通性CAM植物アイスプラントのプラスチド包膜リン酸輸送体の

通性CAM植物アイスプラントの
プラスチド包膜リン酸輸送体の
機能解析
理工学研究科分子生物学専攻
指導教官：大西純一
野明千雪
4種類のプラスチド型リン酸輸送体
Plastid
CO2
カルビン回路
ペントース
リン酸
Cytosol
ショ糖
TPT
トリオース
リン酸
無機リン酸
エリトロース
４-リン酸
ホスホエノール
ピルビン酸
芳香族アミノ酸
合成
脂肪酸合成
キシルロース
５-リン酸
酸化的
ペントース
リン酸経路
NADH
無機リン酸
デンプン
解糖系
PPT
ホスホエノール
ピルビン酸
XPT
キシルロース
５-リン酸
トリオース
リン酸
グルコース
６-リン酸
トリオース
リン酸
トリオース
リン酸
GPT
グルコース
６-リン酸
ショ糖
高等植物のプラスチド型
リン酸輸送体ファミリーの
基質特異性
基質特異性
略称
主な発現
Pi
TP
PEP
G6P
X5P
TPT
Triose phosphate (TP)
/phosphate translocator
○
○
×
×
-
光合成組織
PPT
Phosphoenolpyruvate (PEP)
/phosphate translocator
○
○
○
×
-
組織全般
GPT
Glucose 6-phosphate (G6P)
/phosphate translocator
○
○
△
○
×
非光合成
組織
XPT
Xylulose 5-phosphate (X5P)
/phosphate translocator
○
○
△
×
○
組織全般
アイスプラントの
プラスチド型リン酸cDNAと
CAM化に伴う発現量変化
Subfamily
Ice plant cDNA
CAM化に伴う
葉組織での発現量変化
TPT
McTPT1
変化なし
PPT
McPPT1
上昇
GPT
McGPT1
McGPT2
顕著に上昇
XPT
-
-
組替えタンパク質の作成
4種類のアイスプラントリン酸輸送体（McPT）のクローニング
McPTのcDNA断片をPCR法で増幅し酵母発現用vector
pYES2に組込み、酵母細胞INVSc1を形質転換
→ TPT1・GPT1・GPT2 ○
PPT1 ×
3種類の形質転換体で目的タンパク質の誘導発現
形質転換体の細胞を破砕して細胞粗抽出液を調製
liposome再構成
核
発現ベクター
脂質
タンパク質誘導発現
輸送体の基質
sonication
酵母質転換体
細胞を破砕して
粗膜画分抽出
Freeze-thaw法
Liposome内に交換基質を封入
（内部基質）
目的タンパク質
目的タンパクを人工膜に組込む
取込み活性測定方法
32P
32P
32P
32P
25℃
インキュベーション
32P
32P
一定時間経過後
阻害剤を添加して
取込み反応を停止
取込み反応
外部基質として
[32P]無機リン酸を加える
32P
32P
32P
取込まれた
32P量を測定
32P
32P
イオン交換カラムに通し
取込まれなかった[32P]を除去
阻害剤
無機リン酸の交換輸送活性
7
7
Uptake of phosphate
( nmol/mg protein)
6
6
INVSc1-pYES2
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
0
5
10
15
20
Incubation time (min)
25
INVSc1-pGPT1
0
30
5
10
15
20
25
30
□：KCl
(control)
7
7
INVSc1-pGPT2
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
0
5
10
15
INVSc1-pTPT1
6
20
25
30
0
5
10
15
◆：Pi
20
25
30
McTPT1とMcGPT2の基質特異性
McTPT1
(%)
McGPT2
(%)
30
29
(100)
(100)
Triose Phosphate (DHAP)
75
78
Phosphoenolpyruvate (PEP)
7
27
Glucose 6-phosphate (G6P)
51
96
Internal substrate
KCl (control)
Phosphate (KH2PO4)
McTPT1の無機リン酸輸送の速度論的解析
8
Eadie-Hofstee plot
v (nmol/mg protein/min)
phosphate uptake rate
(nmol/mg protein/min)
4
3
2
1
6
4
2
0
0
0
0
0.4
0.8
1.2
2
4
6
8
10
v/s (nmol/mg protein/min/mM)
phosphate (mM)
Apparent Km
(phosphate)
Ice plant TPT1
0.8±0.1 mM
Spinach chloroplasts TPT
(Flugge et al. 1989)
1.0±0.3 mM
8
20
6
15
v (nmol/mg protein/min)
phosophate uptake rate
(nmol/mg protein/min)
McGPT2の無機リン酸輸送の速度論的解析
4
2
Eadie-Hofstee plot
10
5
0
0
0
0
0.4
0.8
2
4
6
8
10
v/[s] (nmol/mg/protein/min/mM)
12
1.2
phosphate (mM)
Apparent Km
(phosphate)
Ice plant GPT2
1.5±0.1 mM
Pea root plastids GPT
(Kammerer et al. 1998)
1.1±0.1 mM
アイスプラントの
プラスチド型リン酸cDNAと
CAM化に伴う発現量変化
Subfamily
Ice plant cDNA
CAM化に伴う
葉組織での発現量変化
TPT
McTPT1
変化なし
PPT
McPPT1
上昇
GPT
McGPT1
McGPT2
顕著に上昇
XPT
-
-
アイスプラント葉組織から抽出した
再構成膜タンパク質の輸送活性
7
7
Uptake of phosphate (nmol/mg protein)
C3型
CAM型
6
6
5
5
4
4
■：Pi
3
3
▲：TP
2
2
○：G6P
1
1
●：PEP
0
0
0
5
10
Incubation time (min)
15
◆：control
0
5
10
15
まとめ
・アイスプラントのTPT1およびGPT2はリン酸輸送機能
を持っており、アミノ酸配列の相同性から予想され
た基質特異性を持つことが確認された。
・無機リン酸輸送のKm値はTPT1＝0.8±0.1 mM、
GPT2＝1.5±0.1 mMであることが示された。
・葉組織の膜タンパク質を再構成した系で、発現の変
化に対応する輸送活性の変化が確認できるかもれ
ない。
謝辞
谷口光隆先生
（名古屋大学生命農学研究科）
細胞生化学研究室の皆様
本研究をするにあたりお世話になりました、
これらの方々に感謝いたします。

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