevalentie landen • pncA mutaties zijn voorspellend voor resistente isolaten na 1ste MGIT • Voorstel: pncA analyse bij 1ste resistente PZA MGIT • Andere opties: • Herhalen fenotypisch • Alleen pncA analyse • Verminderd inoculum • Hogere kritische concentratie Simons 2012;50:428 Algoritme in hoogprevalentie landen • Screening door middel van rpoB mutatie analyse • pncA om resistentie aan te tonen • Kan via rpoB en pncA analyse snel pyrazinamide resistente MDR-TB worden aangetoond? Diagnostiek in van PZA-R MDR-TB • 83 patienten met MTB met rpoB mutatie • Prospectief • pncA mutaties analyse • PZA MGIT kit tweemaal • Resultaten R en H uit database gehaald • Voorspelt pncA mutatie voor PZA-R MDR-TB? Simons 2014 in press Diagnostiek van PZA-R MDR-TB • 33 pncA mutaties • 30 PZA resistente MDR TB • 3 valspositief • 1 gemist (geen pncA mutatie) • pncA mutaties goed voorspeller PZA-R MDR-TB • Voorstel: pncA mutatie analyse uitvoeren bij elk rpoB+ MTB patiënt Simons 2014 in press Pyrazinamide • Een stukje geschiedenis…. • Hoe werkt pyrazinamide eigenlijk? • Het bepalen van pyrazinamide resistentie
© Copyright 2024 ExpyDoc
