〒 東京都品川区東品川 天王洲セントラルタワー Ｆ 140-0002 2-2-24 4 Tel: (03) 5796-7330 Fax: (03) 5796-7335 e-mail: [email protected] GenElute™ Plasmid Midiprep Kit 製品番号 PLD35、PLD140 使用説明書番号 MB-945 TECHNICAL BULLETIN（ （使用説明書） 使用説明書） 製品概要 は、組換え E. coli 培 養液からプラスミド を簡単かつ迅速に抽出できる低 コストのキットです。シリカ結合法と簡便なスピンカラム法 を組み合わせた方法により、20～40 mL の Luria Broth （LB）培地で培養した菌体から最大 300 µg のプラスミド DNA を約 45 分で回収することができます。ただし、実際 の収量および最適な培養液使用量はプラスミドや培地の 種類によって異なります（「手順」のステップ 1 を参照）。 一晩培養した組換え E. coli 培養液を遠心分離して菌体を 回収し、改変アルカリ SDS 法で溶解した後、高濃度の塩 の存在下で DNA をシリカに吸着させます 。 GenElute™ Plasmid Midiprep Kit DNA 次いで遠心-洗浄ステップで夾雑物を除去します。最後に、 カラムに結合している DNA を水または Tris-EDTA バッフ ァーで溶出します。 回収されるプラスミド DNA は主としてスーパーコイル状で す。アガロースゲル電気泳動においてゲノム DNA や RNA の混入は見られません。抽出した DNA は制限酵素 処理やライゲーション、シーケンシング、PCR 、トランスフ ェクションといった用途にそのまま使用できます。 † 1,2 キットに キットに含まれている試薬 まれている試薬 製品番号 Resuspension Solution RNase A Solution Lysis Solution Neutralization/Binding Solution Column Preparation Solution Optional Wash Solution Wash Solution Concentrate Elution Solution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA GenElute Midiprep Binding Columns in Tubes Collection Tubes, 15 mL capacity R1149 R6148 L1912 N5158 C2112 W4011 W3886 E5650 ） G6540 C4228 PLD35 35 回分 100 mL 0.6 mL 100 mL 65 mL 225 mL 80 mL 25 mL 45 mL 35 35 個 個 キット以外 キット以外にご 以外にご用意 にご用意いただく 用意いただく試薬 いただく試薬および 試薬および器具 および器具 注意事項と 注意事項と免責事項 • GenElute Plasmid Midiprep Kit • • • エタノール（95～100%）（製品番号 E7148、E7023、 Z45,983-6） スイングバケットローター付き遠心分離機、3,000～ 5,000 x g で使用できるもの 遠心分離機、12,000～15,000 x g で使用できるもの オークリッジ遠心チューブ（製品番号 T2918） PLD140 140 回分 200 mL 1.7 mL 200 mL 250 mL 800 mL 300 mL 110 mL 180 mL 4 x 35 4 x 35 個 個 は試験研究用のみを目 的として販売されています。医薬品、家庭用その他試験研 究以外の用途には使用できません。 Neutralization/Binding Solution および Optional Wash Solution は有害物質であるグアニジンを含みます。 Column Preparation Solution は刺激性を有します。これ らの溶液や本キットに含まれる試薬を取り扱う際は、手袋、 安全眼鏡、適切な保護服を着用してください。化学物質安 全データシート（MSDS）をご覧ください。 2 調製 試薬類をそれぞれよく 試薬類をそれぞれよく混合 をそれぞれよく混合します 混合します。 します。 沈殿の有無を確 1. 2. 認します。保存中に試薬に沈殿が生じた場合は、沈 殿が溶解するまで 55～65 °C で加温します。試薬は 室温に戻してから使用します。 Resuspension Solution の調製。 調製。 RNase A 溶液 のチューブを短時間遠心分離します。最初の使用の 前に、500 µL（35 回用）または 1 mL（140 回用）の RNase A 溶液を Resuspension Solution の全量に 加えます。 最初の使用の前に、 の全量を （ 回用）ま （ 回用）の ～ エタノールで たは 希釈します。