http://smile.poosan.net/dryeyez/ 生理学実習レポート実験日：２００５年４月２１日提出日：２００５年４月２５日実験項目：止血機構グループ：＊学籍番号：０３４１＊＊＊氏名：ｅｍｍ３８６共同実験者：０２４１＊＊＊：＊＊＊＊０３４１＊＊＊：＊＊＊＊０３４１＊＊＊：＊＊＊＊＊０３４１＊＊＊：＊＊＊＊０３４１＊＊＊：＊＊＊＊０３４１＊＊＊：＊＊＊＊０３４１＊＊＊：＊＊＊＊０３４１＊＊＊：＊＊＊＊０３４１＊＊＊：＊＊＊＊０３４１＊＊＊：＊＊＊＊０３４１＊＊＊：＊＊＊＊ ■ 目的生体の止血機構は、第一段階として血小板が作動し、次いで凝固・線溶系が作動する。本実習では、血小板機能の解析を行い、さらには凝固・線溶系の最終反応物質である FDP（FgDP）の作製を行う。これらの実験過程から生体内における止血機構を把握し、理解することを目的とする。 ■ 血小板機能に関する実験 ◇ 実習方法目的：家兎より得られた血小板を用いて、ADP、Collagen、Arachidonic acid、PAF による血小板凝集を観察する。特に、血小板数の多少、惹起物の濃度による凝集パターンの差異を観察する。実験器具：プラスチック試験管、パスツールピペット、マイクロスピッツ、マイクロシリンジ、ピペット、遠心機、血小板凝集計（ヘマトレーサー）試薬：3.8％クエン酸ナトリウム液 ADP（Sigma 製） Collagen（Hormon Chemie 二光バイオサイエンス） Arachidonic acid PAF（Avanti Polar lipids Inc.）実験方法： ① 家兎から採取した全血を用いて、PRP（platelet rich plasma）、PPP（platelet poor plasma）を作製する。 ② 作製した PRP 250µL に凝集惹起物（ADP、Collagen、Arachidonic acid、PAF）25µL を加え、血小板凝集計にて各惹起物による凝集パターンを描記する。 ②1）惹起物の濃度の変化による凝集パターンを描記する。 ②2）血小板数の変化による凝集パターンを描記する。すなわち、希釈した PRP に一定濃度の ADP、Collagen を加え、希釈前と後に得られた凝集パターンを比較する。 ③ オリジナル実験：１）PRP を 42℃で 10 分間 incubate し、次いで 37℃に 5 分間置くことで安定化させた後、ADP（5×10-4M）、Collagen（100µg/mL）を加え、血小板凝集計にて各惹起物による凝集パターンを描記する。２）PRP を氷中に 10 分間置き、次いで 37℃に 8 分間置くことで安定化させた後、ADP （5×10-4M）、Collagen（100µg/mL）を加え、血小板凝集計にて各惹起物による凝集パターンを描記する。 ※ 採血法：3.8％クエン酸ナトリウム液１容対血液９容にて家兎耳介静脈より採血を行う。（23G 注射針使用） ※ PRP、PPP の作成法： PRP・・・血液を室温 800r.p.m.で 10 分間遠心して作製する。 PPP・・・PRP を採取した残りの血液を 3000r.p.m. 10 分間遠沈して作製する。 ※ 惹起物の濃度： ADP・・・・・・・・・1×10-3M、5×10-4M、5×10-5M Collagen・・・・・・200µg/mL、100µg/mL、50µg/mL Arachidonic acid・・12.5mg/mL、2.5mg/mL PRF・・・・・・・・・40µg/mL、2.0µg/mL ◇ 結果と考察１）惹起物の濃度の変化による凝集パターン ① ADP 5×10-5M 5×10-4M 1×10-3M 結果：ADP を加えてから凝集が始まるまでのラグタイムはほとんど見られなかった。濃度が 5×10-5M のもののみ、透過光度がピークに達した後、すぐに下がり始めている。そのほかの濃度では、ピークに達した後も下がることはなく、グラフは平行になっている。考察：濃度が 5×10-5M のもののグラフがピーク後下がり始めていることは、一度凝集した血小板が再び解離し始めていることを示している。すなわち、血小板の変形や粘着による可逆的な凝集である一次凝集の割合が高いため、グラフが下がってきていると考えられる。そのほかの濃度では、血小板内の顆粒の放出などによる不可逆的な凝集である二次凝集が起こっており、グラフは平行となる。濃度が 1×10-3M のものには、グラフのピークと平行な部分の境目にズレのような部分が確認できる。これは恐らく、一次凝集と二次凝集の起こる変わり目ではないかと思われる。 ② Collagen 50µg/mL 100µg/mL 200µg/mL 結果：どの濃度においても Collagen を加えてから凝集が始まるまでにラグタイムがあった。どの濃度においても、グラフがピークに達した後、下がり始めることはなかった。濃度が 200µg/mL のグラフに見られるグラフの乱れは、巨大な凝集塊ができてしまったためのものである。考察：ADP を加えた際には観察されなかったラグタイムは、血小板が Collagen と接触し、血小板内の顆粒が放出され、その顆粒の内容物によって凝集が引き起こされる（二次凝集）までの時間である。