C 型 肝 炎 TaqManPCR 法の概要について 測定レンジ 既存 次世代 □ ハイレンジ、オリジナル、定性の使い分けがなくなる 測定原理について-1 ■ Taq Man PCR法 ロシュ社提供資料 図:COBAS TaqMan® Real time PCR ASSAY 測定原理について-2 ■ アンプリコア法 至適サイクルでPCRサイクルを止め、 増幅産物の収量を定量している ターゲット核酸のシグナル 増幅産物の収量 30 □ 測定感度がでない □ 測定感度の頭打ち 0c HCV_0c QS 0c HCV RNA 101c HCV RNA 102c HCV RNA 103c HCV RNA 104c HCV RNA 105c HCV RNA 106c HCV RNA 107c HCV RNA 108c HCV RNA AFL=1.5 25 20 15 ■ Taq Man PCR法 5 PCRサイクル毎にTaqManプロー ブが分解されて発せられる励起光 を検知している。 • 高濃度 :早いサイクル数で検知 • 低濃度 :遅いサイクル数で検知 0 □ ワイドレンジにて測定が可能 10 0 10 20 30 40 50 PCRサイクル数 60 ロシュ社提供資料 図:TaqMqnPCR反応イメージ図 励起(れいき):スル量子力学で、原子や分子が外からエネルギーを与えられ、もとのエネルギーの低い安定した 状態からエネルギーの高い状態へと移ること。 アンプリコア法との相関 コバス TaqMan HCV 「オート」 >7.8 7.8 Y = 1.21x - 0.85 r = 0.976 n = 244 p < 0.001 7.0 6.0 Genotype 1a/1b >7.8 7.0 5.0 3.0 Gt 1a(n=1) Gt 1b(n=210) 検出せず <2.7 5.0 3.0 5.0 7.0 >6.7 アンプリコアHCV モニター v2.0 (Log IU/mL) ハイレンジ/オリジナル 4.0 (Log IU/mL) 3.0 コバス TaqMan HCV 「オート」 コバス TaqMan HCV 「オート」 (Log IU/mL) (Log IU/mL) 2.0 1.2 検出せず <2.7 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 > 6.7 アンプリコアHCV モニター v2.0 (Log IU/mL) ハイレンジ/オリジナル Genotype 2a/2b >7.8 7.0 5.0 3.0 Gt 2a(n=29) Gt 2b(n=12) 検出せず <2.7 3.0 5.0 7.0 >6.7 アンプリコアHCV モニター v2.0 (Log IU/mL) ハイレンジ/オリジナル (狩野吉康:医学と薬学,58(1):137-149,2007) HCV RNA定量(リアルタイムPCR)の報告形態 HCV RNA定量(Log IUmL) 1.2 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 7.8 測定結果 定量下限未満 HCV増幅 検出 反応シグナル せず 検出せず 検出 定量範囲内 検出 定量下限以上 検出 1.2 Log IU/mL未満 1.2~7.7 Log IU/mL 7.8 Log IU/mL以上 報告形態 測定感度 100% コバス TaqMan HCV 「オート」 アンプリコア HCV v2.0 (定性) 検出率 75% 50% 25% 0% 100 50 30 15 10 陰性 パネル濃度(IU/mL) (狩野吉康:医学と薬学,58(1):137-149,2007) 検体量 □ アンプリコア法に比べTaqManPCR法は検体量が増加 容器の追加 HCV RNAの高感度化による治療法の変化 Non responder Rebounder 50IU/ml (1.7 log/ml) 1.2 log/ml 12 SVR 13 Late responder Late responder 平成18年度のgenotype1、高ウイルス量症例に対する Peg-IFN+リバビリン併用療法のガイドライン(補足) 1. 12週以内にRNA陰性化例 48週併用療法でSVRを期待 2. 13週から24週までにRNA陰性化例 72週の併用療法長期継続でSVRを目指す 3. 高齢、合併症併存、Hb・WBC低値例など通常量で の治療では副作用中止が予測される症例 減量開始、あるいは、早期に減量して(48-72週)完遂を目 指す 4. 24週目でRNA陽性かつALT正常化例 48週の治療継続により長期ALT正常化維持を目指す 日本におけるHCV Genotypeの比率 1a 2.6% 1b 2a 2b 64.4% 16.9% 12.4% 3a 1.3% 3b 0.0% Mix 2.4% (n=379) 1b型はインターフェロンに対する反応性が悪い (Ohno T,et al:J Clin Microbiol 35(1):201~207,1997.) HCV群別(グルーピング)の測定領域 ・HCV抗体は高感度に検出するための領域設定 ・HCV群別は型を分類するための領域設定 →HCV抗体が陽性であっても判定できない場合がある HCV群別(グルーピング)とPCR法との比較 HCV群別(グルーピング) Geno type Type1 Type2 PCR法 計 グループ 1 グループ 2 41 0 41 0 16 16 計 判定保留 判定不能 3 3 6 6 1 7 50 20 70 一致率:81.4% 判別率81.4% (国際試薬社資料) HCV RNAコアジェノタイプ ■特 徴■ ・HCVの遺伝子型を6つのタイプ(1a、1b、2a、2b、3a、3b) に分類判定 ・抗ウイルス療法における治療効果予測に有用 ・遺伝子型を指標とした感染源の同定や感染経路に推定 に有用 HCV RNAコアジェノタイプの測定方法 HCV1b-IFN/RBV変異 HCV genotype1b高ウイルス量の患者群において、HCVコアたん ぱく質のアミノ酸番号70と91のアミノ酸変異によりウイルス学的無効 例と有効例に判別予測することができると虎の門病院より報 告があった。 本検査は、ダイレクトシーケンスデータからアミノ酸変異を推定し、70番、 91番に変異型、野生型、その他変異型、拮抗型に分けて報告 する。 70 91 Q:グルタミン M:メチオニン ウイルス学的無効例 HCV RNA 1b(NS5A) 本検査は、HCV RNAを抽出し、NS5A領域をRT-PCRを用い て増幅します。 得られた増幅産物をダイレクトシーケンス(サンガー法)によ りNS5A領域内の40アミノ酸(aa2209-2248)の解析を行い、 prototypeHCV-1bであるHCV-Jのアミノ酸変異数を報告します。 項目コード 検査項目 検体量 (ml) 容器 保存 所要日数 検査方法 基本単価 2240-3 HCV RNA 1b(NS5A) 血清 0.5 P1 絶凍 10~14 サンガー法 30,000円 変異したアミノ酸を報告する場合、50,000円となります。 リバビリン血中濃度測定 ■特 徴■ ・HPLCによりリバビリン血中濃度を測定 ・IFNとリバビリン併用療法における、治療効果の予測や 副作用の予測に有用 リバビリン血中濃度と治療効果との関係 (IFN-α2a+リバビリン併用療法) 定常状態で高濃度(2,500 ng/mL以上)ほど完全著効率が高い (Tsubota A,et al:Br J Clin Pharmacol 55:360~367,2003.一部改変)
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