希釈後の はエタノール の蒸発を防ぐため、使用後は密栓してください。 3. Wash Solution の調製。 Wash 調製。 Solution Concentrate 100 mL 35 440 mL 140 95 100% Wash Solution 保存 室温で保存してください。保存中に試薬に沈殿が生じた場 合は、沈殿が溶解するまで 55～65 °C で加温します。試 薬は室温に戻してから使用します。 手順 注： 遠心速度はすべて 遠心速度はすべて g 単位で 単位で記載されています 記載されています。 されています。g から rpm への換算 への換算は 換算は表 1 を参照してください 参照してください。 してください。お手元の遠心分離機/ ローターで所定の g が得られない場合は、実施可能な最大の g で遠心分離を行い、その g に合わせて遠心時間を延長してく ださい。遠心分離はカラムからすべての液体が排出されるまで行います。ステップ 5～9 にはスイングバケットローター付き遠 心分離機が必要です。 表 1. 一般的な 一般的なローターでの ローターでの遠心力 での遠心力（ 遠心力（単位は 単位は g）から rpm への換算表 への換算表 遠心分離機 Beckman 製 Allegra 6 Allegra 21(R) Allegra 64 TJ-25 Beckman ローター IEC 旧型機の 製 MP4(R) PR-7000M B22M Sorvall 製 ローター タイプ* 半径 （cm） GH-3.8 S4180 F0485 F0685 TS-5.1-500 TA-10-250 JA-10 JA-14 JA-20 JS-13 SB SB FA FA SB FA FA FA FA FA 20.4 16.1 9.0 9.7 19.0 13.7 15.8 13.7 10.8 14.0 3,631 4,081 **N/A N/A 3,756 N/A N/A N/A N/A N/A 4,688 5,268 N/A N/A 4,849 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 12,211 11,764 N/A 9,901 9,215 9,896 11,146 9,790 215 224 966 877 SB SB SB FA 13.0 35.9 24.5 12.6 4,537 2,733 3,310 N/A 5,857 3,528 4,274 N/A N/A N/A N/A 10,318 HB-4 HB-6 HS-4 SH-80 GSA SA-300 SA-600 SE-12 SL-50T SS-34 SB SB SB SB FA FA FA FA FA FA 14.7 14.6 17.2 10.1 14.5 9.7 12.9 9.3 10.7 10.7 4,277 4,284 3.948 5,142 N/A N/A N/A N/A N/A N/A 5,522 5,531 5,097 6,639 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 9,604 11,784 10,179 11,997 11,203 11,203 ＝スイングバケット型、FA＝固定アングル型 ＝不適 *SB **N/A に相 3,000 x g rpm 当する に相 5,000 x g rpm 当する 15,000 x g に 相当する 相当する rpm 3 一般的な遠心分離機およびローターについては、上表に示された rpm 単位の遠心速度を参照してください。この表にないロ ーターについて正確な rpm を計算するには次式を用います。 RPM = RCF / 1.118 × 10 −5 r ＝必要な重力加速度（相対遠心力）（単位は g）；r＝ローターの半径（cm）；RPM＝必要な g を得るための 1 分間あたり の回転数 すべてのステップは室温で実施します。 れていることを確認してください。再懸濁が不十分だと 収量が減少します。 菌体の回収 一晩培養した組換え E. coli 培養液 5～ 1. 菌体の 40 mL を遠心して菌体をペレット化します。最適な使 3. 細胞の 細胞の溶解 1.2 mL の Lysis Solution を加えて懸濁 用培養液量は培養液の菌体密度によって異なります。 液中の菌体を溶解します。ただちにチューブを静かに 収量を最大とするには下記の注意事項に従ってくださ 転倒混和して、混合物が透明で粘稠になるまで繰り い。適量の組換え E. coli 培養液をオークリッジ型遠 返します（6～8 回）。ボルテックスは ボルテックスは行わないでくださ 心チューブ（15,000 x g 以上で使用できるもの）に移 い。乱暴に混合するとゲノム DNA が切断されるため、 し、3,000～5,000 x g で 5～10 分間遠心します。す 抽出したプラスミド DNA に染色体 DNA が混入します。 べての培地上清を除去して捨てます。 