このラグタイムは加える Collagen の濃度が高くなるにつれ、90 秒、65 秒、 60 秒と短くなっていることがわかる。これは濃度が高いほど、Collagen と血小板の出会う確立が高くなるためと考えられる。また、ADP を加えた場合と比較すると、グラフの立ち上がりの傾きが Collagen では ADP よりも緩やかなものとなっている。これは、ADP が一次凝集、Collagen が二次凝集を引き起こすという違いによるものだと考えられ、一次凝集のほうが凝集するスピードが速いと考えられる。 ③ PAF 2.0µg/mL 40µg/mL 結果：どちらの濃度においてもラグタイムは観察されなかった。どちらの濃度においてもグラフはピークに達した後、平行になっている。どちらの濃度においても透過光度のピークはほぼ等しく、76％程度であった。濃度が 2.0µg/mL のグラフでの立ち上がり時のグラフの乱れは、気泡によるものである。考察：ラグタイムがないことから、PAF は ADP 同様に一次凝集を引き起こしていると考えられる。しかし、2.0µg/mL という低濃度でも、凝集塊は解離することなくグラフは平行を保っていることから、PAF は低濃度でも十分二次凝集を起こしうると考えられる。 ④ Arachidonic acid 2.5mg/mL 12.5mg/mL 結果：どちらの濃度においてもラグタイムは観察されなかった。濃度が 2.5mg/mL のものは、ピーク後徐々に下降し、18％付近で平行となった。濃度が 12.5mg/mL のものでは、グラフはわずかずつ上昇した。考察：ラグタイムがないこと、ピーク後徐々に下降していることから、Arachidonic acid は ADP と同様に一次凝集を引き起こしているものと考えられる。濃度が 12.5mg/mL のものでは、高濃度の ADP を加えた場合と同様に、一次凝集だけでなく二次凝集も引き起こされ、グラフは上昇後、平行に安定するものと予想されたが、予想とはまったく違って、徐々に少しずつしか上昇しないような、他のグラフとは違った結果となった。これは、Arachidonic acid が、高濃度であるほど粘性が高くなる性質や、高濃度の Arachidonic acid による浸透圧の上昇で血小板がダメージを受けた結果が原因であると考えられる。２）血小板数の変化による凝集パターン ① ADP：5×10-4M 希釈前希釈後結果：ピークの値は、希釈前後では変化は見られない。グラフの立ち上がりは、希釈後は緩やかになっている。考察：ピークの値に変化が無いのは、ヘマトレーサーの 0％の設定の際に使う PRP がそれぞれの濃度のものであるためである。グラフの立ち上がりが、希釈後のものでは緩やかになっているのは、血小板の濃度が低くなることで、ADP と出会う確立が低くなることによるものだと考えられる。この実験においては、ADP の濃度が 5×10-5M のものを利用していれば、一時凝集のみが起こり、ピーク後すぐに下降するグラフが得られていたと思われる。 ② Collagen：100µg/mL 希釈前希釈後結果：ラグタイムは希釈前後で、65 秒から 90 秒に延長し、グラフの立ち上がりも緩やかになっている。考察：PAF を加えた場合と同様に、Collagen の濃度が低いことで、血小板と出会う確立が減少し、ラグタイムの延長や、グラフの傾きが緩やかになることの原因となったと考えられる。３）オリジナル実験：温度による血小板の凝集能力の変化 ① ADP：5×10-4M 通常氷中 42℃ 結果：氷中に置いたものは、グラフの立ち上がりに変化はないが、ピークは 46％に低下している。 42℃に置いたものは、グラフの立ち上がりが緩やかになり、ピークも 42％に低下した。考察：温度が上昇、または下降することにより、血小板が何らかのダメージを受け、ピークの低下や傾きの緩やかになった原因となったと考えられる。fibrinogen の変性温度は 56℃であるので、fibrinogen の変性が原因ではないと考えられる。 ② Collagen：100µg/mL 通常氷中 42℃ 結果：氷中に置いたものは、グラフの立ち上がりに変化は見られず、ピークの低下も僅かだった。 42℃に置いたものは、グラフがまったく異なったものとなり、高濃度 Arachidonic acid を加えた場合と似たグラフとなった。考察：氷中に置いたものにあまり変化は見られなかったが、ADP を加える実験ではピークの低下が観察されたことから、二次凝集に関係する機構は一次凝集よりも、氷中程度の低温ではダメージを受けにくいことが予想される。一方、42℃に置いたものは、明らかに異なったグラフの形状を示しており、二次凝集に関係する機構は、高温でダメージを受けやすいことが予想される。 ◇ レポート・抗凝固剤の種類とその作用・EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid）：二価の金属イオンをキレートする作用があり、血液が凝固するのに必要なカルシウムイオンをキレートすることで凝固を阻害する。