Ｃ 型 肝 炎 TaqManPCR 法の概要について 測定レンジ 既存 次世代 □ ハイレンジ、オリジナル、定性の使い分けがなくなる 測定原理について-1 ■ Taq Man PCR法 ﾛｼｭ社提供資料 図：COBAS TaqMan® Real time PCR ASSAY 測定原理について-2 ■ ｱﾝﾌﾟﾘｺｱ法 至適サイクルでPCRサイクルを止め、 増幅産物の収量を定量している ターゲット核酸のシグナル 増幅産物の収量 30 □ 測定感度がでない □ 測定感度の頭打ち 0c HCV_0c QS 0c HCV RNA 101c HCV RNA 102c HCV RNA 103c HCV RNA 104c HCV RNA 105c HCV RNA 106c HCV RNA 107c HCV RNA 108c HCV RNA AFL=1.5 25 20 15 ■ Taq Man PCR法 5 PCRサイクル毎にTaqManプロー ブが分解されて発せられる励起光 を検知している。 • 高濃度 ：早いサイクル数で検知 • 低濃度 ：遅いサイクル数で検知 0 □ ﾜｲﾄﾞﾚﾝｼﾞにて測定が可能 10 0 10 20 30 40 50 PCRサイクル数 60 ﾛｼｭ社提供資料 図：TaqMqnPCR反応イメージ図 励起（れいき）：スル量子力学で、原子や分子が外からエネルギーを与えられ、もとのエネルギーの低い安定した 状態からエネルギーの高い状態へと移ること。 アンプリコア法との相関 コバス TaqMan HCV 「オート」 >7.8 7.8 Y = 1.21x - 0.85 ｒ = 0.976 n = 244 p < 0.001 7.0 6.0 Genotype 1a/1b >7.8 7.0 5.0 3.0 Gt 1a（n=1） Gt 1b（n=210） 検出せず <2.7 5.0 3.0 5.0 7.0 >6.7 アンプリコアHCV モニター v2.0 （Log IU/mL） ハイレンジ／オリジナル 4.0 （Log IU/mL） 3.0 コバス TaqMan HCV 「オート」 コバス TaqMan HCV 「オート」 （Log IU/mL） （Log IU/mL） 2.0 1.2 検出せず <2.7 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 > 6.7 アンプリコアHCV モニター v2.0 （Log IU/mL） ハイレンジ／オリジナル Genotype 2a/2b >7.8 7.0 5.0 3.0 Gt 2a（n=29） Gt 2b（n=12） 検出せず <2.7 3.0 5.0 7.0 >6.7 アンプリコアHCV モニター v2.0 （Log IU/mL） ハイレンジ／オリジナル （狩野吉康：医学と薬学，58（1）：137-149，2007） HCV RNA定量（リアルタイムPCＲ)の報告形態 ＨＣＶ ＲＮＡ定量（Log IUmL） 1.2 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 7.8 測定結果 定量下限未満 HCV増幅 検出 反応シグナル せず 検出せず 検出 定量範囲内 検出 定量下限以上 検出 1.2 Log IU/mL未満 1.2～7.7 Log IU/mL 7.8 Log IU/mL以上 報告形態 測定感度 100% コバス TaqMan HCV 「オート」 アンプリコア HCV v2.0 （定性） 検出率 75% 50% 25% 0% 100 50 30 15 10 陰性 パネル濃度（IU/mL） （狩野吉康：医学と薬学，58（1）：137-149，2007） 検体量 □ ｱﾝﾌﾟﾘｺｱ法に比べTaｑManPCR法は検体量が増加 容器の追加 HCV RNAの高感度化による治療法の変化 Non responder Rebounder 50IU/ml (1.7 log/ml) 1.2 log/ml 12 SVR 13 Late responder Late responder 平成18年度のgenotype1、高ウイルス量症例に対する Peg-IFN+リバビリン併用療法のガイドライン（補足） 1. 12週以内にRNA陰性化例 48週併用療法でSVRを期待 2. 13週から24週までにRNA陰性化例 72週の併用療法長期継続でSVRを目指す 3. 高齢、合併症併存、Hb・WBC低値例など通常量で の治療では副作用中止が予測される症例 減量開始、あるいは、早期に減量して（48-72週）完遂を目 指す 4. 24週目でRNA陽性かつALT正常化例 48週の治療継続により長期ALT正常化維持を目指す 日本におけるHCV Genotypeの比率 1a 2.6％ 1b 2a 2b 64.4％ 16.9％ 12.4％ 3a 1.3％ 3b 0.0％ Mix 2.4％ （n＝379） 1b型はインターフェロンに対する反応性が悪い （Ohno T，et al：J Clin Microbiol 35（1）：201～207，1997．） HCV群別（グルーピング）の測定領域 ・HCV抗体は高感度に検出するための領域設定 ・HCV群別は型を分類するための領域設定 →HCV抗体が陽性であっても判定できない場合がある HCV群別（グルーピング）とPCR法との比較 HCV群別（グルーピング） Geno type Type1 Type2 PCR法 計 グループ 1 グループ 2 41 0 41 0 16 16 計 判定保留 判定不能 3 3 6 6 1 7 50 20 70 一致率：81.4％ 判別率81.4％ （国際試薬社資料） HCV RNAコアジェノタイプ ■特 徴■ ・HCVの遺伝子型を6つのタイプ（1a、1b、2a、2b、3a、3b） に分類判定 ・抗ウイルス療法における治療効果予測に有用 ・遺伝子型を指標とした感染源の同定や感染経路に推定 に有用 HCV RNAコアジェノタイプの測定方法 HCV1b-IFN/RBV変異 HCV genotype1b高ｳｲﾙｽ量の患者群において、HCVｺｱたん ぱく質のｱﾐﾉ酸番号70と91のｱﾐﾉ酸変異によりｳｲﾙｽ学的無効 例と有効例に判別予測することができると虎の門病院より報 告があった。 本検査は、ﾀﾞｲﾚｸﾄｼｰｹﾝｽﾃﾞｰﾀからｱﾐﾉ酸変異を推定し、70番、 91番に変異型、野生型、その他変異型、拮抗型に分けて報告 する。 ７０ ９１ Q:グルタミン M:メチオニン ｳｲﾙｽ学的無効例 HCV RNA 1b(NS5A) 本検査は、HCV RNAを抽出し、NS5A領域をRT-PCRを用い て増幅します。 得られた増幅産物をダイレクトシーケンス（サンガー法）によ りNS5A領域内の40ｱﾐﾉ酸（aa2209-2248）の解析を行い、 prototypeHCV-1bであるHCV-Jのｱﾐﾉ酸変異数を報告します。 項目ｺｰﾄﾞ 検査項目 検体量 （ｍｌ） 容器 保存 所要日数 検査方法 基本単価 2240-3 HCV RNA 1b(NS5A) 血清 0.5 P1 絶凍 10～14 サンガー法 30,000円 変異したｱﾐﾉ酸を報告する場合、50,000円となります。 リバビリン血中濃度測定 ■特 徴■ ・HPLCによりリバビリン血中濃度を測定 ・IFNとリバビリン併用療法における、治療効果の予測や 副作用の予測に有用 リバビリン血中濃度と治療効果との関係 （IFN-α2a+リバビリン併用療法） 定常状態で高濃度（2,500 ng/mL以上）ほど完全著効率が高い （Tsubota A，et al：Br J Clin Pharmacol 55：360～367，2003．一部改変）
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