溶解処理は 溶解処理は 5 分以上行わないでください 分以上行わないでください。長時間の アルカリ溶解処理はスーパーコイル状プラスミド DNA 注： 最良の結果を得るには、新鮮な画線培養プレー を不可逆的に変性させてしまうため、その後ほとんど トから得たシングルコロニーから培養を始めてください。 の用途に使用できなくなる可能性があります。 適切な抗生物質を含む Luria broth（LB）を用い、十分 に振盪（250～300 rpm）しながら 37 °C で一晩培養し 4. 中和 1.6 mL の Neutralization/Binding Solution を ます。一晩培養した培養液の 600 nm における吸光 加えて菌体の破片を沈殿させます。 チューブを静か 度を測定します。OD x 培養液量（mL）の値を cell に 4～6 回転倒混和します。15,000 x g 以上で 10～ 15 分間遠心し、菌体破片をペレット化します。菌体破 mass（菌体量）として、cell mass が約 80 に相当する 培養液を使用します。培養液使用量を算出するには、 片、タンパク質、脂質、SDS、染色体 DNA は白濁した 一晩培養した培養液の 600 nm における吸光度で、 粘稠な沈殿となって溶液から分けられます。遠心後の 所定の cell mass 値（ここでは 80）を割り算します。例 上清に多量の浮遊物が存在する場合は、ステップ 5 えば、非常に密度の高い組換え E. coli 培養液で に進む前に上清を再度遠心してください。 OD が約 4.0 だとしたら、使用する培養液量はわず 5. DNA 結合カラム 結合カラムの カラムの準備 GenElute Midiprep DNA か 20 mL です。これよりも密度の低い培養液で Binding Column を 15 mL 回収用チューブに差し込 OD が約 2.0 だとしたら、使用量は 40 mL です。 みます。 低コピー数のプラスミドの場合は 2 倍量の培養液を 各カラムに 3 mL の Column Preparation Solution を 使用します（総 cell mass は 160）。総 cell mass は、 加え、スイングバケットローターを用いて 3,000～ 高コピー数プラスミドの場合で 100 以下、低コピー数 5,000 x g で 1～2 分間遠心します。カラム通過液を プラスミドの場合で 200 以下としてください。cell 捨てます。 mass が多すぎると収量が減少します。栄養豊富な培 地で培養した場合はさらに使用量を減らす必要があ 注： Column Preparation Solution はフィルターへの るかもしれません。さらに詳しい情報については DNA 結合量を最大化し、より安定した収量が得られ Sigma のテクニカルサービス部門までお問い合わせ るようにするものです。このカラム準備ステップは、ス ください。 テップ 4 に進む前（またはステップ 4 の間）に行ってお くと便利です。 2. 菌体の 菌体の再懸濁 最初の使用の前に、適切な量の RNase A 溶液を Resuspension Solution に必ず加 6. 清澄化 清澄化された されたライセート ライセートの された ライセート のロード ステップ 4 で得られ えてください。菌体ペレットに 1.2 mL の た清澄化されたライセートを、 15 mL 回収用チューブ Resuspension Solution を加え、ピペッティングにより にセットした準備済みカラムに移し、スイングバケット 完全に再懸濁します。完全に均一となるまで再懸濁さ ローターを用いて 3,000～5,000 x g で 1～2 分間遠 心します。カラム通過液を捨てます。 RCF 600 600 600 4 7. オプションの オプションの洗浄（ 洗浄（endA+株を使用する 使用する場合 する場合のみ 場合のみ実 のみ実 施） 2.0 mL の Optional Wash Solution をカラムに加 えます。スイングバケットローターを用いて 3,000～ 5,000 x g で 2 分間遠心します。カラム通過液を捨て ます。 注： HB101、JM101、NM シリーズ、PR シリーズなど、 野生型の endA 遺伝子を保有する菌株を使用する場 合、抽出したプラスミド DNA にヌクレアーゼが混入す ることを防ぐため、このオプションの洗浄ステップが必 要です。 カラムの カラムの洗浄 最初の使用の前に、Wash Solution Concentrate にエタノールを必ず加えてください。3 mL の希釈済み Wash Solution をカラムに加えます。 スイングバケットローターを用いて 3,000～5,000 x g で 5 分間遠心します。このカラム洗浄ステップではカ ラム中に残存する塩やその他の夾雑物を除去します。 ステップ 9 に進む前に、カラムから Wash Solution が 完全に除去されたことを確認してください。 