血液 1mL 当たり約 1mg 用いる。血小板塊状形成により、血小板数が見かけ上低く算定され、偽血小板減少がみられることがある。・ヘパリン(Heparin）：アンチトロンビンⅢ（ATⅢ）の補因子として働き、ATⅢの持つ抗トロンビン作用などを促進することにより抗凝固作用を示す。抗凝固剤として検査に用いる場合は血液 1mL に対し 0.01mg から 0.1mg の微量で効果を示す。・クエン酸ナトリウム（Sodium citrate）：チトラートとも呼ばれ、血液が凝固するのに不可欠なカルシウムイオンと結合することにより抗凝固作用を示す。3.8％、3.13％、3.2％などがあるが一般に 3.8％のものがよく用いられている。血液凝固検査には溶液 1 容量に対し血液 9 容量を加え、血液沈降速度検査には溶液 1 容量に対し血液 4 容量を加えて用いる。血球容積が変化するので血算関連には用いない。・フッ化ナトリウム（Sodium fluoride）：血液が凝固するのに不可欠なカルシウムイオンと結合することにより抗凝固作用を示す。また、解糖系酵素などの種々の酵素活性を阻害する働きを持つため、主にグルコースを測定する際に用いられる。血液 1mL に対し 5∼10mg 加える。・ACD（acid citrate dextrose solution）：溶液中のクエン酸がカルシウムと結合することにより抗凝固作用を示すが、デキストロースにより赤血球が良好な状態で保存されるため、主に輸血用血液保存に用いられる。血液 200ml に対し 30∼50ml 加える。・血小板凝集計の原理自己血漿（乏血小板血漿 PPP）をコントロールとし、クエン酸ナトリウム 1：9 採血後、遠沈して得た富血小板血漿（PRP）に対し、ADP、エピネフリン、リストセチンなどの血小板凝集惹起剤を添加し、経時的に凝集の度合いを光の透過率、散乱度ないし比朧度の変化としてとらえ記録する。・各惹起物による血小板凝集の機序血小板の内皮下組織への粘着から血小板から凝集へと進むとき、濃染顆粒から ADP やセロトニンが放出され、凝集が促進される。しかし、セロトニンや低濃度 ADP による刺激は血小板内でのカルシウムイオンの遊離作用が弱いため、可逆的な凝集（一次凝集）しかおこさない。高濃度の ADP や PAF、低濃度の Collagen や Thrombin は、血小板内で、DTS からの Arachidonic acid の遊離をひきおこし、これが代謝されてできる TXA２が遊出し、血小板レセプターに結合することで、放出反応と非可逆的凝集（二次凝集）を惹起する。また、高濃度の Collagen や Thrombin はアラキドン酸代謝を経ずに、直接放出反応をおこす。・凝集能の異常による病態について・先天性血小板機能異常症血小板無力症では ADP、コラーゲン、エピネフリンともに凝集を欠き、ベルナール・スーリエ症候群ではリストセチンおよびウシフィブリノゲン凝集を欠如し、フォン・ウィルブランド病ではリストセチン凝集欠如ないし低下が特徴的である。・後天性血小板機能異常症 ① 機能低下：尿毒症、異常蛋白血症、急性白血病、骨髄増殖性疾患、先天性心疾患、薬剤性など。 ② 機能亢進：動脈硬化症、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、糖尿病、高脂血症、高血圧症など。 ■ FgDP（FDP）の抗トロンビン活性に関する実験 ◇ 実習方法目的：試験管内にて FgDP（FDP）を作製し、これらの抗トロンビン活性をトロンビンによる凝固性から検討する。実験器具：三角フラスコ、恒温槽、試験管（同材質、同一の大きさのものを用いる）、ピペット類、ストップウォッチ、白金耳、等試薬：Plasminogen rich fibrinogen（bovine）、Thrombin（bovine）、 Urokinase、tAMCHA、Borate Saline Buffer 実験方法： Ⅰ．FgDP（FDP）の作製 ① 0.4％Plasminogen rich fibrinogen 40mL に、200IU/mL の Urokinase 10mL を三角フラスコ内で混和し、incubate time を 0、15、30、45、62、80 分と変化させる。各 incubate time 終了後、直ちに sample 500mL を 10％ tAMCHA 1mL を入れた試験管に加え、 Plasmin の反応を停止させる。 ② 各 incubate time による FgDP の作製は、Thrombin clotting time にて確認する。 FgDP 液（0.5mL）を 3 分間 preincubate し、Thrombin 20IU/mL（0.1mL）を加え、Thrombin clotting time を測定する。FgDP 作製のために行った incubate time と thrombin clotting time との関係をグラフにする。 Ⅱ．