DNA の溶出 カラムを別の 15 mL 回収用チューブに 移します。1 mL の Elution Solution または分子生物 学グレード水をカラムに加えます。DNA シーケンシン グやその他の酵素処理用には、溶出に水または 5 mM Tris-HCl（pH 8.0）を使用します。スイングバケッ トローターを用いて 3,000～5,000 x g で 3～5 分間 遠心します。溶出液にはプラスミド DNA が含まれて おり、ただちに使用するか、または－20 °C で保存す ることができます。 + 8. 9. 注： 特に最大量の培養液からスタートした場合、遠心 で回収される溶出液の量が 0.8 mL 未満となることが あります。その場合でもプラスミド DNA の収量に悪影 響はありません。より濃度の高い DNA 溶液を得るに は、溶出液の量を最小 500 µL まで減らすことができ ます。500 µL で溶出する際に収率を最大とするには、 Elution Solution をあらかじめ 65 °C に加温しておき、 そのまま結合フィルターに加えます。結合フィルターが 温かい Elution Solution に浸った状態で 10 分間静 置してから遠心します。温かい Elution Solution によ る処理は収率を向上させますが、プラスミド DNA の 総収量は本来の 1 mL で溶出させる場合よりは少なく なる可能性があります。 結果 プラスミド DNA の収率および純度は分光分析で測定でき ます。260 nm と 280 nm の吸光度比（A /A ）は 1.7～ 1.9 が適正な値です。DNA のサイズおよび品質はアガロ ースゲル電気泳動またはパルスフィールド電気泳動で測 定できます。 260 280 5 トラブルシューティングガイド 問題 原因 対策 プラスミド DNA の 結合カラムを固定アングル ステップ 5～9 では液体が結合カラムを効率よく通過するよう、スイングバ 収率が低い ローターで遠心した、または ケットローターを用いて 3,000～5,000 x g で遠心してください。rpm 単位 遠心時の g が不足だった による実際の遠心速度はローターの大きさによって異なります（「手順」の 冒頭部を参照してください）。 Wash Solution が濃すぎる Wash Solution Concentrate が規定量のエタノールで希釈されているこ とを確認してください。蒸発を防ぐため、使用するごとに容器のフタをきち んと閉めてください。 培養液が古すぎる 凍結保存菌株を新しいプレート培地に画線してシングルコロニーを拾い、 新しい培養液を準備してください。 菌体使用量が多すぎる（ま OD を測定して菌体密度を確認してください。使用する培養液量を算出 たは少なすぎる） するには、一晩培養した培養液の 600 nm における吸光度で所期の cell mass 値（高コピー数プラスミドで 80、低コピー数プラスミドで 160）を割り 算します。 プラスミドの複製が少ない 適切な培地を用いて最適な条件で培養したかどうかを確認してください。 抗生物質の活性が不十分 新鮮な抗生物質溶液を添加して一晩培養します。大半の抗生物質溶液 である は光に弱く、2～8 °C で長期間保存すると分解します。 アルカリ溶解処理が長すぎ 溶解処理の時間（ステップ 3）を 3 分間に短縮するか、または細胞懸濁液 る が透明で粘稠な液体となるまでに留めてください。 菌体破片の沈殿が不完全 使用する培養液量を減らしてください。 である 溶解が不十分である 使用する培養液量を減らすか、または溶解（ステップ 3）の際、状態を目 視で確認しながら溶解処理時間を延長してください。cell mass（cell mass＝OD x 培養液量（mL））は 100 以下としてください。最良の結果 を得るには、総 cell mass は、高コピー数プラスミドで 80、低コピー数プラ スミドで 160 としてください。 精製した DNA の Wash Solution が不純なエ 250～300 nm におけるエタノールの吸光度を確認してください。吸光度 吸光度がプラスミ タノールで希釈されている の高いエタノールは使用しないでください。微量の不純物が洗浄後の結 ドの正確な量を反 合カラムに残存することがあります。すると、不純物が溶出液に混入して 映していない 最終産物の吸光度に影響するかもしれません。 （A /A 比が高 プラスミド DNA に RNA が 最初の使用前に Resuspension Solution に RNase A 溶液を加えたか すぎるか低すぎ 混入している（RNase A 処 どうか確認してください。RNase A 溶液は高温（65 °C 以上）または長期 る） 理が不十分である） 保存（室温で 6 か月以上）によって失活します。 プラスミド DNA に染色体 24 時間以上培養した培養液や細胞死が起こり始めた培養液は使用しな DNA が混入している いでください。溶解処理（ステップ 3）や中和処理（ステップ 4）の間、細胞 を含む溶液をボルテックスにかけたり激しく振盪したりしないでください。 シリカ微粒子によるバックグ DNA サンプルを最高速度で 1 分間遠心し、上清を用いて吸光度を再測 ランド値が高い 定してください。 カラムへのロード量が多す 使用する培養液量を減らしてください。OD から算出する総 cell mass ぎたために精製が不十分で が 100 を超えないようにしてください（cell mass＝OD x 培養液量 ある （mL））。 最良の結果を得るには cell mass を 80 としてください。 600 600 260 280 600 600 6 トラブルシューティングガイド（ トラブルシューティングガイド（前頁からの 前頁からの続 からの続き） 問題 原因 対策 電気泳動でスーパ プラスミド DNA の一部が ーコイル状プラスミ 不可逆的に変性している ドの先に別のバン ドがある 精製プラスミド 精製が不十分である DNA を用いた酵 素反応が不良であ る DNA 濃度が低すぎる 株から DNA を抽出 した プラスミド DNA を含む最終 の溶出液に多量の塩が含 まれている 希釈した Wash Solution に由来するエタノールがカ ラムに残存している endA+ 溶解処理（ステップ 3）は 5 分以上行わないでください。電気泳動におい て、（ニックの入った環状の）二本鎖プラスミド DNA はスーパーコイル状 DNA よりも遅く泳動します。 溶液に含まれる塩類は沈殿することがあります。その場合は沈殿が溶解 するまで 65 °C で加熱してください。溶液は室温に戻してから使用しま す。 DNA をエタノールで沈殿させてから、少量の水または Elution Solution に DNA を再溶解してください。 または、 または、 シリカ結合 DNA の溶出に用いる Elution Solution の量を減らしてくださ い。Elution Solution の量を減らすと全体の収量は減少することがありま すので注意してください。 endA 株から DNA を抽出する際はオプションの洗浄（ステップ 7）を実施 する必要があります。 DNA をエタノールで沈殿させてください。ペレットを乾燥します。その後、 水または Elution Solution に再溶解します。Elution Solution には EDTA が含まれていますが、EDTA は多くの酵素の重要な補因子である二価陽 イオン（Mg など）をキレートする点に注意してください。 洗浄（ステップ 8）の後、残存する Wash Solution を除去するため、カラム を 1 分間再遠心してください。 + 2+ 参考文献 1. Birnboim, H.C., and Doly, J., A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., 7, 1513-1522 (1979). 2. Vogelstein, B., and Gillespie, D., Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 615-619 (1979). 関連製品 Water, Molecular Biology Reagent LB Broth, EZMix™ LB Agar, EZMix™ Terrific Broth, EZMix™ Precast Agarose Gels, 1.0%, 8 well TAE Buffer (10X) TBE Buffer (10X) † PCR 製品番号 W4502 L7658 L7533 T9179 P5472 T9650 T4415 関連製品 製品番号 Gel Loading Solution DirectLoad™ Wide Range DNA Marker Ethidium bromide, aqueous, 10 mg/mL GenElute™ Plasmid Maxiprep Kits G2526 D7058 E1510 PLX15 PLX50 PLN10 PLN70 PLN350 GenElute™ Plasmid Miniprep Kits プロセスは Hoffman-LaRoche, Inc.が保有する特許で保護されています。 JHK/FC/MAM 9/02 Sigma ブランド製品は Sigma-Aldrich, Inc.を通じて販売されています。 は同社製品がこの文書およびその他の Sigma-Aldrich 発行文書に含まれる情報に合致していることを保証します。 お客様の個別の用途と製品の適合性についてはお客様にてご判断ください。収載の品目、製品情報、価格などは予告なく変更される場合がございます。 納品伝票または同梱の内容明細書の裏面をご覧ください。 Sigma-Aldrich, Inc.
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