作製した FgDP を使って Thrombin 活性に対する抑制効果を検討する。 ① FgDP を Borate Saline Buffer にて希釈する。Thrombin 20IU/mL（0.1mL）を希釈した FgDP 液（0.5mL）に加え、37℃ 3 分間 preincubate する。さらに、0.4％ fibrinogen（0.2mL）を加え、Thrombin clotting time を測定する。 FgDP の希釈率と Thrombin clotting time との関係をグラフにする。 ◇ 結果 Ⅰ．FgDP 作製のために行った incubate time と Thrombin clotting time との関係 Thrombin clotting time [sec] 20.00 18.00 incubate 16.00 Thrombin clotting time[sec] time[min] 1 2 3 AV 12.00 0 9:43 10:20 9:55 9:73 10.00 15 11:14 9:55 10:11 10:27 30 11:92 12:28 - 12:10 4.00 45 16:73 16:26 - 16:50 2.00 62 14.00 8.00 6.00 0.00 0 10 20 30 incubate time [min] 40 50 80 over 3min Ⅱ．FgDP の Thrombin 活性に対する抑制効果 Thrombin clotting time [sec] 16.00 14.00 FgDP 希釈率 12.00 Thrombin clotting time[sec] 1 2 3 AV 0 7:60 8:57 - 8:09 6.00 1/8 8:65 8:87 - 8:76 4.00 1/4 10:09 10:36 - 1023 2.00 1/2 15:67 14:60 - 15:14 10.00 8.00 1 0.00 0 0.2 0.4 over 3min 0.6 FgDPの濃度 ◇ 考察 Ⅰの実験における clot の生成の減少は、フリブリノゲンの減少によるものと考えられる。clot の減少はフィブリノゲンが FgDP に変化したため減少したことによると考えられる。60 分、80 分のような、かなりの経過時間を置いたものは、プラスミンによってフィブリノゲンは FgDP にほとんど変化していることが考えられる。 Ⅱの実験では、Ⅰの実験で 3 分以内に clot のできなかった 80 分のものを使用した。つまり FgDP がかなり大量にできたと考えられるものを希釈し、濃度別に Thrombin clotting time を計測した。結果、濃度が上昇すると Thrombin clotting time は延長、希釈していないものは 3 分以内に clot はできなかった。よって、FgDP に抗トロンビン活性があったことがわかる。 3 分以後には、希釈していないものにも clot は見られたものの、clot の弾性は 1/2 のものより弱かった。・実験結果より、FgDP（FDP）の生物学的特性について考察する。FgDP（FDP）が生体血中で検出される場合の病態について考察する。 FgDP（FDP）の生物学的特性生体内では、血漿中に抗 Plasmin 因子が存在するため、 fibrinogen の分解は起こりにくい。しかし、この実験では血漿ではなく、fibrinogen そのものを用いているため、Plasmin 活性が抑えられず、線溶系亢進の状態となっている。また、FgDP は fibrin の生成を抑えるため、線溶亢進に拍車をかけていることになる。しかし、凝固が亢進しているときには、過剰な凝固を抑える働きをする。このように、FgDP は、止血機構において正と負の調節を行っていると思われる。 FgDP が生体血中で検出される場合の病態 FgDP が見られるということは、凝固亢進や血栓形成に対処するために線溶系が亢進したことが理由として考えられる。そのため、出血傾向にある。臨床的には血中の FgDP 増加は DIC の診断において、尿中の増加は腎疾患の診断上、重視されている。 DIC では凝固活性が高まる結果、全身の微小循環系に血栓形成が見られる。広範な血栓形成がおこると、血小板や凝固因子が大量に消費され、二次的に線溶系の活性化が見られる。そのために、血中の FgDP 量が増加するのである。・止血機構全体のレポートとして、止血機構とは何かを考察する。止血機構：止血機構には２種類ある。１つは血液が血管外へ出ないようにしておく静止的機構であり、他は血管損傷時の出血に対する積極的な、動的止血機構という。これらに関与する共通の基本要因としては、①血管の収縮、②血小板の粘着・凝集、③血液凝固、④線溶、⑤血行力学的因子、⑥血管周囲の結合識の状態、があり、これらの要因は密接に関連し合って、血管の統合性を保っている。 ■ 参考文献・標準生理学第５版本郷利憲・廣重力株式会社医学書院 2003 ・南山堂医学大辞典第１８版鈴木肇株式会社南山堂 1998 ・最新医学大辞典第２版後藤稠株式会社医歯薬出版 1997